本文介绍了一种从新生Sprague-Dawley（SD）大鼠中分离原代视网膜穆勒细胞的详细方案。该操作流程包括眼球摘除、视网膜组织解剖、细胞提取与鉴定，以及后续细胞培养的关键注意事项。
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摘要
摘要
视网膜穆勒细胞（RMCs）在维持视网膜结构支持和调控多种视网膜功能中发挥关键作用。作为视网膜微环境的核心组成部分，RMCs执行多项重要功能。通过其丰富的离子通道、配体、受体、跨膜转运蛋白及酶系统，这些细胞参与神经递质和营养因子的分泌，调节视网膜代谢，并维持水离子稳态。值得注意的是，近期研究发现RMCs是内源性视网膜再生干细胞的重要来源，为治疗视网膜变性疾病提供了新的治疗靶点。因此，研究RMCs对于理解视网膜疾病病理机制至关重要。本研究系统建立了一套标准化实验方案，包括胰酶消化法分离与纯化原代RMCs、倒置光学显微镜和苏木精-伊红（HE）染色进行形态学观察、免疫荧光染色鉴定特异性蛋白，以及细胞纯度分析 通过 流式细胞术。本方案为与视网膜微血管细胞（RMCs）相关的基础研究和临床应用提供了有价值的参考，有助于探索其在视网膜疾病中的作用机制，并推动治疗策略的开发。
引言
视网膜穆勒胶质细胞（RMCs）是视网膜中的主要大胶质细胞，构成视网膜神经血管单元的核心1,2。RMCs 几乎贯穿整个视网膜厚度，包绕几乎所有视网膜神经元和微血管系统。其突起向上延伸至内界膜（ILM），形成顶端足突，向下延伸至外界膜（OLM），并在该处发育出特化的微绒毛3。这种独特的结构使 RMCs 能够作为视网膜组织的主要结构支架4,5。
RMC富含离子通道、配体、受体、跨膜转运蛋白和酶6，它们参与视网膜的葡萄糖代谢 通过 糖酵解7钾离子通道（Kir2.1、Kir4.1）与水通道蛋白（AQP4、AQP9、AQP11）协同调控细胞膜上的离子与水分稳态，维持视网膜生理平衡7此外，放射状胶质细胞（RMCs）能够吸收并清除神经元释放的神经递质，包括谷氨酸、γ-氨基丁酸（GABA）和甘氨酸。7,8.
糖尿病视网膜病变7、青光眼9和视网膜色素变性10等病理状态可损伤视网膜Müller细胞（RMCs），破坏血-视网膜屏障，引发炎症反应，增加血管通透性，并损害视网膜功能。RMCs还被公认为视网膜再生细胞的潜在内在来源11,12。在鱼类和某些两栖类动物中，RMCs可去分化为视网膜前体细胞，以替代因损伤而丢失的神经元13。在成年哺乳动物视网膜中，RMCs表达干细胞相关标志蛋白14,15，因而具有分化为视网膜神经元的潜能，可用于替代年龄相关性黄斑变性、青光眼和糖尿病视网膜病变等退行性疾病中受损的细胞16。原代RMCs能高度模拟其体内（in vivo）状态，在视网膜退行性疾病的机制研究与治疗探索中具有重要价值。然而，现有文献中关于原代RMCs的分离与培养方法报道较少，尤其是来自新生Sprague-Dawley（SD）大鼠的RMCs。
本方案采用3至5日龄的新生SD大鼠，无性别偏好。在无菌条件下摘除眼球，使用胰蛋白酶消化视网膜组织，随后分离原代视网膜微血管细胞（RMCs）。 通过 离心和纯化以用于后续培养和传代。采用倒置光学显微镜结合苏木精和伊红（H&E) 染色显示，分离的细胞表现出典型的视网膜Müller细胞（RMC）特征。免疫荧光染色证实了RMC特异性蛋白标志物的表达，包括谷氨酰胺合成酶（GS）、细胞视黄醛结合蛋白（CRALBP）、波形蛋白（Vimentin）、水通道蛋白-4（AQP4）以及内向整流钾通道4.1（Kir4.1）。使用GS和CRALBP抗体标记后的流式细胞术分析显示细胞纯度≥90%，符合基于RMC的生物学实验的既定标准，确保了其适用于后续功能研究。在实验过程中，第4代细胞表现出对培养瓶贴附能力下降、形态改变以及衰老迹象，最终导致细胞死亡。因此，后续实验仅使用前3代细胞。
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方案
所有动物实验均遵循《眼科与视觉研究中动物使用ARVO声明》的规定，并经成都中医药大学动物伦理委员会批准（伦理编号：2024069）。本研究共使用50只无特定病原体（SPF）级Sprague-Dawley大鼠（3–5日龄，性别未指定，体重7–10 g）。实验动物由商业途径获得，并饲养于成都中医药大学实验动物中心（实验动物使用许可证号：SYXK [四川] 2024-049），环境条件符合标准实验室要求。本研究中所用试剂与设备的详细信息见于 材料表.
1. 原代肾小球系膜细胞的分离与培养
- 实验物品准备
- 使用前，在超净工作台内将以下物品置于紫外线下灭菌至少30分钟：T25培养瓶、离心管及管架、移液器及支架、废液容器、打火机、酒精灯和记号笔。
- 使用前，通过高压灭菌对以下物品进行灭菌处理：1 mL移液器吸头、弯板、带盖玻璃培养皿、弯头镊子、45 µm尼龙筛网（300目）、齿状镊子、无齿镊子和微型角膜剪。
- 环境准备：对眼球解剖所用的环境和操作台进行紫外线消毒，时间超过30分钟。每次进入或离开超净工作台前，均需向实验人员手部喷洒酒精。将培养箱设置为37 °C和5% CO2。每次打开或关闭培养箱前后，均需向实验人员手部喷洒酒精。
- 溶液配制：配制D-Hank's溶液、磷酸盐缓冲液（PBS）、杜氏改良伊格尔培养基（DMEM高糖）、胎牛血清（FBS，热灭活）、青霉素/链霉素溶液（100倍浓度）和0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液。
注意：使用前将DMEM和FBS在37 °C水浴中预热。- 通过向10 mL D-Hank's或PBS溶液中分别加入100 µL青霉素/链霉素溶液，配制含1%青霉素/链霉素的D-Hank's和PBS溶液。
- 向10 mL高糖DMEM中加入100 µL青霉素/链霉素溶液和2 mL FBS，配制完全培养基。
注意：在实验室超净工作台中配制溶液，并尽可能立即使用。完全培养基应于4 °C保存，每次使用前预热至37 °C。若保存超过一周，则应弃用。
- 眼球摘除
- 根据机构批准的实验方案，在已灭菌的工作台上通过颈椎脱位法（不使用CO2 窒息法）处死新生SD大鼠。将尸体浸入75%酒精中5分钟以消毒，然后转移至无菌弯盘中。
- 将D-Hank's溶液倒入两个10 cm玻璃培养皿中。
- 使用齿状镊子沿睑裂方向撕开眼睑，暴露眼球。
- 使用无齿镊子张开并平行于睑裂方向按压眼眶。当触及视神经并暴露眼球时，闭合镊子以提起并摘除眼球。
- 将眼球放入盛有D-Hank's溶液的玻璃培养皿中，冲洗后转移至另一盛有新鲜D-Hank's溶液的培养皿中。
注意：确保眼球保持完整。理想情况下，应保留部分视神经，以便于视网膜组织的分离。
- 视网膜解剖
- 准备一个已灭菌且带盖的空培养皿，并调节显微镜。
- 将步骤1.4.5中的玻璃培养皿置于显微镜下。使用弯头眼科显微镊轻轻固定角膜与视神经之间的区域，以暴露角膜。
- 使用微型角膜剪刺穿角膜巩膜交界处。沿角膜缘作环形切割，然后在对称位置作长约2 mm的巩膜切口。松开镊子，重新夹持于视神经与巩膜交界处。
- 使用第二把镊子轻轻按压视神经根部附近，施力方向朝向角膜-视神经界面。当晶状体组织出现时，小心将其移除，并继续按压直至视网膜组织显露。
注意：小心移除晶状体，避免意外带出视网膜组织。 - 使用镊子将分离的视网膜组织转移至另一无菌培养皿中。盖上皿盖，喷洒酒精，并置于超净工作台上。
- 原代RMCs的提取
- 打开超净工作台通风开关。
- 打开培养皿盖。使用装有1 mL吸头的移液器将视网膜组织上下吹打约15次，使其分散成小块。加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，在37 °C孵育5分钟。
- 将培养皿从培养箱中取出并置于超净工作台上。加入2 mL完全培养基，轻轻吹打以终止消化。
注意：使用胰蛋白酶体积两倍的完全培养基终止消化。例如，若使用1 mL胰蛋白酶，则用2 mL完全培养基终止。 - 将细胞悬液通过300目尼龙筛网过滤至15 mL离心管中。用预先配制的PBS冲洗培养皿，并收集残留悬液。
- 在室温（RT）下以878 x g 离心5分钟。吸除并弃去上清液。将沉淀重悬于2 mL完全培养基中，再次以878 x g离心5分钟以纯化细胞。
- 离心后弃去上清液。将细胞重悬于2 mL完全培养基中。预先向每个T25培养瓶中加入3 mL完全培养基，然后加入1 mL细胞悬液。以十字形方式轻轻摇晃培养瓶，随后放入培养箱中。
- 孵育48小时后进行首次换液。将培养瓶从培养箱中取出并置于超净工作台上。弃去旧培养基，并用1 mL PBS对贴壁细胞表面清洗三次。
- 加入5 mL新鲜完全培养基。此后每隔一天更换一次培养基，直至细胞融合度超过90%，然后进行传代培养。
2. RMCs 的传代
注意：当细胞融合度超过90%时进行传代。在本方案中，原代培养物通常在分离后5-6天需要传代。首次传代的时间可能因接种密度而异。将细胞密度调整至4 × 103 个细胞/mL，并将细胞接种至T25培养瓶中。当3-4天后细胞融合度达到>90%时，进行传代操作。
- 从培养箱中取出T25培养瓶，弃去培养基，用含1%青霉素/链霉素的1 mL PBS溶液洗涤细胞三次。
- 向培养瓶中加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，于培养箱中孵育1分30秒。
- 在倒置显微镜下观察培养瓶，当细胞呈现变圆、脱落并开始漂浮时，将培养瓶从培养箱中取出，转移至超净工作台，加入2 mL完全培养基以终止消化。
- 用移液器吸取细胞悬液，轻轻吹打培养瓶壁，以使残留的贴壁细胞脱落。
- 将全部细胞悬液转移至15 mL离心管中，用含1%青霉素/链霉素的2 mL PBS冲洗培养瓶壁，并将冲洗液加入同一离心管中。在室温下以878 × g离心5分钟。
- 弃去上清液，用适量完全培养基重悬细胞沉淀。根据需要按1:2或1:3的比例传代细胞。
注意：后续实验请使用第2代（P2）细胞（图1）。
3. 苏木精和伊红（H&E）染色
- 将第2代（P2）细胞以每孔2× 105 个细胞的密度接种于6孔板中，孔内预先放置无菌盖玻片。每孔加入2 mL完全培养基。当细胞融合度达到约80%时，弃去培养基，用1 mL PBS轻轻冲洗每个孔两次。
- 每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定液，室温孵育30 min以固定细胞。弃去固定液，用1 mL PBS洗涤细胞两次。
- 每孔加入1 mL苏木精染液，孵育15 min。弃去染液，用1 mL PBS冲洗各孔2–3次。
- 在显微镜下观察细胞。若苏木精染色过深，可用1%盐酸酒精进行分化，去除多余的胞质着色。用1 mL PBS洗涤2–3次。
- 每孔加入1 mL伊红染色液。在显微镜下观察染色情况，约30秒或直至达到理想的颜色强度为止。用1 mL PBS冲洗各孔2–3次。用中性树胶将盖玻片封片于载玻片上。
4. 免疫荧光染色
- 将P2细胞以每孔2 × 105 个细胞的密度接种于6孔板中，孔内预先放置无菌盖玻片。每孔加入2 mL完全培养基。
- 当细胞融合度达到约80%时，弃去培养基。取出盖玻片并置于染色缸中，用1 mL PBS洗涤3次，每次5分钟。
- 加入约50 µL透化溶液（Triton X-100 : PBS = 1 : 200），覆盖细胞。室温孵育5分钟，然后用1 mL PBS洗涤3次，每次5分钟。加入约50 µL 3% BSA封闭液，室温孵育20分钟。
- 轻轻弃去封闭液。加入约200 µL用PBS配制的一抗溶液，覆盖盖玻片：AQP4（1:100）、Kir4.1（1:200）、GS（1:200）、CRALBP（1:50）或Vimentin（1:200）。将盖玻片置于湿盒中，4 °C过夜孵育。
- 用1 mL PBS洗涤盖玻片3次，每次5分钟。
- 加入约200 µL FITC标记的羊抗兔IgG二抗17，避光室温孵育50分钟。然后用1 mL PBS洗涤3次，每次5分钟。
- 用DAPI染核10分钟，再用1 mL PBS洗涤3次，每次5分钟。
- 在载玻片上滴加一滴抗荧光淬灭封片剂，将盖玻片细胞面朝下封片。封固后在荧光显微镜下观察。
5. 流式细胞术
- 使用流式细胞术染色缓冲液将细胞浓度调整至 1.0 x 107 个细胞/mL。
- 将单细胞悬液每份 100 µL 分装至每个实验条件下的两个独立样品管中。指定其中一管作为阴性（未染色）对照。
- 向每管中加入 100 µL 通透化溶液 A（来自商品化试剂盒，参见 材料表）。轻轻混匀，并在室温避光孵育 15 分钟。
- 向每管中加入 3 mL 预冷的流式细胞术染色缓冲液。在室温下以 300 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。
- 向每管中加入 100 µL 通透化溶液 B（来自商品化试剂盒），涡旋混匀。向指定的样品管中加入 0.1 µL CRALBP 抗体，向对应的管中加入 0.8 µL GS 抗体。阴性对照管中不加任何抗体。在 4 °C 避光孵育 30–60 分钟。
- 向每管中加入 3 mL 流式细胞术染色缓冲液。在室温下以 300 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。
- 将每管重悬于 100 µL 流式细胞术染色缓冲液中。向每管 CRALBP 染色样品中加入 1 µL FITC 标记的山羊抗兔 IgG (H&L)，向每管 GS 染色样品中加入 1 µL PE 标记的山羊抗兔 IgG (H&L)。阴性对照管中不加任何抗体。在 4 °C 避光孵育 30–60 分钟。
- 向每管中加入 3 mL 流式细胞术染色缓冲液。以 300 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。
- 将每管重悬于 300 µL 流式细胞术染色缓冲液中。立即进行流式细胞术分析；或者将细胞重悬于 500 µL 1%–4% 多聚甲醛中，于 2–8 °C 避光保存，并在 24 小时内完成分析。
- 使用流式细胞术软件分析阴性和阳性样品。
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结果
原代细胞接种至培养瓶后，通过后续的换液和传代操作可去除贴壁能力较差的视网膜Müller细胞（RMCs）以及传代过程中产生的细胞碎片，从而富集培养物中的RMC群体。RMCs通过倒置光学显微镜观察其形态特征进行鉴定（图1），并采用苏木精-伊红（H&E）染色进一步确认（图2）。通过免疫荧光染色检测谷氨酰胺合成酶（GS）、波形蛋白（Vimentin）、细胞视黄醇结合蛋白（CRALBP）、水通道蛋白4（AQP4）和内向整流钾通道4.1（Kir4.1）的特异性抗体标记，以观察蛋白表达情况（图3）。此外，采用GS和CRALBP抗体标记进行流式细胞术分析，以确定RMC群体的纯度（图4）。
如图所示
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讨论
本文提供了一种从新生SD大鼠中分离原代视网膜微血管细胞（RMCs）的详细实验方案。该方案涵盖了实验前准备、眼球摘除、视网膜组织分离，以及RMCs提取、培养、传代和鉴定的逐步操作流程。同时强调了在整个细胞培养过程中需注意的关键事项，为相关研究提供了标准化的技术指导。
为提取RMC，选择3至5日龄的SD大鼠。由于该年龄段大鼠眼球体积较小，眼球分离和视网膜组织提取的操作难度显著增加，需要较高的技术水平。值得注意的是，组织体积小导致原代细胞得率较低。此外，随着传代次数的增加，细胞在培养过程中活力逐渐下降27，通常需要使用更多的实验动物才能获得后续研究所需的细胞数量。
实验动物的选择标准在不同研究之间存在显著差异：在视网膜胶质细胞研究中，出生后第1-3天的SD大鼠幼鼠已被用于建立可维持成熟星形胶质细胞表型的培养体系28，而出生后第7-10天的SD大鼠幼鼠则更适用于研究视网膜Müller细胞（RMC）向视网膜神经节细胞的转分化
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披露
所有作者均无与本文内容相关的利益冲突。
致谢
本工作得到四川省自然科学基金（2023NSFSC0690）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.1% Triton X-100 | Solarbio | T8200 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Hyclone | SH30042.01B | |
| 1% 盐酸酒精 | BIOSYSTEMS | 3803651E | |
| 4% 多聚甲醛 | Solarbio | P1110 | |
| 45μm 尼龙筛网（300目） | Solarbio | YA0926 | |
| 6孔板 | Servicebio | IMC202302001 | |
| 6 cm 玻璃培养皿 | Normax | 5058541 | |
| 75% 酒精 | KESHI | GEA004 | |
| 水通道蛋白-4（AQP4） | Proteintech Group, Inc | 16473-1-AP | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Servicebio | GC305010 | |
| 细胞培养箱 | Thermo | FORMA311 | |
| 细胞视黄醛结合蛋白（CRALBP） | HUABOI | HA721330 | |
| 离心机 | 湖南湘仪 | TDZ5-WS | |
| 超净工作台 | 智城 | ZHJH-C12 | |
| 角膜剪 | 金钟 | BXGJ | |
| DAPI | Solarbio | G1012 | |
| D-Hank 溶液 | Solarbio | H1045 | |
| DMEM 高糖培养基 | Gibco | C11995500BT | |
| 胎牛血清（FBS） | Sbjbio生命科学 | BC-SE-FBS01 | |
| FIX&PERM 试剂A | MultiSciences | GAS006/2 | |
| FIX&PERM 试剂B | MultiSciences | GAS006/2 | |
| 流式细胞术染色缓冲液 | MultiSciences | S1001 | |
| Fluoromount-G 荧光封片剂 | SourthernBiotech | 0100-01 | |
| 谷氨酰胺合成酶多克隆抗体 | Proteintech Group, Inc | PTG-11037-2-AP-50ul | |
| 山羊抗兔IgG H&L PE | Bioss | bs-0295G-PE | |
| 山羊抗兔IgG H&L FITC | Bioss | bs-0295G-FITC | |
| 苏木精-伊红（HE）染色试剂盒 | Solarbio | G1120 | |
| 高压灭菌器 | 厦门泽朗仪器有限公司 | GI80DS | |
| 倒置荧光显微镜 | Nikon | SMZ1500 | |
| 倒置相差显微镜 | Leica | DMIL | |
| 内向整流性钾通道4.1（Kir4.1） | Proteintech Group, Inc | 12503-1-AP | |
| 中性树脂 | Solarbio | G8590-100 | |
| 青霉素-链霉素溶液（100×） | Hyclone | SV30010 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS）（pH 7.2–7.4） | Solarbio | P1020-500ml | |
| 二抗（FITC标记的山羊抗兔） | Servicebio | GB22303 | |
| Sprague-Dawley 大鼠 | 成都大硕实验动物有限公司 | 生产许可证号：SCXK（四川）2020-0030 | |
| T25 培养瓶 | Cornning | 430639 | |
| Tornado 管：15 mL | WHB | WHB-15-1 | |
| Tornado 管：50 mL | WHB | WHB-50-1 | |
| 紫外消毒灭菌器 | GEMEISI | xd06 | |
| 波形蛋白（Vimentin） | Abcam | ab92547 |
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