大鼠左前降支冠状动脉结扎建立闭塞性心肌梗死模型

摘要

该方案展示了通过永久性结扎大鼠左前降支冠状动脉来建立心肌梗死（MI）模型的方法。心肌梗死后动物的存活对于挽救缺血区的心肌细胞、防止梗死区域扩展以及减轻心肌梗死后炎症和纤维化至关重要。

摘要

心血管疾病（CVD），包括缺血性心脏病和中风，是全球范围内导致死亡和疾病负担的主要原因。心肌梗死是缺血性心脏病的一种临床综合征，由持续缺血引发。缺血心肌会发生功能、代谢和结构上的改变，导致部分心肌因坏死而出现不可逆损伤。心肌梗死的实验模型对于理解梗死发生期间及之后的急性和慢性细胞、分子及形态学变化，以及开发和优化新的治疗靶点或策略至关重要。采用永久性结扎左前降支冠状动脉（LAD）的小动物手术模型，其病理特征与人类心肌梗死高度相似。本研究旨在建立一种在大鼠中通过永久性闭合LAD冠状动脉来诱导心肌梗死的手术模型。实验方案包括：腹腔注射氯胺酮80 mg/kg和赛拉嗪12 mg/kg进行麻醉诱导，使用耳镜引导插入气管导管进行气管插管，无需气管切开，在呼吸机辅助通气过程中应用外源性呼气末正压（PEEP）以防止肺泡塌陷。采用限制术中骨骼肌损伤的开胸术式。该方法具有微创性、可重复性强，并能降低术后死亡率。在本模型中，动物在心肌梗死后存活4天，以研究短期病理生物学变化，主要包括梗死后炎症反应、作为梗死愈合自然过程的血管生成，以及最终在梗死心肌中形成的纤维化。

引言

心血管疾病（CVD）主要包括缺血性心脏病（IHD）和脑卒中，是全球范围内导致死亡和疾病负担的主要原因。根据世界心脏联盟的数据，2021年有2050万人死于心血管疾病^1,2。心肌梗死（MI），也称为心肌梗塞或心脏病发作，是缺血性心脏病的一种急性临床综合征。在心肌梗死过程中，心肌组织因长时间缺血而遭受不可逆损伤，这种缺血通常由冠状动脉内破裂的动脉粥样硬化斑块表面形成闭塞性血栓所致³。

通过经皮冠状动脉介入治疗（PCI）或溶栓药物及时恢复血流是挽救缺血心肌、防止坏死的主要治疗方法^3,4。 在发达国家，由于PCI的广泛应用，心肌梗死（MI）后的死亡率已有所下降，但在南亚等发展中国家，心肌梗死的发病率却在上升⁵。心肌梗死后，发生坏死的心肌组织周围存在可逆性损伤的心肌细胞区及缺血区。缺血心肌在心肌梗死后会发生心室重构，导致心室扩张和功能障碍，最终进展为心力衰竭⁶。

目前，大量研究正在致力于通过干细胞治疗促进受损心肌细胞的再生⁷，以及通过刺激缺血区域内的血管生成来促进心肌修复⁸。然而，这两种方法要实现临床成功，仍需在策略上进行显著改进。因此，模拟心肌梗死或缺血的实验模型对于理解MI期间及之后发生的病理、细胞、分子和形态学变化至关重要，从而识别并优化可用于临床转化的新型治疗靶点或治疗策略。在本研究中，通过在大鼠中不可逆地结扎左前降支（LAD）冠状动脉，建立了一种心肌梗死的实验模型。首先，在麻醉动物中实施气管插管，无需气管切开，在呼吸机辅助通气下施加外源性呼气末正压（PEEP），以防止肺不张（肺部气囊塌陷/萎缩）。采用微创手术方式打开胸腔，避免手术过程中对骨骼肌造成损伤。结扎位置位于LAD的第一对角支起始处，可产生充分的梗死区域，并模拟闭塞性心肌梗死（OMI）的临床状况。由于结扎部位位于LAD中段，术后死亡率及术后并发症均较低⁹。在该模型中，动物在MI后存活4天，以研究MI后心肌组织发生的短期变化，并识别治疗MI的新型靶点和策略。

方案

实验操作在获得机构动物伦理委员会（IAEC）批准后按照既定方案进行［方案编号：(IAEC/KCP/2023/009)］。在实验动物的饲养与管理过程中，遵循印度环境、森林与气候变化部下属的实验动物使用控制与监督委员会（CCSEA）的相关指导原则。

1. 麻醉与气管插管（持续时间：10-15 分钟）

1. 使用任一性别的Wistar大鼠，体重200–240 g，年龄超过6个月。记录大鼠体重。根据体重通过腹腔注射途径给予氯胺酮（80 mg/kg）和赛拉嗪（12 mg/kg）进行麻醉。
   注意：氯胺酮是一种分离麻醉剂，可快速诱导麻醉，但仅产生部分肌肉松弛作用¹⁰因此，它常与赛拉嗪联合使用，以产生肌肉松弛并达到外科麻醉状态。¹¹.
2. 捏住尾巴以确认麻醉程度。如果大鼠出现反射反应，追加1/3剂量的麻醉剂^rd 氯胺酮剂量。将加热垫连接至呼吸机，并放置于手术台上，以提供恒温加热。
3. 将大鼠置于加热垫上，保持仰卧位（图1A用胶带固定大鼠，使其保持该体位，并将手术台调整为倾斜位置。
4. 调整呼吸机呼吸参数：潮气量为 8 mL/kg（2-3 mL/min），呼吸频率为 77 次/分钟（bpm），峰压（吸气峰压）为 15 cm H₂O₂O. 为防止肺塌陷，将呼气末正压（PEEP）调整至 2 cm H₂O₂O.
5. 进行气管插管时，用钝头镊子夹住舌头并抬起。插入耳镜（图1B）置于口腔内以观察声带并插入气管插管（图1B 和 图2A）通过声带。为了清晰观察会厌，应从上方将手电筒的光线投射到喉部周围。
6. 将气管插管与呼吸机管路连接（图1A 和 图2B）并观察胸部运动以确认插管正确。若腹部膨胀，提示可能存在食管插管，应按照步骤1.8重新进行插管。
7. 所有准备工作完成后，使用手术体视显微镜进行LAD结扎图1A，并在手术过程中使用加热灯以维持大鼠体温在37 °C。
8. 将脱毛膏涂抹于大鼠颈部及胸部区域，静置10–20分钟。轻轻去除从颈部至胸部区域的大鼠毛发。

2. 心肌梗死的手术诱导（持续时间：20 - 25 分钟）

1. 使用镊子提起剑突处的皮肤，在剪刀的辅助下做一约1 cm的小切口，随后从剑突开始沿纵行方向剪开，朝向胸锁乳突肌方向延伸。
   1. 避免损伤筋膜，以防引起严重出血。若出现出血，应用包裹的擦拭巾轻轻按压出血区域。
2. 从胸锁乳突肌的基底部至第5^th- 6^th 肋骨，沿胸骨左侧切开筋膜和胸肌。
3. 使用镊子在第3处进行穿刺^rd 和 4^th 肋间隙向胸骨左侧穿孔，注意不要损伤心脏或肺组织（孔径约6-8 mm）。此步骤应使用PEEP。
4. 使用肋骨剪钳剪切4^th, 5^th，以及6^th 肋骨连同肋间肌一起分离，并用镊子剥离剩余的肋间肌（图2C).
5. 轻轻插入肋骨牵开器，以撑开肋骨并暴露心脏（图 2D）。为了清晰观察左心房，使用镊子和弯剪从心脏前侧分离心包和胸腺。
6. 确定左前降支（LAD）冠状动脉的位置，以便用缝线进行结扎。
   1. 仔细去除心包膜后，辨认左前降支（LAD），其为一条明显的浅表动脉，沿室间沟从心脏基底部斜向延伸至心尖。LAD分为两组分支：第一组为穿隔支（S1和S2），穿透室间隔；第二组为对角支（D1和D2），穿行于左心室前壁。
   2. 确定前降支（LAD）的三个区域，即近段、中段和远段。近段LAD：从LAD起始处至第一分支的区域，该分支可为室间隔支或对角支；中段LAD：第一分支至第二对角支之间的区域；远段LAD：第二对角支以远的区域称为远段LAD。图2E).
   3. LAD表现为一条搏动性的红褐色动脉，管壁较厚。为确认其位置，可用显微镊轻轻按压，可触及搏动。
7. 使用持针器在第一对角支D1起源附近的前降支中段位置穿入8-0丝线，轻轻牵拉缝线，实现前降支的永久性闭合，注意避免对心脏造成损伤图2E).
8. 使用镊子打两个方向相同的结扎结（外科结）。借助镊子向两侧反复打结，以加固结扎线。

3. 假手术

1. 执行步骤 2.1-2.6。行左侧开胸术后，暴露心脏，穿过一条丝线，置于左前降支冠状动脉（LAD）下方但不结扎。

4. 给药治疗药物（持续时间：2-5 分钟）

1. 结扎LAD后，立即通过尾静脉向治疗组静脉注射多沙唑嗪，剂量为0.06 mg/kg（图3）

5. 手术后的胸腔闭合（耗时：5 分钟）

1. 移除牵开器，使肋骨和肋间肌恢复至原始位置。使用6-0丝线缝合左侧和右侧肋间肌以关闭胸腔。用4-0 Prolene缝线缝合皮肤（图2F）。

6. 术后护理与监测（持续时间：40 分钟 - 60 分钟）

1. 观察大鼠从麻醉中恢复的过程，持续40分钟或更长时间。通过提起或轻捏尾巴来确认其是否完全恢复。
2. 暂时断开呼吸机连接，通过观察胸廓区域的正常运动，确认大鼠已恢复自主呼吸。
3. 关闭呼吸机并拔出气管插管。拆除固定四肢的胶带。
4. 通过腹腔注射曲马多（12.5 mg/kg），以缓解术后疼痛。
5. 将大鼠置于加热垫上，维持体温在37 °C至少30分钟。持续监测大鼠是否出现任何病态情况，例如呼吸不规则或困难，或梗死的危险征象。
6. 当大鼠能够自由活动时，可认为其已完全从麻醉中恢复。即使大鼠尚不能自主移动，也应在脱离呼吸机后45分钟内将其放入笼中。
7. 在术后的前4天内每日观察大鼠。第4天时，使用CO₂安乐死舱处死大鼠。

7. 心肌梗死生化标志物的分析

1. 术后6小时和4天采集动物血样，检测肌钙蛋白水平，作为心肌梗死的生物标志物。
   1. 样本采集与制备：心肌梗死后6小时，通过尾静脉采集200 µL血液样本，置于经EDTA或肝素涂层处理的试管中；心肌梗死后4天，通过眶后穿刺采集1 mL血液。
      注：肌钙蛋白T检测优先使用抗凝全血样本。
   2. 使用试剂盒中提供的移液管和一次性定量注射器，将150 µL样本加入检测试纸条中。
   3. 室温孵育15–20分钟，随后在15–20分钟内根据检测区是否出现信号线（红色线条）判读结果。判读标准如下：仅质控线显色，检测线无显色 = 阴性；检测线与质控线均显色 = 阳性（图6B）。
2. 使用标准F分析仪检测血清样本中的肌钙蛋白I（Troponin I）。
   1. 样本采集与制备：心肌梗死后6小时，通过尾静脉采集200 µL血液样本，置于经EDTA或肝素涂层处理的试管中；心肌梗死后4天，通过眶后穿刺采集1 mL血液。
   2. 检测前使试剂盒和血液样本恢复至室温。检查铝箔袋背面的有效期。打开铝箔袋，取出检测装置（图4）。
   3. 将检测装置插入分析仪的检测插槽中。分析仪读取条形码数据，并确认检测装置有效（图4）。
   4. 使用固定体积移液滴管（100 µL）吸取100 µL样本，将样本加入萃取缓冲液管中，随后丢弃已使用的固定体积移液滴管（100 µL）。
   5. 用一次性移液滴管（100 µL）将样本与缓冲液混合2–3次，然后吸取100 µL混合样本。
   6. 将样本加入检测装置的加样孔后，立即按下分析仪上的开始检测按钮。分析仪将在10分钟内自动显示检测结果。
      注：若样本中存在肌钙蛋白I（TnI），其将与铕微粒结合。该复合物会被检测线上的捕获抗体捕获，荧光强度由分析仪检测。

8. 梗死面积的分析

1. 在大鼠发生梗死后的第4天处死，采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色的宏观方法测定梗死面积。
   1. 从动物体内取出心脏，并在4 °C下保存过夜。切除双侧耳廓、主动脉根部及右心室。使用手术刀将冷冻的左心室切成2–4 mm厚的切片。将心室切片在37 °C条件下，置于1% TTC溶液（用pH 7.8的0.1 M Tris缓冲液配制）中孵育20分钟。
   2. 分析染色结果：存活的心肌组织含有脱氢酶及其辅因子NADH，可与TTC反应生成甲臜而呈现砖红色；而发生梗死的心肌区域则无染色，保持无色。
2. 采用容积法测定梗死区域。
   1. 将心室切片置于两片玻璃载片之间，并在其上覆盖带有100个1 cm²方格的透明塑料网格。
   2. 通过计数切片两侧所覆盖的方格数，计算每个心室切片的平均面积。同样，分别计数两侧染色区域和未染色区域所占的方格数。未染色的暗黄色区域代表梗死部分，红色区域代表存活部分。
   3. 以梗死体积占左心室总体积的百分比（%LVV）表示梗死面积。

9. 组织病理学分析

1. 苏木精-伊红染色
   1. 为获取组织病理学结果，在左前降支（LAD）结扎术后第4天处死动物，取出心脏，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）冲洗，并立即置于10%福尔马林溶液中固定。
   2. 通过一系列浓度递增的酒精（70%、80%、95%、95%和无水酒精）对组织进行脱水处理，持续1小时，以去除组织中的水分并使酒精渗入组织内部。随后将组织浸入二甲苯中以清除酒精。
   3. 完成透明处理后，用镊子将组织转移至不锈钢模具中的熔融石蜡中。透明剂逐渐扩散出来，熔融石蜡则渗入组织内部。将模具置于冷台上冷却，使石蜡凝固。待石蜡完全冷却硬化（约30分钟）后，即可轻松从模具中取出石蜡块。
   4. 使用切片机将包埋有组织的石蜡块切成4 µm厚的切片。将石蜡切片带放入40–45 ˚C的水浴中展平，然后贴附于载玻片上，空气干燥或轻微加热干燥。随后用二甲苯脱蜡，并依次用无水乙醇和水进行再水化处理。
   5. 用苏木精染色15分钟。染色后用水冲洗切片，并用1%酸性酒精溶液处理20秒。
   6. 再次用水冲洗后，用伊红复染液（1%伊红水溶液）染色2分钟。在显微镜下观察切片，于10×和40×放大倍数下评估组织病理学变化。
2. 马松三色染色
   1. 配制以下试剂。
      1. 波因氏液（Bouin's Solution）：加入75 mL饱和苦味酸溶液、25 mL 40%甲醛溶液和5 mL冰醋酸。魏格特氏铁苏木精溶液（Weigert's Iron Hematoxylin Solution）：配制储备液A，含1 g苏木精溶于100 mL 95%酒精中；配制储备液B，含29%三氯化铁4 mL、浓盐酸1 mL和蒸馏水95 mL。使用时取等体积的储备液A与B混合。该混合液稳定性不超过3个月。
      2. 比布里希猩红-酸性品红溶液（Biebrich Scarlet-Acid Fuschin Solution）：加入90 mL 1%比布里希猩红水溶液、10 mL 1%酸性品红水溶液和1 mL冰醋酸。磷钼酸-磷钨酸溶液（Phosphomolybdic-Phosphotungstic Acid Solution）：加入25 mL 5%磷钼酸溶液和25 mL 5%磷钨酸溶液。苯胺蓝溶液（Aniline Blue Solution）：将2.5 g苯胺蓝和2 mL冰醋酸加入100 mL蒸馏水中。1%冰醋酸溶液。
   2. 使用二甲苯对石蜡包埋的心脏切片进行脱蜡，随后用不同浓度的酒精进行再水化。
   3. 将心脏切片置于波因氏液中，在56 °C孵育30分钟，以增强最终染色强度。然后用流水冲洗切片，直至黄色完全去除。
   4. 用苏木精染色1分钟，随后用流水冲洗2–3分钟。再用比布里希猩红-酸性品红溶液染色15分钟。
   5. 用5%磷钼酸-磷钨酸溶液分化5–8分钟。直接将切片转移（无需冲洗）至苯胺蓝溶液中染色6–8分钟。
   6. 用蒸馏水冲洗，然后用1%醋酸溶液进行分化处理。依次用95%乙醇脱水、二甲苯透明，封片后在显微镜下观察¹²。

结果

在涉及开胸胸外科手术的大鼠LAD结扎术过程中，气管插管是辅助通气所必需的。手术前通过基础呼吸参数确认插管成功，并在手术过程中维持稳定的呼吸频率、潮气量和每分钟通气量（图5）。

通过评估心肌损伤的生物化学标志物心肌肌钙蛋白T和肌钙蛋白I、测量梗死面积以及观察组织病理学变化，确认了左前降支结扎手术的成功¹³。心肌肌钙蛋白（cTn）蛋白与肌动蛋白丝相互作用，调节心肌的收缩与舒张。心脏中存在两种肌钙蛋白同工型，即肌钙蛋白I（cTnI）和肌钙蛋白T（cTnT），当心肌细胞受损后，这两种蛋白会释放入血¹³。肌钙蛋白T（cTnT）水平使用TropT定性试剂盒进行检测。该试纸条包含两种单克隆抗体，其中一种为胶体金标记，另一种为生物素标记的特异性抗肌钙蛋白T（cTnT）抗体，二者与血液样本中的肌钙蛋白形成夹心复合物。当肌钙蛋白T浓度超过0.1 ng/mL时，cTnT夹心复合物在检测线上聚集，形成一条红色检测线，表明结果为阳性。过量的胶体金标记抗体...

讨论

本研究通过永久性结扎大鼠的左前降支冠状动脉（LAD）来诱导心肌梗死。在该手术方案中，通过腹腔注射给予80 mg/kg的麻醉剂氯胺酮，可快速诱导麻醉；同时腹腔注射12 mg/kg的赛拉嗪，可产生充分的肌肉松弛，从而有效促进整个手术过程，并在术后短时间内实现平稳恢复，且副作用最小。既往研究已建立过类似的麻醉方案，仅氯胺酮和赛拉嗪剂量有所不同，例如给予80 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg赛拉嗪，可产生足以完成心肌梗死诱导手术所需的麻醉深度，并在大鼠心肌梗死后获得较高的存活率^15,16。气管插管的成功实施是将大鼠仰卧于倾斜手术台上，并置于加热垫上，使用检耳镜在手电筒照明下观察声门后完成的。在一项先前的研究中，Kastl 等人证明，将动物置于倾斜的金属板上，并借助检耳镜观察声门，有助于顺利完成插管¹⁷。

在该技术中，通过加热垫持续加温，并通过连接在加热垫上的温度传感探头经呼吸机进行温度监测，这对LAD结扎手术全过程的成功至关...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
18号静脉套管针	Kent scientific, US
20号静脉套管针	Kent scientific, US
4-0 聚丙烯缝合线	Khanna Surgical
6-0 丝线缝合线	Nanak Surgical
8-0 丝线缝合线	Nanak Surgical
阿登镊	Nanak Surgical
麻醉设备	Orchid Scientific
麻醉诱导舱	Orchid Scientific
弯剪	Nanak Surgical
气管插管导管	Kent Scientific, US
脱毛膏	Nanak Surgical
加热垫	Kent scientific, US
钩状镊	Nanak Surgical
氯胺酮			由阿姆利则KVAS赠送样品
微型持针器	Nanak Surgical
丁腈手套	Nanak Surgical
手术台
耳镜	Nanak Surgical
佩恩镊	Nanak Surgical
肋骨牵开器	Nanak Surgical
直头镊子	Nanak Surgical
直头剪钳	Nanak Surgical
外科手术帽	Nanak Surgical
外科口罩	Nanak Surgical
手术体视显微镜	Olympus Magnus	24B1187	带臂架立柱的立体变倍MSZ-TR显微镜，变倍比：1:7，物镜变倍范围：0.65 - 4.5倍，目镜10倍/22 mm，使用10倍目镜时放大倍数为6.5 - 45倍，配备LED环形照明
无齿镊	Nanak Surgical
曲马多			由阿姆利则Amandeep医院赠送样品
镊子	Nanak Surgical
呼吸机	RoVent (Kent Scientific,  US)	RV-04-220	具备容量和压力控制功能以及温度加温和监测功能的自动呼吸机
赛拉嗪			由阿姆利则KVAS赠送样品