本文介绍了一种从新生Sprague-Dawley（SD）大鼠中分离原代视网膜穆勒细胞的详细方案。该操作流程包括眼球摘除、视网膜组织解剖、细胞提取与鉴定，以及后续细胞培养的关键注意事项。
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本文内容
摘要
摘要
视网膜穆勒细胞（RMCs）在维持视网膜结构支持和调控多种视网膜功能中发挥关键作用。作为视网膜微环境的核心组成部分，RMCs执行多项重要功能。通过其丰富的离子通道、配体、受体、跨膜转运蛋白及酶系统，这些细胞参与神经递质和营养因子的分泌，调节视网膜代谢，并维持水离子稳态。值得注意的是，近期研究发现RMCs是内源性视网膜再生干细胞的重要来源，为治疗视网膜变性疾病提供了新的治疗靶点。因此，研究RMCs对于理解视网膜疾病病理机制至关重要。本研究系统建立了一套标准化实验方案，包括胰酶消化法分离与纯化原代RMCs、倒置光学显微镜和苏木精-伊红（HE）染色进行形态学观察、免疫荧光染色鉴定特异性蛋白，以及细胞纯度分析 通过 流式细胞术。本方案为与视网膜微血管细胞（RMCs）相关的基础研究和临床应用提供了有价值的参考，有助于探索其在视网膜疾病中的作用机制，并推动治疗策略的开发。
引言
视网膜穆勒胶质细胞（RMCs）是视网膜中的主要大胶质细胞，构成视网膜神经血管单元的核心1,2。RMCs 几乎贯穿整个视网膜厚度，包绕几乎所有视网膜神经元和微血管系统。其突起向上延伸至内界膜（ILM），形成顶端足突，向下延伸至外界膜（OLM），并在该处发育出特化的微绒毛3。这种独特的结构使 RMCs 能够作为视网膜组织的主要结构支架4,5。
RMC富含离子通道、配体、受体、跨膜转运蛋白和酶6，它们参与视网膜的葡萄糖代谢 通过 糖酵解7钾离子通道（Kir2.1、Kir4.1）与水通道蛋白（AQP4、AQP9、AQP11）协同调控细胞膜上的离子与水分稳态，维持视网膜生理平衡7此外，放射状胶质细胞（RMCs）能够吸收并清除神经元释放的神经递质，包括谷氨酸、γ-氨基丁酸（GABA）和甘氨酸。7,8.
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方案
所有动物实验均遵循《眼科与视觉研究中动物使用ARVO声明》的规定，并经成都中医药大学动物伦理委员会批准（伦理编号：2024069）。本研究共使用50只无特定病原体（SPF）级Sprague-Dawley大鼠（3–5日龄，性别未指定，体重7–10 g）。实验动物由商业途径获得，并饲养于成都中医药大学实验动物中心（实验动物使用许可证号：SYXK [四川] 2024-049），环境条件符合标准实验室要求。本研究中所用试剂与设备的详细信息见于 材料表.
1. 原代肾小球系膜细胞的分离与培养
- 实验物品准备
- 使用前，在超净工作台内将以下物品置于紫外线下灭菌至少30分钟：T25培养瓶、离心管及管架、移液器及支架、废液容器、打火机、酒精灯和记号笔。
- 使用前，通过高压灭菌对以下物品进行灭菌处理：1 mL移液器吸头、弯板、带盖玻璃培养皿、弯头镊子、45 µm尼龙筛网（300目）、齿状镊子、无齿镊子和微型角膜剪。
- 环境准备：对眼球解剖所用的环境和操作台进行紫外线消毒，时间超过30分钟。每次进入或离开超净工作台前，均需向实验人员手部喷洒酒精。将培养箱设置为37 °C和5% CO2。每次打开或关闭培养箱前后，均需向实验人员手部喷洒酒精。
- 溶液配制：配制D-Hank's溶液、磷酸盐缓冲液（PBS）、杜氏改良伊格尔....
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结果
原代细胞接种至培养瓶后，通过后续的换液和传代操作可去除贴壁能力较差的视网膜Müller细胞（RMCs）以及传代过程中产生的细胞碎片，从而富集培养物中的RMC群体。RMCs通过倒置光学显微镜观察其形态特征进行鉴定（图1），并采用苏木精-伊红（H&E）染色进一步确认（图2）。通过免疫荧光染色检测谷氨酰胺合成酶（GS）、波形蛋白（Vimentin）、细胞视黄醇结合蛋白（CRALBP）、水通道蛋白4（AQP4）和内向整流钾通道4.1（Kir4.1）的特异性抗体标记，以观察蛋白表达情况（图3）。此外，采用GS和CRALBP抗体标记进行流式细胞术分析，以确定RMC群体的纯度（图4）。
如图所示
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讨论
本文提供了一种从新生SD大鼠中分离原代视网膜微血管细胞（RMCs）的详细实验方案。该方案涵盖了实验前准备、眼球摘除、视网膜组织分离，以及RMCs提取、培养、传代和鉴定的逐步操作流程。同时强调了在整个细胞培养过程中需注意的关键事项，为相关研究提供了标准化的技术指导。
为提取RMC，选择3至5日龄的SD大鼠。由于该年龄段大鼠眼球体积较小，眼球分离和视网膜组织提取的操作难度显著增加，需要较高的技术水平。值得注意的是，组织体积小导致原代细胞得率较低。此外，随着传代次数的增加，细胞在培养过程中活力逐渐下降27，通常需要使用更多的实验动物才能获得后续研究所需的细胞数量。
实验动物的选择标准在不同研究之间存在显著差异：在视网膜胶质细胞研究中，出生后第1-3天的SD大鼠幼鼠已被用于建立可维持成熟星形胶质细胞表型的培养体系28，而出生后第7-10天的SD大鼠幼鼠则更适用于研究视网膜Müller细胞（RMC）向视网膜神经节细胞的转分化
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披露
所有作者均无与本文内容相关的利益冲突。
致谢
本工作得到四川省自然科学基金（2023NSFSC0690）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.1% Triton X-100 | Solarbio | T8200 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Hyclone | SH30042.01B | |
| 1% 盐酸酒精 | BIOSYSTEMS | 3803651E | |
| 4% 多聚甲醛 | Solarbio | P1110 | |
| 45μm 尼龙筛网（300目） | Solarbio | YA0926 | |
| 6孔板 | Servicebio | IMC202302001 | |
| 6 cm 玻璃培养皿 | Normax | 5058541 | |
| 75% 酒精 | KESHI | GEA004 | |
| 水通道蛋白-4（AQP4） | Proteintech Group, Inc | 16473-1-AP | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Servicebio | GC305010 | |
| 细胞培养箱 | Thermo | FORMA311 | |
| 细胞视黄醛结合蛋白（CRALBP） | HUABOI | HA721330 | |
| 离心机 | 湖南湘仪 | TDZ5-WS | |
| 超净工作台 | 智城 | ZHJH-C12 | |
| 角膜剪 | 金钟 | BXGJ | |
| DAPI | Solarbio | G1012 | |
| D-Hank 溶液 | Solarbio | H1045 | |
| DMEM 高糖培养基 | Gibco | C11995500BT | |
| 胎牛血清（FBS） | Sbjbio生命科学 | BC-SE-FBS01 | |
| FIX&PERM 试剂A | MultiSciences | GAS006/2 | |
| FIX&PERM 试剂B | MultiSciences | GAS006/2 | |
| 流式细胞术染色缓冲液 | MultiSciences | S1001 | |
| Fluoromount-G 荧光封片剂 | SourthernBiotech | 0100-01 | |
| 谷氨酰胺合成酶多克隆抗体 | Proteintech Group, Inc | PTG-11037-2-AP-50ul | |
| 山羊抗兔IgG H&L PE | Bioss | bs-0295G-PE | |
| 山羊抗兔IgG H&L FITC | Bioss | bs-0295G-FITC | |
| 苏木精-伊红（HE）染色试剂盒 | Solarbio | G1120 | |
| 高压灭菌器 | 厦门泽朗仪器有限公司 | GI80DS | |
| 倒置荧光显微镜 | Nikon | SMZ1500 | |
| 倒置相差显微镜 | Leica | DMIL | |
| 内向整流性钾通道4.1（Kir4.1） | Proteintech Group, Inc | 12503-1-AP | |
| 中性树脂 | Solarbio | G8590-100 | |
| 青霉素-链霉素溶液（100×） | Hyclone | SV30010 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS）（pH 7.2–7.4） | Solarbio | P1020-500ml | |
| 二抗（FITC标记的山羊抗兔） | Servicebio | GB22303 | |
| Sprague-Dawley 大鼠 | 成都大硕实验动物有限公司 | 生产许可证号：SCXK（四川）2020-0030 | |
| T25 培养瓶 | Cornning | 430639 | |
| Tornado 管：15 mL | WHB | WHB-15-1 | |
| Tornado 管：50 mL | WHB | WHB-50-1 | |
| 紫外消毒灭菌器 | GEMEISI | xd06 | |
| 波形蛋白（Vimentin） | Abcam | ab92547 |
参考文献
- Bringmann, A., Pannicke, T., Grosche, J., et al. Müller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
- Kugler, E. C., Greenwood, J., MacDonald, R. B. The "neuro-glial-vascular" ....
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重印与许可
