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方法文章

无需麻醉的自由游动斑马鱼心跳测量

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DOI：

10.3791/68145

⸱

2025年4月18日

 ,  ,  , 
1Scientific and Technological Centre of Unique Instrumentation of RAS, 2Moscow State University, 3Cherepovets State University, 4Papanin Institute for Biology of Inland Waters RAS

本文内容

摘要

本研究旨在开发一种无需麻醉即可对运动中的斑马鱼进行心跳测量的技术。我们的方法结合了短波红外成像与基于机器学习的心脏追踪技术。该技术具有无创性、无需标记且操作简便的优点，适用于多种基于斑马鱼模型的研究。

摘要

斑马鱼（Danio rerio）因其与人类高度相似的遗传背景以及透明的胚胎阶段，成为生理学、药理学和毒理学研究中广泛使用的模式生物，其透明性有利于开展无创心血管研究。然而，目前斑马鱼心率检测方法通常依赖麻醉以固定个体，但麻醉会引发生理状态改变，从而影响数据的准确性和可重复性。本研究提出一种新型的、无需麻醉的自由活动斑马鱼幼鱼心跳测量技术，解决了心血管研究中的一个关键局限。该方法结合短波红外成像与基于机器学习的心脏追踪技术，实现了对未固定样本心脏活动的精确、连续监测。通过训练卷积神经网络识别心脏区域，并从图像序列中提取光电容积脉搏波信号以确定心率。实验验证表明，该方法在多种测试条件下均具有良好的可靠性与一致性。该技术的关键优势在于能够维持斑马鱼自然的生理状态，显著减少由应激引起的人工假象。这种无创、免标记的技术在心血管生理学、药物心脏毒性及环境毒理学研究中具有显著优势，进一步拓展了斑马鱼作为生物医学研究模型的应用潜力。

引言

斑马鱼（Danio rerio）是一种小型鲤科鱼类，因其体型小、繁殖率高且易于进行遗传操作，已成为不可或缺的模式生物1,2,3。在生理学、胚胎学、毒理学及其他领域中，对透明斑马鱼胚胎心率的评估正日益广泛应用4,5,6,7,8。一方面，这一应用得益于斑马鱼基因组中包含与人类心血管疾病相关的基因9，且Danio rerio的心脏在结构和信号通路上与人类具有相似性10,11，使其成为研究心脏发育和疾病的宝贵模型11,12,13。另一方面，斑马鱼的心率对外界影响敏感，因此通过比较经处理与未经处理个体的心脏功能，可将其作为生理学和毒理学研究的优良模型7,8,14。

在开发用于评估透明鱼胚心率的非侵入性光学方法方面已取得显著进展15,16。这些技术具有可从大量样本中快速收集数据的优势。因此，已开发出用于鱼胚心率评估的全自动方法4,5,6,17。

然而，目前某些局限性限制了这些技术的应用仅限于受精后3-4天（dpf）的时期。第一个局限性是由于鱼体色素沉着导致透明度下降。第二个局限性是胚胎随时间推移活动性逐渐增强。若能延长斑马鱼早期发育过程中光学成像技术可应用的时间窗口，将提升其应用价值，从而实现长期实验设计，用于研究心肌病、先天性心脏缺陷以及各种对心血管系统的影响，包括追踪效应随时间变化的动力学过程。我们课题组近期通过采用900-1700 nm短波红外波段成像，解决了透明度下降的问题18。本文则重点解决胚胎活动性的问题。

通常，在对自由游动的鱼类胚胎和幼体进行成像前，会使用三卡因甲磺酸盐（MS-222）等麻醉剂使其 immobilize14,19,20。然而，MS-222 会显著降低心率21,22，其他麻醉剂也有类似效应23。因此，难以判断所观察到的心功能变化是源于实验处理、麻醉剂本身，还是二者之间的相互作用。另一种延长胚胎低活动期的方法是在早期发育阶段降低温度8。但该方法并不总是与研究目标相容，且仅能轻微延长可记录时间。

本研究介绍了一种解决在记录心率过程中胚胎移动问题的新方法。我们训练了一个卷积神经网络，用于识别自由游动的斑马鱼胚胎视频中感兴趣的心脏区域。利用该区域内像素强度的周期性变化，提取光电容积脉搏波（PPG），并进一步计算心率。所开发的桌面应用程序AutoHR结合了神经网络训练与图像序列处理功能，确保了操作简便性和实验方案的可重复性。

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方案

斑马鱼的繁殖和饲养均按照既定的ZFIN方案进行24。所有实验程序均经俄罗斯科学院独特仪器科技中心（STC UI RAS）生物伦理委员会批准，批准号 #3/24，批准日期为2024年8月21日，并遵循STC UI RAS的斑马鱼护理指南。个别版本的操作手册可根据要求提供。

1. 测量设备的准备

  1. 设备选择
    1. 选择光源：选择一个发射近红外光的LED光源，波长范围从800 nm开始，最小输出功率为3 W。本研究使用的LED中心波长为940 nm，带宽为40 nm。
    2. 选择摄像机：选择配备对光源发射波长范围敏感的传感器、帧率至少为60 fps的摄像机。参考摄像机的数据手册以确定像素间距p、传感器短边尺寸h以及帧率。本研究中，摄像机的像素间距为p = 5 µm，传感器宽度h = 5.12 mm。
    3. 选择琼脂糖模具尺寸，其尺寸应至少为幼体B长度的1.5倍。使用提供的表达式计算光学系统的最小和最大允许放大倍数。确保Mmax ≤ Mmin。若该条件不满足，则选择具有更大h和/或更小S的摄像机。
      工程应用中最小力矩的静态平衡公式，带注释的方程。
      最大扭矩方程 \(M_{max} = \frac{h}{S_{max}}\)，公式，静态平衡研究
      其中Smax为模具组中最大琼脂糖模具的长度。可准备一组不同尺寸的模具。本研究使用了S = 10 mm。
      注：这些方程基于光学系统几何结构和斑马鱼身体比例推导得出。详细解释见讨论部分。
    4. 选择镜头：本研究使用了一个放大倍数可变的光学系统，放大倍数范围从MOSmin = 0.4x到MOSmax = 1.5x，最大焦距fmax = 150 mm，工作距离为 mm。
      注：符号x表示光学系统的放大倍数因子。
      1. 选择一种具有可变放大倍数的显微镜型系统，其放大倍数范围（MOSmin - MOSmax）应处于允许范围（Mmin - Mmax）之内。参考镜头数据手册以确定最大焦距fmax以及对应于MOSmax的工作距离L。
      2. 确保满足条件fmax ≤ Mmax • L。若该条件不满足，则选择具有不同fmax和/或L的镜头。确保摄像机和镜头的安装接口类型兼容。
    5. 选择一个已知节距、总长度至少为的测试物体（标尺或网格）。选择一个呈标尺或网格形式、已知节距且总尺寸至少为Smax的测试物体。
  2. 图像采集支架的组装（图1）。
    1. 将圆杆安装在稳定基座上。通过将镜头连接到摄像机来组装成像系统。将成像通道安装在圆杆上，输入窗口朝上。
    2. 将聚焦机构安装到圆杆上。将带有最小直径为30 mm玻璃工作面的载物台连接到聚焦机构上。
    3. 组装照明器：将LED放置在金属基板上以确保高效散热。在距离LED 30 mm处放置一个直径为23 mm、焦距为30 mm的平凸准直透镜。
    4. 使用三轴可调支架将照明器安装在载物台上，将其置于工作面上方，透镜朝下。
    5. 调整照明器和成像系统。使照明器与成像系统同轴对齐。打开照明器并将摄像机连接至计算机。
    6. 启动摄像机应用程序，并按照摄像机手册中的说明启用预览模式。将测试物体放置在载物台上。调整显微镜的工作距离和放大倍数，以确保物体尺寸完全位于视场范围内。
      注：尺寸应完全适配于图像帧的短边，以确保琼脂糖模具的完整可视化。
    7. 调整载物台相对于成像系统的位置，以确保图像聚焦清晰，并使照明器的光照均匀。
  3. 琼脂糖模具的制备
    1. 将20 mL蒸馏水与0.4 g低熔点琼脂糖混合，并加热至琼脂糖完全溶解。例如，在700 W功率下微波加热20秒。
    2. 成型琼脂糖模具（方法1）：将加热后的溶液倒入培养皿中，确保溶液高度为1.5–2 mm。冷却培养皿直至琼脂糖溶液凝固。在17 °C温度下，此过程约需5分钟。使用文具刀切割出边长为的正方形，并小心移除划定区域内的琼脂糖层。
    3. 成型琼脂糖模具（方法2）：用塑料制作尺寸为(S) × (S) × 10 mm的模具。将打印好的模具方形面朝下放入培养皿中，并注入加热后的溶液，确保溶液高度为1.5–2 mm。冷却培养皿直至琼脂糖溶液凝固，然后小心地从凝固的琼脂糖中取出模具。
      注：模具可使用3D打印机轻松打印。

2. 图像采集

  1. 调整图像采集设置。
    1. 将相机连接到计算机。启动相机应用程序并启用预览模式。打开照明光源。
      注意：如果所使用的琼脂糖模具尺寸与步骤 1.3.3 中的不同，请重复步骤 1.3.3，并在之后将测试物体从载物台上移除。
    2. 使用巴斯德移液管将斑马鱼幼鱼放入琼脂糖模具中。将琼脂糖模具放置在载物台上。通过调节曝光时间和照明光源功率的组合，确保幼鱼头部几乎完全被照亮（图 2A-C）。曝光时间不应超过 1.5 ms。
      注意：本研究中展示的数据来自受精后 12 至 21 天（dpf）的野生型斑马鱼幼鱼。
  2. 进行图像采集
    1. 将帧率设置为至少 60 fps。将图像位深度设置为 12 位。至少采集 10 秒的图像。将帧命名格式设置为 yyyy_mm_dd_hh_ss_mm_mss，文件类型必须为 PNG 或 TIFF，不能为 BMP。

3. 训练神经网络 用于标记

  1. 数据标记前的准备
    注意：此处描述的是在 MATLAB 的图像标注器应用程序（Image Labeler App）中进行标注的过程。
    1. 在单独的目录中收集至少 256 张已获取的图像。运行应用程序，通过导航导入图像 导入 > 从文件 并选择指定目录中的所有图像。
    2. 创建用于网络标注的类别。在 ROI 标注标签页中，点击 标记，进入体内的 标签名称 领域，选择 像素标签 从标签类型下拉菜单中选择，并单击 好的在“感兴趣区域标签”选项卡中，单击 标记，输入眼睛在 标签名称 领域，选择 像素标签 从标签类型下拉菜单中选择，并单击 好的在“感兴趣区域标签”选项卡中，单击 标记，将鱼放入 标签名称 领域，选择 矩形 从标签类型下拉菜单中选择，并单击 好的.
  2. 帧的标记
    1. 在 ROI 标签选项卡中，选择先前创建的标注类别“eye”。使用鼠标左键沿样本一只眼睛的边缘逐点绘制轮廓。要完成眼睛的标注，请单击轮廓的起始点（图3B).
    2. 以与步骤 3.1.2 中所述相同的方式勾勒出标本的另一只眼睛。
    3. 在 ROI 标签选项卡中，选择已创建的标注类别“body”。使用鼠标左键在标本轮廓上逐点点击，标出其身体部分（不包括眼睛）。要完成眼睛的标注，请点击 大纲的起点.
    4. 在 ROI 标签选项卡中，选择先前创建的标注类别“fish”。通过绘制一个矩形边界框来勾勒出样本的整个身体图4）。为此，请单击 一个角落 用鼠标左键点击预定矩形的一个角点，然后按住按钮拖动光标，直至矩形完全包围鱼体。
    5. 将轮廓保存到名为 images 的新目录中，方法是单击 导出 > 归档 在“标签”选项卡中。
  3. 准备用于神经网络训练的数据集
    1. 启动 MATLAB。打开脚本文件 DatasetsPreparation.m（补充文件 1) 通过选择 开放 > 打开.
    2. 单击运行脚本 运行在弹出窗口中，选择包含已标注图像的目录、PixelLabelData 文件夹以及在步骤 3.2.5 中导出的文件 gTruth.mat。
      注意：脚本执行完成后，将自动生成两个文件夹——RPN Training 和 CNN Training。这两个文件夹是后续神经网络训练所必需的。请勿修改这些文件夹中的内容。

4. 训练神经网络 用于心脏检测

注意：此步骤针对特定年龄和成像条件仅执行一次。强烈建议使用 NVIDIA GPU 进行训练，因为它可显著加快处理速度。

  1. 启动 AutoHR 应用程序。转到区域建议网络训练选项卡。点击选择目录，并选择在步骤 3.3.2 中创建的RPN 训练文件夹。点击开始训练。
    注意：训练完成后，将在与 AutoHR.exe 文件相同的目录中生成一个名为 rpn_model.pt 的模型文件。该文件是后续图像堆栈处理所必需的。
  2. 要训练卷积神经网络，请转到卷积神经网络训练选项卡。点击选择目录，并选择在步骤 3.3.2 中创建的CNN 训练文件夹。点击开始训练。
    注意：训练完成后，将在与 AutoHR.exe 文件相同的目录中生成一个名为 model.pt 的模型文件。该文件是后续图像堆栈处理所必需的。

5. 心率定量分析

  1. 按照步骤2所述记录一系列图像。确保成像条件（如放大倍数、曝光时间及照明）与用于训练神经网络时的条件完全相同。
  2. 启动AutoHR应用程序，进入“Processing”（处理）选项卡。点击Choose Models以选择包含已训练神经网络模型的目录。点击Choose Folder导入待分析的图像数据。导出路径将自动指定，但您可通过点击Choose Export Path进行更改。点击Process以开始分析。
    注意：分析完成后，心率值将显示在AutoHR界面的Heart Rate（心率）字段中。导出的文件夹将包含心率值（.xlsx）、PPG信号数据（.xlsx）、图像序列的第一帧，以及第一帧对应的躯体和眼部掩膜图像（.png）。

6. 算法结果的验证

  1. 按照以下步骤对静止的鱼进行测试。
    1. 用 0.168 mg/L 的 MS-222 溶液对幼鱼麻醉 1 分钟。按照步骤 2 所述方法获取麻醉后样本的图像序列。通过视觉观察进行心率计数。
    2. 按照步骤 5 所述使用心率分析软件。对多个样本重复上述步骤。验证在目标精度范围内，所有个体获得的心率数值是否一致。
  2. 按照以下步骤对活动个体进行测试，并实施刺激试验。
    1. 按照步骤 2 所述方法获取未麻醉样本的图像序列。对记录序列的个体实施刺激试验，使用已知会影响心率的刺激因素。本研究展示了将水体盐度升高至 5 mg/L 浓度时的结果。
    2. 在刺激试验后，按照步骤 2 所述方法再次获取同一样本的图像序列。使用步骤 5 所述的心率分析软件确定两次实验中的心率。验证观察到的心率变化是否与刺激试验的已知效应一致。

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结果

采用上述方案（补充视频1）测定12 dpf斑马鱼的心率。视频包含自由游动的斑马鱼幼虫图像序列、根据该序列利用所提出方案生成的光电容积脉搏波图，以及由该光电容积脉搏波图计算得到的相应心率。

标记的数据在训练过程中按3:2:1的比例随机划分为训练集、测试集和验证集。损失函数则根据以下表达式实现：

结合交叉熵和DiceLoss的损失函数方程，用于模型优化分析。

其中 x 为输入的 logits，y 为目标值，batch size 为同时处理的图像数量，

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讨论

本研究中，我们提出了一种用于测量自由游动斑马鱼幼鱼心跳的实验方案。通过多项实验验证了该方法的有效性。所提出方法的关键组成部分包括硬件和软件两方面的解决方案。首先，我们采用红外照明进行成像，如先前研究所证实，这种方法可避免色素沉着带来的干扰，并增强组织透明度，从而有利于准确判断心跳18。其次，我们建议从下方对鱼类进行成像。当处于麻醉状态时，斑马鱼幼鱼通常因 swim bladder（ swim bladder）的位置而侧卧，因此标准显微镜与倒置显微镜配置之间的方向差异可忽略不计。然而，由于游动状态下鱼类的心脏始终位于腹侧，将成像通道置于下方、照明通道置于上方，可提高信噪比。最后，我们通过采用神经网络来定位图像中的样本并识别各个器官，显著提升了图像处理性能。结合先验知识与实测数据，我们开发了方法，用于精确定位神经网络所检测到的斑马鱼幼鱼体内心脏的位置。

该方法的其他优势包括采用LED光源，与卤素灯不同，LED不会产生热量。将照明通道固定在载物台上，可针对模具尺寸进行一次性对准，从而在重新对焦时无需额外调整光源。该算法还可用于生成大规模数据...

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披露

所有作者均已披露任何利益冲突。

致谢

本研究由乌拉尔分院科学中心联邦国家任务计划（FFNS-2025-0008）资助。本工作使用了乌拉尔分院科学中心集体使用中心的设备完成[http:// https://ckp.ntcup.ru/en/]。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
低熔点琼脂糖Biozym850111
食盐Pegasus N/A
三卡因（氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，Tricaine, Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate） Sigma-AldrichE10505MS-222
设备
带杆底座AltamiSM-U1
准直透镜JLLSCMGGX焦距 30 mm
聚焦机构AltamiSM-12D=76 mm
LEDCreeTR-3535IR-3W
透镜SFK SecurityC接口，F1.6，1/3”
近红外相机ToupTekSWIR1300KMA
巴斯德吸管PE-LD149293
培养皿 35 × 15 mm BD Falcon351008
塑料模具N/AN/A通过3D打印制作
电源Unit-TUTP3300TFL-II
载物台N/AN/A通过3D打印制作
美工刀ErichKrause19145
测试物体Wally SkyMS-1-EB
软件
EfficientDetN/AN/Ahttps://github.com/rwightman/efficientdet-pytorch
EfficientNet-b0 模型N/AN/Ahttps://arxiv.org/abs/1905.11946
Google API 客户端GoogleN/AGoogle API 客户端是用于 Google 基于发现的 API 的 Python 客户端库。https://github.com/googleapis/google-api-python-client
硬件
多尺度注意力网络N/AN/Ahttps://arxiv.org/abs/2209.14145
NVIDIA DIGITSNVIDIAN/ANVIDIA DIGITS 是 Caffe 的封装程序，提供图形化网页界面。https://developer.nvidia.com/digits
NVIDIA GPUNVIDIAN/A需要配备 NVIDIA GPU，否则以下部分软件框架将无法运行。https://www.nvidia.com
OpenCVIntelN/AOpenCV 是用于计算机视觉的函数库。https://opencv.org
PythonPython 软件基金会N/APython 是一种编程语言。https://www.python.org

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