方法文章

一种用于在神经退行性疾病临床前模型中研究关节运动学的精细运动任务

DOI：

10.3791/68128

⸱

2025年6月13日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychology, Arizona State University, 2Phoenix Country Day School, 3School of Biological and Health Systems Engineering, Arizona State University

本文内容

摘要

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本研究描述了一种利用机器学习检测啮齿类动物模型（包括TgF344-AD大鼠）运动功能障碍的精细运动行为测试方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

运动功能障碍是神经退行性疾病（如阿尔茨海默病（AD）及相关痴呆症）中一个关键但常被低估的组成部分。最新研究表明，涉及精细运动行为、视觉空间能力及执行功能的人类任务在疾病早期检测中具有潜在应用价值。然而，目前对这些任务预测AD相关认知与功能衰退的具体机制仍知之甚少。本研究方法中，开发了一种精细运动任务——运动学运动能力任务（KINEMAT），利用免费的开源机器学习软件，旨在检测AD临床前模型中随疾病进展出现的运动能力变化，并与其他神经退行性疾病及正常衰老进行比较。本研究通过一项针对Fisher 344 CDF大鼠的初步实验，设计、测试并实施了该精细运动任务，验证了其概念可行性，其中部分大鼠经Harmaline诱导产生运动障碍，另一部分则为对照组。进一步在阿尔茨海默病大鼠模型（TgF344-AD）中进行的额外验证，进一步证明了该模型的可行性及任务的敏感性。实验中，大鼠被训练通过笼前部的小狭缝伸爪，从三个难度不同的碗中获取糖丸。糖丸获取情况按以下三类评分：成功（成功抓取并吃掉糖丸）、掉落（抓取后在收回过程中掉落）或失败（未获取到糖丸，或在尝试抓取时将糖丸碰出碗外）。对照组与Harmaline处理组大鼠在运动能力上表现出显著差异，表现为总伸爪次数减少及前爪姿态变异性增加。TgF344-AD大鼠同样表现出总伸爪次数减少，且在所有难度的碗中成功获取次数均降低。本研究验证了该任务作为啮齿类动物精细运动评估工具的有效性，未来有望用于研究正常衰老过程以及包括AD在内的神经退行性疾病的临床前模型，以追踪病理变化和症状随时间的发展。

引言

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研究表明，由于阿尔茨海默病（AD）或其他亚型（例如路易体痴呆）导致的痴呆患者存在运动功能受损。握力和步速可用于区分认知受损与未受损的老年人1,2，但未必能够有效区分不同类型的痴呆（即特异性较低）1,2。因此，仍需开发新的早期痴呆诊断工具，可能结合机器学习技术，以评估行为与疾病状态之间的复杂模式和关联3,4。动物模型对于研究神经退行性疾病的进展具有重要价值，有助于揭示疾病早期 onset、行为相关特征，并将机器学习整合到分析流程中，以区分疾病严重程度和临床表现5,6,7。

人类新的行为学方法已确定了一些涉及精细运动技能以及认知加工的任务，例如视空间能力和执行功能8,9,10。例如，一项功能性上肢任务可用于追踪神经退行性变的模式，并能够区分轻度认知障碍（MCI）与阿尔茨海默病（AD）。在此任务中，受试者使用勺子将生的芸豆（每次两颗）从中央起始杯转移到目标杯中。任务中用勺子拾取豆子的阶段与认知能力（特别是视空间记忆）的关联性，强于将豆子运送至目标杯的阶段11,12。当勺子进入杯子时，可能会扰动杯中的豆子，这意味着参与者的动作可能使任务难度增加。此外，随着试验的进行，起始杯中豆子数量减少，任务难度也随之增加（即用勺子拾取豆子所需时间延长）13。该任务已被证明与AD特异性病理（淀粉样蛋白沉积）9,14及神经退行性变（海马萎缩）10,15相关，提示其表现可能依赖于在疾病早期即受影响的神经回路和行为过程。已知运动的启动、计划、执行及运动校正由跨越大脑的多样化神经网络控制，包括位于大脑皮层的上运动神经元，其胞体与脊髓中的下运动神经元形成突触连接16。这些下运动神经元直接与肌肉在神经肌肉接头处进行通讯，以控制运动。上行传导束将来自外周的感觉信息传递至脊髓，而脑内的下行传导束则向肌肉传递关于如何运动及运动方向的信息17,18。 明确这些通路如何被AD病理选择性影响，对于理解疾病进展至关重要，尤其是因为包括3xTg-AD小鼠和TgF344-AD大鼠在内的遗传性动物模型已被用于研究AD相关基因对运动能力、协调性及其他运动障碍的影响19,20,21。通常，这些任务主要关注与全身运动相关的粗大运动障碍，但人类的运动缺陷表现更为多样，这在啮齿类动物中较难识别22。因此，需要开发新的任务，以弥合人类与动物模型之间的差距，从而捕捉这种变异性。

一个常与运动障碍和震颤相关的脑区是小脑23。小脑在精确和协调运动的调控中起着重要作用，它通过处理感觉信息，并经由下行通路提供反馈，以纠正和适应随意运动24,25。值得注意的是，阿尔茨海默病（AD）患者中已观察到小脑萎缩，但与海马等其他脑区不同，小脑中淀粉样蛋白沉积的增加并不与萎缩程度的加重相关26。尽管AD病理在小脑中的进展模式有所不同，但小脑与海马之间存在多突触的双向连接，这些连接在AD中可能受到破坏27,28,29。值得注意的是，小脑与海马之间存在功能连接，因为在小脑肿瘤切除术后已记录到记忆缺陷的发生30,31,32,33,34,35,36,37。在啮齿类动物中，小脑的干扰会导致海马位置细胞的异常38。这些在记忆、社交行为和运动控制方面的重叠性缺陷，突显了揭示认知衰退发生前运动通路潜在早期变化的重要性30,31,38,39。通过在早期AD研究中引入精细运动任务，我们或许能够重塑将AD仅仅视为认知障碍的传统观念，并将诊断重点转向那些可能预测疾病进展、且在认知受损与未受损老年人群之间更具区分度的早期运动变化。

为了理解精细运动行为如何反映大脑结构的变化，研究人员开发并测试了一种啮齿类动物版本的人类任务。该啮齿类动物任务被命名为KINEMAT（KINEmatic Motor Ability Task，运动能力运动学任务），与以往需要从基座或阶梯上取回单个颗粒物的抓取任务不同，也不同于因颗粒物在任务各阶段位置固定而导致评分方式较为简单的传统方法40,41,42,43,44,45,46,47,48。该精细运动抓取任务引入了新的评分方法、具有不同难度的凹槽装置以及自我干扰特性，以模拟人类对应任务，其中颗粒物的移动以及受试者随之调整策略的过程是实验设计的核心。本任务采用机器学习工具Social LEAP Estimates Animal Poses（SLEAP）和keypoint-MoSeq49,50，实现对精细运动能力和抓取行为的无偏倚、定量测量。尽管已有其他重要的计算模型被用于啮齿类动物的熟练抓取任务44,45,51，但keypoint-MoSeq能够消除噪声，从而精确量化运动和抓握姿态50。通过高性能机器视觉相机，研究人员在正常大鼠及使用Harmaline诱导运动障碍的大鼠中重建了任务表现和运动学习策略52。Harmaline可过度激活下橄榄核，并通过谷氨酸能攀爬纤维干扰小脑功能53,54。此外，还在一部分TgF344-AD大鼠中检测了其精细运动能力。因此，作为概念验证，预期该精细运动任务可在经Harmaline处理的大鼠和TgF344-AD大鼠中检测到相对于正常对照组可量化的功能损伤。本实验方案详细描述了精细运动任务的构建、动物的训练与测试，以及利用SLEAP和keypoint-MoSeq对抓取行为进行定量分析的方法。

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方案

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本文所述所有方法均已获得亚利桑那州立大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 腔室的设计与构建

  1. 准备透明亚克力板。盒子的设计图位于 https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask。将透明亚克力板切割成以下尺寸（所有板材厚度均为 1 cm）：
    1. 切割两块侧板：26 cm × 22 cm。
    2. 切割一块顶板：27 cm × 12 cm。
    3. 切割第一块底板：26 cm × 10 cm。
    4. 切割第二块底板：26 cm × 11 cm。
    5. 切割一块前面板：20 cm × 11 cm。
    6. 切割一块后面板：20 cm × 12 cm。
    7. 切割前面板上的插槽（140 mm × 12 mm）。将插槽居中放置，其下边缘与前面板底边对齐。
    8. 在侧板内侧边缘加工一条内凹槽：宽度 1 cm，用于使前面板能够稳固地滑入和滑出。
      注：如果不需要滑动功能，可将前面板永久粘接以简化组装。
    9. 在第二块底板上钻出等距分布的孔（直径 5 mm），以便掉落的颗粒能够穿过。孔按网格状排列，间距为 1 cm。
  2. 使用粘合剂组装实验腔体（图 1A）。
    注：应使用专为亚克力材料设计的高强度透明粘合剂。
    1. 侧板：沿底板边缘涂布连续的粘合剂线条。将侧板垂直放置并用力压紧。根据产品说明书要求让粘合剂充分固化。
    2. 后面板：在侧板和底板的后缘涂布粘合剂。将后面板定位并压紧固定。
    3. 顶板：在侧板和后面板的上边缘涂布粘合剂。将顶板定位并用力压紧。
    4. 前面板：小心地将前面板滑入侧板上的凹槽中，确保贴合紧密且滑动顺畅；或在前面板边缘涂布粘合剂，并将其固定在侧板、顶板和底板上。
      1. 测试前面板的移动情况，确认其与其他部分精确对齐。
  3. 设置照明
    1. 将红外（IR）光源置于测试腔体的对侧，朝向腔体照射。在腔体顶部覆盖一张白色卡纸，以将光线反射向下。
      注：照明对于准确追踪至关重要，所有录像应在暗室中使用红外光进行。
  4. 准备训练用碗。
    1. 使用 3D 打印机打印训练用碗，半径为 31 mm，延伸部分为 32 mm。STL 文件可在 https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask 获取（图 1B：上图）。
    2. 将训练用碗安装在腔体底部，正对插槽前方。使用支撑支架（如木块）将碗固定，使其上边缘大致位于大鼠在腔体内时的眼睛水平位置。
  5. 准备测试用碗（图 1B：中图和下图）。
    1. 使用提供的 STL 文件打印测试碗。提供两种不同的碗设计：“Plain-Less”和“Plinko”（https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask）。
      1. 检查其尺寸精度和耐用性（尺寸：深 50 mm × 宽 40 mm）。

2. 计算机与相机硬件

  1. 使用三脚架牢固地安装相机。
  2. 将相机置于距操作箱前方面板约 15–20 cm 的位置。
    1. 调节三脚架的高度和角度，使相机能够以等距的 45° 视角同时捕捉狭缝和训练/测试碗的图像。
      注意：确保相机的视野包含大鼠前爪及其完整伸展动作、狭缝以及训练或测试碗。如有必要，可测试不同角度和距离，以获得最佳可见度。
  3. 下载与相机配套的行为记录软件（https://www.teledynevisionsolutions.com/products/spinnaker-sdk），并打开该软件以使用相机记录行为。
    1. 使用以下相机设置：采集模式：连续，帧率：216 Hz，曝光模式：定时，自动曝光：关闭，曝光时间：4430 µs，增益自动：关闭，增益：16.85 dB，伽马：0.8。
    2. 录制设置如下：H264 文件类型，比特率为 500 万（5,000,000）。
    3. 若需录制 10 分钟，请输入 130,000 帧，并使用流模式进行保存。
      ​注意：建议使用专用计算机，配备至少 16 GB 内存和 1 TB 内置固态硬盘，用于数据存储。

啮齿类动物行为实验装置；迷宫示意图；限制装置、食物分配器；研究分析。
图1：精细运动任务示意图。（A）精细运动任务的示意图，其中大鼠通过狭缝伸爪以获取糖颗粒。伸爪动作被记录下来用于机器学习分析。实验中使用三个不同的碗：（左下）训练碗、（中下）普通/简易碗，以及（右下）带障碍物的宾果碗（障碍物以红色圆圈标出）。（B）每种碗的设计示意图，包括（上）训练碗、（中）普通/简易碗和（下）宾果碗。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 动物准备

  1. 将 Fisher 344 CDF 大鼠（雄性和雌性，>3 月龄）至少成对饲养于反转的明暗循环环境中，以便在动物最活跃时进行实验。
  2. 在开始适应性训练前 1 周称量所有啮齿类动物体重，并为体重超过 300 g 的个体提供约 30 g 食物，为体重 100–300 g 的个体提供约 15 g 食物，以维持其体重在正常体重的 90%。
    1. 每天称量大鼠体重，并据此调整食物量，每日减少 1–2 g 食物，直至动物体重达到正常体重的 90%。每日抓取操作也有助于使动物适应实验人员。
    2. 在整个适应性训练和测试期间持续执行此程序，当体重低于或超过目标值时，相应增减 ±0.5 g 食物量。
    3. 测试期间，在任务开始前称量动物体重，任务完成后立即将其放回笼中并提供规定量的食物。
      注意：若在 1–2 天内出现突然的体重下降（>15%），可能提示存在潜在健康问题，应咨询兽医。

4. 习惯化（2 天）

  1. 打开红外光源、相机和计算机。
  2. 将装有颗粒饲料的训练碗放置在开口槽处，确保碗的尖端略微伸入装置内部（初始约2厘米）。
  3. 将笼子转移至测试房间，让大鼠适应环境5分钟。
  4. 第1天：将成对饲养的大鼠放入实验腔体，允许其自由探索20分钟。测试结束后，在大鼠的饲养笼中放置3-5粒糖颗粒，使其熟悉颗粒饲料。
    ​注意：使用45 mg的颗粒大小可确保每次仅取回一粒。
  5. 每只大鼠使用后，用消毒湿巾清洁实验腔体。每天实验结束后，喷洒乙醇进行彻底消毒。
  6. 第2天：单独对啮齿类动物进行装置适应训练，方法同前（20分钟）。若动物表现出恐惧或回避装置前端及碗体的行为，应继续适应训练直至该行为消失。持续在饲养笼中给予3-5粒颗粒作为奖励。
    1. 为促进动物对碗体的熟悉和接近，可在适应过程中逐步将延长管向装置快门内推进，每次将管尖向动物方向移动0.5厘米，以方便其触及。
      注意：适应、测试和训练均应在同一地点、红光照明条件下进行，以消除新环境带来的干扰。

5. 成型（10 天）

  1. 打开红外光源、相机和计算机。
  2. 将笼子转移到实验室内，让大鼠适应环境 5 分钟。
  3. 使用训练碗，在延伸部分放置 1–5 粒糖丸；第一天将延伸部分完全置于装置内部。每次训练持续 10 分钟。塑形期间的记录为可选操作。
    注意：为了让啮齿类动物熟悉糖丸，重要的是先在装置内部提供少量糖丸，以减少其对碗中糖丸的回避行为。由于装置内的糖丸易于获取，动物很可能会在装置内进食，并随后识别出碗中的相同糖丸。应让动物逐渐习惯面向装置的正确方向，并适应接触训练碗。
  4. 在后续的训练日中，开始将训练碗的延伸部分从装置中逐步拉出。这将促使动物靠近装置前端的开口，并鼓励其与位于装置外侧附近的延伸部分进行互动。
    1. 该设计允许对糖丸进行精确定位。例如，可先将糖丸放置在靠近动物一侧的碗端，随后逐渐向远处移动，以促使动物伸出身体去获取糖丸。
  5. 当动物在仅用嘴接触的情况下也能更自如地从延伸部分边缘取食糖丸时，开始使用镊子递送糖丸，以促进伸展行为的发生。
    1. 用镊子夹住一粒糖丸，放置在装置外侧附近，使动物能够轻易触碰到镊子。一旦动物触碰，立即给予奖励，以强化进一步伸展的行为。
    2. 随着动物对触碰镊子越来越适应，可将镊子放置在离装置开口稍远的位置，促使动物进一步伸出身体去触碰或抓取糖丸。
      注意：需详细记录所有动物的行为表现，特别是对训练碗表现出恐惧或不伸展的个体。这些动物可能需要额外的塑形训练天数。
  6. 当动物连续且独立地伸展取食达到至少 3 天后（图 2A），转换至使用普通碗（Plain bowl），直至伸展行为稳定建立（即连续 3 天每天至少完成 10 次独立伸展动作）。
    1. 初次引入普通碗时，应尽可能多地在碗中装入糖丸，使动物能够从碗边看到内部的糖丸。
      注意：此阶段可能仍需使用镊子辅助诱导伸展行为。
  7. 每只大鼠实验结束后，使用消毒湿巾清洁实验舱。每日实验结束后，喷洒乙醇进行全面消毒。

6. 准备测试：

  1. 测试持续9天（图2A），每只啮齿类动物每个碗进行3次试验，每次10分钟的试验在连续的几天内进行。
    注意：建议在上午进行测试。
  2. 在每次测试当天，称量大鼠体重。称量完成后，将大鼠放回其饲养笼中静置30-60分钟，因为称重可能引起应激反应，从而抑制其抓取行为。
  3. 打开计算机并设置碗的位置。连接相机和光源。启动录像软件，并按照本方案第2节所述调整相机设置。
    注意：建议以每秒至少200帧（fps）的速度进行录制，以便完整捕捉所有前爪运动。
  4. 通过按下播放按钮，在录像软件中对准相机画面中的碗并进行可视化。将碗与装置对齐，并将相机置于与碗侧面呈45°角的位置。
    1. 移动相机，使其正对抓取动作，以便研究单个手指和手掌的运动，以及抓取过程中手掌相对于碗高度的变化。
    2. 将相机直接垂直于碗放置，以捕捉手臂和手部朝向及离开碗的运动，但无法清晰记录手指位置或抓握行为的细节。
      注意：尽管推荐使用45°角以捕捉x、y和z三个方向上的运动，但其他配置可能更有利于获取特定研究所需的信息。

7. 测试（9 天）

  1. 将大鼠放入实验室内适应环境 1 小时。
  2. 将第一个食盆放置在食盆支架上，并用牙科蜡固定。确保食盆前端与装置开口齐平且居中。
  3. 在 Spinview 软件中命名视频文件，文件名应包含大鼠的编号、录制日期和录制时间。
  4. 将大鼠放入实验装置中，盖上盖子，并在顶部放置白色卡纸以散射光线。
  5. 此时需再次检查摄像机角度，确保拍摄到合适的画面，若食盆未居中则进行调整。
  6. 向食盆中倒入正确数量的颗粒饲料，然后点击 开始录制。
    第 1–3 天 普通食盆：约 100 颗颗粒
    第 4–6 天 减量食盆：约 50 颗颗粒
    第 7–9 天 Plinko 食盆：约 50 颗颗粒
  7. 在整个测试过程中留在房间内，持续监测大鼠状态，记录其抓取表现和行为，并根据需要补充颗粒饲料以维持规定数量。
    1. 对于普通食盆：确保啮齿动物能够看到食盆边缘外的颗粒，并且始终可以获取颗粒（即在整个试验过程中随着颗粒减少及时补充，使颗粒呈层状分布）。
    2. 对于减量食盆：检查颗粒之间不相互堆叠，颗粒间留有一定空间，以便大鼠尝试抓取时颗粒能够散开。
    3. 对于 Plinko 食盆：确保在障碍物之间有足够的颗粒可供获取。
  8. 测试结束后将动物放回其饲养笼，并提供规定量的食物。每只大鼠测试结束后均需使用消毒湿巾清洁实验箱。
  9. 每天实验结束后，用乙醇喷洒整个实验箱进行消毒，为次日实验做准备。
    ​注意：若同时测试雄性和雌性啮齿动物，应平衡性别顺序，部分雌性与部分雄性在上午较早时间测试，另一部分在较晚时间测试，且在整个实验过程中保持测试顺序一致。

啮齿类动物训练过程示意图；达到训练标准及总抓取次数的图表。
图 2：执行精细运动任务的大鼠训练与测试。 （A）实验时间线。大鼠先适应装置两天，随后进行为期10天的塑形训练。之后，每只动物在三种不同的碗中分别进行为期三天的精细运动能力测试。随后，动物被注射哈马林（Harmaline），并在每种碗中再进行为期三天的重新测试。（B）大鼠（n = 6）在塑形训练期间经历了两种不同类型的碗（训练碗和普通碗），并在第5天更换碗的类型以促进抓取行为的改善。在10天的塑形过程中，达到标准的表现有显著提升（F(9, 45) = 13.5, p < 0.001）。灰色条表示从原始延长管训练碗切换至当前训练碗的时间点。（C）在对三种碗的测试中，9天测试期间的总抓取次数存在显著差异（F(8, 32) = 3.74, p = 0.003）。注意：大鼠2在塑形训练后被剔除。Plinko碗与较少抓取次数的碗（p = 0.001）以及普通碗（p = 0.027）相比，均表现出显著差异。请点击此处查看该图的放大版本。

8. 使用哈马林建模精细运动障碍

注意：为了确定运动障碍对精细运动能力和精细运动任务表现的影响，对大鼠注射了哈马灵（Harmaline，10 mg/kg），这是一种β-咔啉类生物碱，可逆性地抑制单胺氧化酶A，并作用于下橄榄核52,55,56,57。在啮齿类动物模型中，哈马灵会影响姿势与平衡，限制精细运动协调能力，并引起上肢的运动功能紊乱。

  1. 称重实验大鼠，以计算适当的哈马林（Harmaline）剂量。
  2. 让大鼠在测试室中适应环境 1 小时。
  3. 打开计算机并安装好食盆。连接摄像机和光源。启动录像软件，并按照方案第 2 节所述调整摄像机设置。
  4. 对啮齿动物注射哈马林（10 mg/kg，腹腔注射）。
  5. 注射后 15 分钟，将食丸倒入相应的食盆中，开始录像。在连续 3 天内，每天使用不同的食盆对大鼠进行测试：
    第 1 天 普通食盆：约 100 颗食丸
    第 2 天 减量食盆：约 50 颗食丸
    第 3 天 Plinko 食盆：约 50 颗食丸
    注意：注射后需持续监测注射部位是否出现异常，包括皮肤刺激、疼痛行为、共济失调、低体温及姿势改变，观察时间至少达 3 小时。在 3 小时观察期结束后，仍需继续监测动物行为的任何变化，包括进食或饮水的潜伏期延长，或残留震颤等表现。

9. 使用机器学习进行视频分析

注意：在完成数据采集和视频记录后，通过人工计数并评分如下：成功（取回并消耗颗粒）、掉落（取回颗粒但在消耗前掉落）、失败（无法取回颗粒）。该人工评分数据被用作机器学习分析的基准真实数据。

  1. 使用位于 https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask 的自定义 Python 代码，对基线期（Baseline）和哈马林（Harmaline）处理后的动物进行比较，以识别抓取行为表现的变化（图3、图4、图5 和 图6）。
  2. 为分析抓取行为的关节运动学，包括抓取轨迹、前爪形态与位置，以及在不同类型碗条件下抓取策略的变化，使用免费开源的机器学习软件 Social LEAP Estimates Animal Poses (SLEAP)（详见 https://sleap.ai/ 获取更详细的说明及使用该开源程序的分步指南49）。
    注意：SLEAP49 可在 https://github.com/talmolab/sleap 下载。
  3. 新建一个项目，并添加3个抓取任务的视频。
  4. 创建一个包含15个节点的骨架结构：1个上臂节点、1个腕部节点、1个掌心中心节点、4个基部节点、4个指节节点和4个指尖节点（骨架结构可从 https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask 下载）。
  5. 在节点之间添加连接，使上臂连接至腕部，再连接至掌心中心；从掌心中心出发，依次连接基部、指节和指尖节点，确保掌心中心始终为起始节点（图7A）。
  6. 在运行训练前，至少标注50帧图像。此处可训练新模型，或使用 GitHub 上提供的居中（centered）和质心（centroid）模型：https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask。
  7. 模型训练完成后，打开新视频并运行推理：trackin.match: greedy，n_instances:1，tracking.clean_instance_count: 1，tracking.target_instance_count: 1，tracking.pre_cull_to_target: 1。
    注意：推理过程可通过 bash 脚本在本地集群上运行。追踪后的视频可能需要校对（校对说明见 https://sleap.ai/）。
  8. 为进一步分析节点数据，并理解各组在关节运动学方面的差异，使用免费开源的 keypoint-MoSeq50（下载及使用说明详见 https://github.com/dattalab/keypoint-moseq）。
  9. 利用 keypoint-MoSeq50 生成行为的离散音节单元（图7B）。进行进一步分析，以绘制转换频率、概率，以及哈马林处理组与基线期组在不同碗条件下转换频率的变化（图7C、D）。分析代码见 https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask。

基线条件与哈马林处理条件下箱线图比较。普通碗、较少碗、宾果碗的总抓取次数。
图3：不同碗型及处理条件下抓取行为的变化。（A）在基线条件（n = 5）测试中，三种碗型之间的总抓取次数存在显著差异（H(df) = 8.48，p = 0.014，Kruskal-Wallis检验），其中宾果碗型的抓取次数显著更多（p = 0.011，事后Dunn检验，Bonferroni校正）。（B）哈马林处理（n = 5）后，不同碗型之间的抓取次数未见显著差异。误差以标准误（S.E.M.）表示。*p < 0.05。 请点击此处查看该图的高清版本。

柱状图比较基线与哈马林（harmaline）条件下成功、放弃和失败次数及表现（%）
图4：不同条件及不同碗型之间的表现比较。（A）在基线测试中，碗型（F(2) = 5.78，p = 0.007）和结果（F(2) = 3.92，p = 0.029）存在显著差异。随着碗型难度增加，抓取尝试次数上升，但在哈马林条件下，所有碗型的抓取次数均较基线减少。（B）在哈马林处理的大鼠中，不同碗型间的抓取次数无显著差异。（C）按表现分析时，在基线测试中结果存在显著差异（F(2) = 2.07，p < 0.001）。（D）在哈马林处理的大鼠中，碗型或结果表现均无显著差异。误差以标准误（S.E.M.）表示。请点击此处查看该图的放大版本。

基线与哈尔米林条件下的成功率与失败率柱状图；统计数据显示基线与哈尔米林效应的比较。
图 5：基线条件与哈尔米林条件的比较。（A）两种条件下在表现成功率方面无显著差异。（B）在失败次数上，基线条件与哈尔米林条件之间存在显著差异（H(df) = 4.85，p = 0.028，Kruskal-Wallis 检验），且在哈尔米林条件下发现显著效应（p = 0.028，事后 Dunn 检验，经 Bonferroni 校正）。误差以标准误（S.E.M.）表示。请点击此处查看该图的放大版本。

比较学习速率和抓取速率的箱线图；基线与哈尔米林条件的统计分析。
图6：学习速率与抓取速率。（A）与基线条件相比，哈尔米林处理动物的学习速率受到干扰（t 统计量 = 2.833，p = 0.022）。（B）每分钟总抓取次数在碗型（less）与条件（哈尔米林）之间存在显著交互作用（F(1,5) = 9.83，p = 0.002，混合线性模型），以及在碗型（plinko）与条件（哈尔米林）之间也存在显著交互作用（F(1,5) = 22.67，p < 0.001，混合线性模型）。与基线相比，哈尔米林处理在所有类型的碗中均减少了每分钟的总抓取次数（less：p = 0.01，plinko：p < 0.001）。误差以标准误（S.E.M.）表示。*p < 0.05，***p < 0.001。 请点击此处查看此图的放大版本。

Hand movement analysis with diagram, graphs showing syllable transitions and network differences.
图7机器学习识别出独特的姿势和任务策略。（A） 使用 SLEAP 标记的大鼠足部节点位置。B) 使用关键点-MoSeq 在抓取过程中识别出的音节示例。C) 相邻音节间二元音素转移频率矩阵。转移概率按二元音素总频次进行归一化。D) 哈尔明与基线条件下音节转换差异的转移图。图中节点代表音节，边表示音节之间的转换。较显著的边表示发生频率较高的音节转换。红色连接线表示哈尔明处理动物中上调的音节转换，蓝色连接线表示下调的音节转换。红色圆圈表示哈尔明处理动物中该音节使用频率上调，蓝色圆圈表示使用频率下调。频率低于0.005的音节对已被排除。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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结果

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大鼠达到体重减少90%的食物限制后，先在实验箱中适应2天，随后进行1至2周的训练程序。由经过培训且对实验条件设盲的观察者记录每次成功、掉落和失败的抓取次数。在为期9天的基线期（Baseline）中，大鼠在三种不同碗状装置配置（普通型、较少障碍型和Plinko型）下测试其精细运动能力。随后，同一批大鼠（每组n = 5，其中1只因训练期间生病被剔除）连续3天每天腹腔注射Harmaline（10 mg/kg），以评估其抓取能力、策略和表现的变化（图2A）。在设计与构建阶段，初步训练用碗未能提升抓取能力（第1–4天），因此对训练碗进行了重新设计，增加了延长结构，动物自此开始持续尝试获取食丸（第5–10天），并在第10天达到训练标准（图2B）。在所有类型的碗中，个体总抓取次数存在差异，且随着任务难度增加，抓取次数上升，显示出动物的坚持性（图2C和 图3A）。通过Harmalin...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

啮齿类动物的抓取任务通常局限于单个颗粒物，且不包含障碍物或自我干扰因素，而这些正是神经退行性疾病患者常见的困难。本文介绍的方法结合了一种重新设计的颗粒抓取任务与机器学习技术，能够通过分析姿态特征及姿态间的转换，检测动物的协调性与行为策略，同时还能分析单个脚趾的运动。本研究创建的精细运动任务通过分析姿态及其转换过程来评估协调性和策略。典型的抓取任务通常涉及一个平台，其上放置单一食物奖励，供受试动物抓取获取。由于依赖于单一、重复的抓取策略，传统的单颗粒任务缺乏与任务难度相关的指标，在纵向研究中难以反映潜在的学习过程，也无法捕捉测试过程中因颗粒位置变化而带来的策略调整挑战，而这些均可被新方法所检测。传统单颗粒任务的这一局限性导致表现出现天花板效应，即啮齿类动物在掌握单一重复性抓取动作后，其速度和准确性趋于 plateau42。通过使用不同类型的碗体，改变颗粒数量并引入障碍物 （如本研究所示），动物必须持续更新策略以应对碗体差异以及相邻颗粒被扰动时引起的颗粒移动41,58...

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披露

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作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

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本研究由心理健康研究所、社会科学研究所、亚利桑那州卫生科学部 [ADHS14-052688]、美国卫生与公共服务部、国立卫生研究院 [P30AG019610]、亚利桑那州阿尔茨海默病研究中心 REC 学者项目、 亚利桑那州阿尔茨海默病联盟以及 Nancy Eisenberg 初级教员学者奖资助。图示使用 Biorender.com 制作。我们感谢 Nelson Yamada、Akash Kuppravalli 和 Jeanne Kamau 在设计方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3D 打印材料Amazon (Overture)B07PGY2JP1PLA 丝材 1.75 mm，PLA 3D 打印机耗材，尺寸精度 ±0.03 mm
相机Edmond OpticsBFS-U3-13Y3M-C130 万像素，单色，170 帧/秒，ON Semi PYTHON 1300 x2
相机线缆Edmond OpticsACC-01-2300USB 3.1，3 米，Type-A 转 Micro-B（带锁）线缆
相机镜头Thor labsMVL5WA4.5 mm 有效焦距，F/1.4，1/2" 格式机器视觉镜头
相机与三脚架连接件Edmond Optics88-210相机与三脚架连接件
清洁湿巾Amazon (Sani-Cloth)B00KMZ7KMOAF3 表面消毒清洁湿巾罐装，淡香味，160 片装，P13872
计算机DellPrecisionIntel Core i7-13700 @ 2.1 GHz，NVIDIA T1000 8 GB，16 GB 内存
红外光源Amazon (Serlium)B0BJFDBT44相机用红外灯，48 颗 LED 红外照明灯，防水，用于安防监控摄像头的红外夜视光源       
面板胶Amazon (Sdintar)B0B1DLRPNZ玻璃胶
有机玻璃板（Plexiglass）Amazon (TOOLINHAND  US)B0BRJ1L8TR12 × 12" 透明浇铸亚克力/有机玻璃板，透明，1/8” 厚（3 mm） 
Python Python Software FoundationPython 3.7
SpinviewTeledyne TechnologiesVersion 3.1.0.79 
糖丸（45 mg）BioservF002345 mg，无味，50,000 粒/盒；成分：蔗糖、葡萄糖、硬脂酸镁、硅酸钙、矿物油
三脚架Amazon (YOUYI)B086PYJF9DAmazon 柔性桌面网络摄像头三脚架
镊子Fine Science Tools11064-07虹膜镊
蜡Amazon (Orthomechanics)B00FKDC0UU正品 Orthowax 

参考文献

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