本研究描述了一种利用机器学习检测啮齿类动物模型(包括TgF344-AD大鼠)运动功能障碍的精细运动行为测试方法。
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本研究描述了一种利用机器学习检测啮齿类动物模型(包括TgF344-AD大鼠)运动功能障碍的精细运动行为测试方法。
运动功能障碍是神经退行性疾病(如阿尔茨海默病(AD)及相关痴呆症)中一个关键但常被低估的组成部分。最新研究表明,涉及精细运动行为、视觉空间能力及执行功能的人类任务在疾病早期检测中具有潜在应用价值。然而,目前对这些任务预测AD相关认知与功能衰退的具体机制仍知之甚少。本研究方法中,开发了一种精细运动任务——运动学运动能力任务(KINEMAT),利用免费的开源机器学习软件,旨在检测AD临床前模型中随疾病进展出现的运动能力变化,并与其他神经退行性疾病及正常衰老进行比较。本研究通过一项针对Fisher 344 CDF大鼠的初步实验,设计、测试并实施了该精细运动任务,验证了其概念可行性,其中部分大鼠经Harmaline诱导产生运动障碍,另一部分则为对照组。进一步在阿尔茨海默病大鼠模型(TgF344-AD)中进行的额外验证,进一步证明了该模型的可行性及任务的敏感性。实验中,大鼠被训练通过笼前部的小狭缝伸爪,从三个难度不同的碗中获取糖丸。糖丸获取情况按以下三类评分:成功(成功抓取并吃掉糖丸)、掉落(抓取后在收回过程中掉落)或失败(未获取到糖丸,或在尝试抓取时将糖丸碰出碗外)。对照组与Harmaline处理组大鼠在运动能力上表现出显著差异,表现为总伸爪次数减少及前爪姿态变异性增加。TgF344-AD大鼠同样表现出总伸爪次数减少,且在所有难度的碗中成功获取次数均降低。本研究验证了该任务作为啮齿类动物精细运动评估工具的有效性,未来有望用于研究正常衰老过程以及包括AD在内的神经退行性疾病的临床前模型,以追踪病理变化和症状随时间的发展。
研究表明,由于阿尔茨海默病(AD)或其他亚型(例如路易体痴呆)导致的痴呆患者存在运动功能受损。握力和步速可用于区分认知受损与未受损的老年人1,2,但未必能够有效区分不同类型的痴呆(即特异性较低)1,2。因此,仍需开发新的早期痴呆诊断工具,可能结合机器学习技术,以评估行为与疾病状态之间的复杂模式和关联3,4。动物模型对于研究神经退行性疾病的进展具有重要价值,有助于揭示疾病早期 onset、行为相关特征,并将机器学习整合到分析流程中,以区分疾病严重程度和临床表现5,6,7。
人类新的行为学方法已确定了一些涉及精细运动技能以及认知加工的任务,例如视空间能力和执行功能8,9,10。例如,一项功能性上肢任务可用于追踪神经退行性变的模式,并能够区分轻度认知障碍(MCI)与阿尔茨海默病(AD)。在此任务中,受试者使用勺子将生的芸豆(每次两颗)从中央起始杯转移到目标杯中。任务中用勺子拾取豆子的阶段与认知能力(特别是视空间记忆)的关联性,强于将豆子运送至目标杯的阶段11,12。当勺子进入杯子时,可能会扰动杯中的豆子,这意味着参与者的动作可能使任务难度增加。此外,随着试验的进行,起始杯中豆子数量减少,任务难度也随之增加(即用勺子拾取豆子所需时间延长)13。该任务已被证明与AD特异性病理(淀粉样蛋白沉积)9,14及神经退行性变(海马萎缩)10,15相关,提示其表现可能依赖于在疾病早期即受影响的神经回路和行为过程。已知运动的启动、计划、执行及运动校正由跨越大脑的多样化神经网络控制,包括位于大脑皮层的上运动神经元,其胞体与脊髓中的下运动神经元形成突触连接16。这些下运动神经元直接与肌肉在神经肌肉接头处进行通讯,以控制运动。上行传导束将来自外周的感觉信息传递至脊髓,而脑内的下行传导束则向肌肉传递关于如何运动及运动方向的信息17,18。 明确这些通路如何被AD病理选择性影响,对于理解疾病进展至关重要,尤其是因为包括3xTg-AD小鼠和TgF344-AD大鼠在内的遗传性动物模型已被用于研究AD相关基因对运动能力、协调性及其他运动障碍的影响19,20,21。通常,这些任务主要关注与全身运动相关的粗大运动障碍,但人类的运动缺陷表现更为多样,这在啮齿类动物中较难识别22。因此,需要开发新的任务,以弥合人类与动物模型之间的差距,从而捕捉这种变异性。
一个常与运动障碍和震颤相关的脑区是小脑23。小脑在精确和协调运动的调控中起着重要作用,它通过处理感觉信息,并经由下行通路提供反馈,以纠正和适应随意运动24,25。值得注意的是,阿尔茨海默病(AD)患者中已观察到小脑萎缩,但与海马等其他脑区不同,小脑中淀粉样蛋白沉积的增加并不与萎缩程度的加重相关26。尽管AD病理在小脑中的进展模式有所不同,但小脑与海马之间存在多突触的双向连接,这些连接在AD中可能受到破坏27,28,29。值得注意的是,小脑与海马之间存在功能连接,因为在小脑肿瘤切除术后已记录到记忆缺陷的发生30,31,32,33,34,35,36,37。在啮齿类动物中,小脑的干扰会导致海马位置细胞的异常38。这些在记忆、社交行为和运动控制方面的重叠性缺陷,突显了揭示认知衰退发生前运动通路潜在早期变化的重要性30,31,38,39。通过在早期AD研究中引入精细运动任务,我们或许能够重塑将AD仅仅视为认知障碍的传统观念,并将诊断重点转向那些可能预测疾病进展、且在认知受损与未受损老年人群之间更具区分度的早期运动变化。
为了理解精细运动行为如何反映大脑结构的变化,研究人员开发并测试了一种啮齿类动物版本的人类任务。该啮齿类动物任务被命名为KINEMAT(KINEmatic Motor Ability Task,运动能力运动学任务),与以往需要从基座或阶梯上取回单个颗粒物的抓取任务不同,也不同于因颗粒物在任务各阶段位置固定而导致评分方式较为简单的传统方法40,41,42,43,44,45,46,47,48。该精细运动抓取任务引入了新的评分方法、具有不同难度的凹槽装置以及自我干扰特性,以模拟人类对应任务,其中颗粒物的移动以及受试者随之调整策略的过程是实验设计的核心。本任务采用机器学习工具Social LEAP Estimates Animal Poses(SLEAP)和keypoint-MoSeq49,50,实现对精细运动能力和抓取行为的无偏倚、定量测量。尽管已有其他重要的计算模型被用于啮齿类动物的熟练抓取任务44,45,51,但keypoint-MoSeq能够消除噪声,从而精确量化运动和抓握姿态50。通过高性能机器视觉相机,研究人员在正常大鼠及使用Harmaline诱导运动障碍的大鼠中重建了任务表现和运动学习策略52。Harmaline可过度激活下橄榄核,并通过谷氨酸能攀爬纤维干扰小脑功能53,54。此外,还在一部分TgF344-AD大鼠中检测了其精细运动能力。因此,作为概念验证,预期该精细运动任务可在经Harmaline处理的大鼠和TgF344-AD大鼠中检测到相对于正常对照组可量化的功能损伤。本实验方案详细描述了精细运动任务的构建、动物的训练与测试,以及利用SLEAP和keypoint-MoSeq对抓取行为进行定量分析的方法。
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本文所述所有方法均已获得亚利桑那州立大学机构动物护理与使用委员会(IACUC)的批准。
1. 腔室的设计与构建
2. 计算机与相机硬件

图1:精细运动任务示意图。(A)精细运动任务的示意图,其中大鼠通过狭缝伸爪以获取糖颗粒。伸爪动作被记录下来用于机器学习分析。实验中使用三个不同的碗:(左下)训练碗、(中下)普通/简易碗,以及(右下)带障碍物的宾果碗(障碍物以红色圆圈标出)。(B)每种碗的设计示意图,包括(上)训练碗、(中)普通/简易碗和(下)宾果碗。请点击此处查看该图的放大版本。
3. 动物准备
4. 习惯化(2 天)
5. 成型(10 天)
6. 准备测试:
7. 测试(9 天)

图 2:执行精细运动任务的大鼠训练与测试。 (A)实验时间线。大鼠先适应装置两天,随后进行为期10天的塑形训练。之后,每只动物在三种不同的碗中分别进行为期三天的精细运动能力测试。随后,动物被注射哈马林(Harmaline),并在每种碗中再进行为期三天的重新测试。(B)大鼠(n = 6)在塑形训练期间经历了两种不同类型的碗(训练碗和普通碗),并在第5天更换碗的类型以促进抓取行为的改善。在10天的塑形过程中,达到标准的表现有显著提升(F(9, 45) = 13.5, p < 0.001)。灰色条表示从原始延长管训练碗切换至当前训练碗的时间点。(C)在对三种碗的测试中,9天测试期间的总抓取次数存在显著差异(F(8, 32) = 3.74, p = 0.003)。注意:大鼠2在塑形训练后被剔除。Plinko碗与较少抓取次数的碗(p = 0.001)以及普通碗(p = 0.027)相比,均表现出显著差异。请点击此处查看该图的放大版本。
8. 使用哈马林建模精细运动障碍
注意:为了确定运动障碍对精细运动能力和精细运动任务表现的影响,对大鼠注射了哈马灵(Harmaline,10 mg/kg),这是一种β-咔啉类生物碱,可逆性地抑制单胺氧化酶A,并作用于下橄榄核52,55,56,57。在啮齿类动物模型中,哈马灵会影响姿势与平衡,限制精细运动协调能力,并引起上肢的运动功能紊乱。
9. 使用机器学习进行视频分析
注意:在完成数据采集和视频记录后,通过人工计数并评分如下:成功(取回并消耗颗粒)、掉落(取回颗粒但在消耗前掉落)、失败(无法取回颗粒)。该人工评分数据被用作机器学习分析的基准真实数据。

图3:不同碗型及处理条件下抓取行为的变化。(A)在基线条件(n = 5)测试中,三种碗型之间的总抓取次数存在显著差异(H(df) = 8.48,p = 0.014,Kruskal-Wallis检验),其中宾果碗型的抓取次数显著更多(p = 0.011,事后Dunn检验,Bonferroni校正)。(B)哈马林处理(n = 5)后,不同碗型之间的抓取次数未见显著差异。误差以标准误(S.E.M.)表示。*p < 0.05。 请点击此处查看该图的高清版本。

图4:不同条件及不同碗型之间的表现比较。(A)在基线测试中,碗型(F(2) = 5.78,p = 0.007)和结果(F(2) = 3.92,p = 0.029)存在显著差异。随着碗型难度增加,抓取尝试次数上升,但在哈马林条件下,所有碗型的抓取次数均较基线减少。(B)在哈马林处理的大鼠中,不同碗型间的抓取次数无显著差异。(C)按表现分析时,在基线测试中结果存在显著差异(F(2) = 2.07,p < 0.001)。(D)在哈马林处理的大鼠中,碗型或结果表现均无显著差异。误差以标准误(S.E.M.)表示。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5:基线条件与哈尔米林条件的比较。(A)两种条件下在表现成功率方面无显著差异。(B)在失败次数上,基线条件与哈尔米林条件之间存在显著差异(H(df) = 4.85,p = 0.028,Kruskal-Wallis 检验),且在哈尔米林条件下发现显著效应(p = 0.028,事后 Dunn 检验,经 Bonferroni 校正)。误差以标准误(S.E.M.)表示。请点击此处查看该图的放大版本。

图6:学习速率与抓取速率。(A)与基线条件相比,哈尔米林处理动物的学习速率受到干扰(t 统计量 = 2.833,p = 0.022)。(B)每分钟总抓取次数在碗型(less)与条件(哈尔米林)之间存在显著交互作用(F(1,5) = 9.83,p = 0.002,混合线性模型),以及在碗型(plinko)与条件(哈尔米林)之间也存在显著交互作用(F(1,5) = 22.67,p < 0.001,混合线性模型)。与基线相比,哈尔米林处理在所有类型的碗中均减少了每分钟的总抓取次数(less:p = 0.01,plinko:p < 0.001)。误差以标准误(S.E.M.)表示。*p < 0.05,***p < 0.001。 请点击此处查看此图的放大版本。

图7机器学习识别出独特的姿势和任务策略。(A) 使用 SLEAP 标记的大鼠足部节点位置。B) 使用关键点-MoSeq 在抓取过程中识别出的音节示例。C) 相邻音节间二元音素转移频率矩阵。转移概率按二元音素总频次进行归一化。D) 哈尔明与基线条件下音节转换差异的转移图。图中节点代表音节,边表示音节之间的转换。较显著的边表示发生频率较高的音节转换。红色连接线表示哈尔明处理动物中上调的音节转换,蓝色连接线表示下调的音节转换。红色圆圈表示哈尔明处理动物中该音节使用频率上调,蓝色圆圈表示使用频率下调。频率低于0.005的音节对已被排除。 请点击此处以查看此图的放大版本。
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大鼠达到体重减少90%的食物限制后,先在实验箱中适应2天,随后进行1至2周的训练程序。由经过培训且对实验条件设盲的观察者记录每次成功、掉落和失败的抓取次数。在为期9天的基线期(Baseline)中,大鼠在三种不同碗状装置配置(普通型、较少障碍型和Plinko型)下测试其精细运动能力。随后,同一批大鼠(每组n = 5,其中1只因训练期间生病被剔除)连续3天每天腹腔注射Harmaline(10 mg/kg),以评估其抓取能力、策略和表现的变化(图2A)。在设计与构建阶段,初步训练用碗未能提升抓取能力(第1–4天),因此对训练碗进行了重新设计,增加了延长结构,动物自此开始持续尝试获取食丸(第5–10天),并在第10天达到训练标准(图2B)。在所有类型的碗中,个体总抓取次数存在差异,且随着任务难度增加,抓取次数上升,显示出动物的坚持性(图2C和 图3A)。通过Harmalin...
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啮齿类动物的抓取任务通常局限于单个颗粒物,且不包含障碍物或自我干扰因素,而这些正是神经退行性疾病患者常见的困难。本文介绍的方法结合了一种重新设计的颗粒抓取任务与机器学习技术,能够通过分析姿态特征及姿态间的转换,检测动物的协调性与行为策略,同时还能分析单个脚趾的运动。本研究创建的精细运动任务通过分析姿态及其转换过程来评估协调性和策略。典型的抓取任务通常涉及一个平台,其上放置单一食物奖励,供受试动物抓取获取。由于依赖于单一、重复的抓取策略,传统的单颗粒任务缺乏与任务难度相关的指标,在纵向研究中难以反映潜在的学习过程,也无法捕捉测试过程中因颗粒位置变化而带来的策略调整挑战,而这些均可被新方法所检测。传统单颗粒任务的这一局限性导致表现出现天花板效应,即啮齿类动物在掌握单一重复性抓取动作后,其速度和准确性趋于 plateau42。通过使用不同类型的碗体,改变颗粒数量并引入障碍物 (如本研究所示),动物必须持续更新策略以应对碗体差异以及相邻颗粒被扰动时引起的颗粒移动41,58...
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作者声明不存在竞争性财务利益。
本研究由心理健康研究所、社会科学研究所、亚利桑那州卫生科学部 [ADHS14-052688]、美国卫生与公共服务部、国立卫生研究院 [P30AG019610]、亚利桑那州阿尔茨海默病研究中心 REC 学者项目、 亚利桑那州阿尔茨海默病联盟以及 Nancy Eisenberg 初级教员学者奖资助。图示使用 Biorender.com 制作。我们感谢 Nelson Yamada、Akash Kuppravalli 和 Jeanne Kamau 在设计方面提供的帮助。
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