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基于基质的DNA提取用于污染清除痰液样本的靶向下一代测序

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DOI：

10.3791/68147

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2025年6月6日

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1Division of Molecular Biology and Human Genetics, SAMRC Centre for TB Research, DSI-NRF Centre of Excellence for Biomedical TB Research, Department of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University, 2National Health Laboratory Service, Green Point Tuberculosis Laboratory, 3Division of Medical Microbiology, Department of Pathology, University of Cape Town, 4Division of Medical Microbiology, Department of Pathology, University of Cape Town, 5Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Zuckerberg San Francisco General Hospital and Trauma Centre, University of California, San Francisco, 6Department of Medicine, University of California, San Diego, School of Medicine, 7Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND), Campus Biotech

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们提出了一种优化的DNA提取方法，该方法采用基于基质的提取法结合磁珠纯化技术，从去污染的痰液样本中提取DNA，用于后续对结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）进行靶向高通量测序。

摘要

新一代测序技术（NGS）现已被公认为实现及时且准确的耐药结核病（DR-TB）诊断的强大工具。靶向NGS（tNGS）通过聚焦于与耐药性相关的特定基因，提供了一种简化的检测方法，避免了传统基于培养的方法，后者检测周期从数周到数月不等。世界卫生组织（WHO）已推荐tNGS作为改善结核病（TB）诊断、指导治疗并提升治疗效果的重要策略，尤其适用于资源有限的地区。在WHO推荐的tNGS检测方法中，我们选择了一种可实现快速且全面的药物敏感性检测、分型鉴定及菌株分型的技术。尽管已有标准化的DNA提取方法，但这些方法可能耗时较长且劳动强度大。为应对这一挑战，我们优化了一种基于基质的简化DNA提取流程，并结合磁珠纯化技术。该方法可直接从去污染的痰沉淀物中快速高效地提取DNA，从而支持后续快速的tNGS分析。通过简化从痰沉淀物中提取DNA的流程，本方案有望促进tNGS在常规临床环境中的更广泛应用，最终有助于改善患者预后，并助力全球结核病防控工作。

引言

据估计，2023年全球有370万结核病患者未被诊断和治疗，凸显了结核病对全球健康的重大威胁1。世界卫生组织估计，2023年约有40万人患利福平耐药结核病（RR-TB）或耐多药结核病（MDR-TB）1。快速诊断和治疗结核病及耐药结核病，对于实现降低结核病发病率和死亡率的里程碑和目标至关重要1。

依赖传统的培养方法和表型药物敏感性试验（pDST）来确定临床分离株的耐药谱和治疗方案，通常需要6至8周的周转时间，导致诊断和治疗延迟，且需要复杂的生物安全防护设施。将常规诊断检测与耐药结核病（DR-TB）的下一代测序（NGS）相结合，可提供全面的药物耐药谱，优化耐多药结核病（MDR-TB）治疗方案的个体化设计，同时将有效治疗的启动时间从数周或数月缩短至数天2,3,4。

2023年和2024年，世界卫生组织建议将靶向下一代测序（tNGS）作为一类新型诊断方法，以快速确定对一线和二线抗结核药物的敏感性。5这使其成为指导治疗决策的宝贵工具，且无需 Mycobacterium tuberculosis 在生物安全三级（BSL-3）实验室中进行结核分枝杆菌（MTB）培养。靶向下一代测序（tNGS）是一种浓缩型测序方法，在测序前利用聚合酶链式反应（PCR）扩增介导耐药性的基因靶标。在世界卫生组织（WHO）推荐的tNGS检测方法中，我们选择了Deeplex Myc-TB检测，已有研究报道该检测可满足针对利福平、异烟肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、氟喹诺酮类、阿米卡星、链霉素、利奈唑胺、贝达喹啉和氯法齐明的基于药物类别水平的耐药检测标准。我们采用该检测方法评估本方案所提取DNA是否适用于后续tNGS分析。

此外，世界卫生组织（WHO）发布了第2版nd 结核分枝杆菌耐药相关突变目录的新版，为利用全基因组测序（WGS）和靶向下一代测序（tNGS）预测药物敏感性并指导治疗提供了路线图6一项近期的系统性综述与荟萃分析显示，相较于表型药物敏感性试验（pDST），靶向下一代测序（tNGS）针对结核分枝杆菌基因组中23个不同耐药相关区域的检测，在耐药性检出方面的敏感性和特异性分别为94.1%和98.1%7.

然而，由于这些方法在工作流程、基础设施和设备方面具有特定的复杂性和成本，其实施仍然具有挑战性。一个关键的挑战是从去污染痰液的沉淀物中直接分离出足够数量的高质量分枝杆菌DNA，这是下游靶向下一代测序（tNGS）应用的关键步骤。为解决这一问题，我们提出了一种适用于tNGS的快速且简便的DNA提取方法。

用于选定MTB靶向下一代测序（tNGS）检测的标准化DNA提取方法包括一种实验室自建的手动和自动化方案8。本文描述了一种简化的、基于基质的DNA提取方案（图1）。该方法采用InstaGene基质（IGM），可结合金属离子和蛋白质，从而直接从去污染的痰沉淀物中提取高质量核酸。该替代方案具有更短的周转时间，并能为后续tNGS提供足够的DNA产量。该方案克服了手动和自动化方法的复杂性，同时确保tNGS质量，实现对结核分枝杆菌（MTB）耐药相关变异的快速诊断。随着结核病微生物学领域对tNGS应用兴趣的日益增长，本方案有助于推动其在常规诊断工作流程中的广泛应用。

使用匀浆器和磁珠的痰液DNA提取与纯化示意图。
图1：利用基质悬浮液从去污染的痰沉渣样本中提取分枝杆菌DNA的方法示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。

方案

本研究已获得斯泰伦博斯大学研究伦理委员会：生物与环境安全（REC: BES）批准，批准编号：BES-2024-25384，以及人类研究伦理委员会批准，批准编号：N21/09/093 和 N09/11/296。

1. 痰沉渣样本制备

注意：以下步骤需在生物安全三级（BSL3）实验室中进行，然后才能开展DNA提取。

  1. 取500 µL–2 mL已使用N-乙酰-L-半胱氨酸（NALC）和氢氧化钠（NaOH）（NALC/NaOH）去污处理的痰沉降物样本，转移至1.5 mL或2 mL低吸附管中，制备一份分装样本。
  2. 将含有痰沉降物样本的离心管直立放入试管架中，并置于80 °C烘箱内孵育1小时，通过加热处理灭活分枝杆菌。
  3. 孵育1小时后，取出装有样本的试管架，擦拭管壁表面，并将样本转移至适当的容器中，运送至生物安全二级（BSL2）实验室。
    注意：在进行后续操作或储存前，需让样本冷却至室温。

2. 使用基质悬浮液和高速匀浆器进行DNA提取（图2）

  1. 开始前，向1.5或2 mL螺口管中加入三颗直径为2 mm的玻璃珠，松开管盖，进行高压灭菌（理想情况下应在DNA提取前至少一天完成）。
  2. 从冰箱中取出基质悬浮液，置于磁力搅拌器上（试剂瓶内含磁珠），使试剂恢复至室温并开始混匀。
  3. 打开加热模块，并预热至56 °C（若有两个加热模块，将第二个预热至100 °C）。
    注意：以下步骤可在生物安全二级（BSL2）实验室的实验台上进行：
  4. 将经加热灭活的痰沉淀样本在16,800 × g（或最大转速）下离心15分钟。使用20–200 µL移液器轻轻吸除并弃去上清液，确保沉淀物不受扰动。
  5. 通过轻柔振荡混匀基质悬浮液（切勿涡旋），取200 µL充分混匀的基质加入沉淀中以重悬沉淀。
  6. 将全部液体转移至含有三颗预先灭菌的2 mm直径玻璃珠的1.5 mL螺口管中。
  7. 将样本放入加热模块中，在56 °C孵育15分钟。
    注意：若仅有一个加热模块，在完成步骤2.7后，立即将加热模块温度设定为100 °C。
  8. 使用涡旋振荡器以10秒时间均质化样本，以分散细胞。
  9. 将样本放入加热模块中，在100 °C孵育10分钟。
  10. 使用高速均质器对样本进行均质化处理，参数如下：以4.0 m/s速度运行一个循环，持续60秒。
  11. 在12,000 × g下离心5分钟。将含DNA的上清液130 µL转移至新的1.5 mL低吸附管中，避免扰动沉淀（含细胞碎片的基质）。弃去含有基质和细胞碎片的原始管。
    注意：安全暂停点。如需暂停，可将样本在-20 °C冷冻保存，待准备继续DNA纯化时再取出。
  12. 使用磁珠进行DNA纯化操作。

痰液样本处理流程图：离心、涡旋、孵育、均质化步骤。
图 2：基于基质的DNA提取方法结合高速均质仪。 缩写：HSH = 高速均质仪。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 使用磁珠进行DNA纯化（图3）

注意：在进行DNA纯化之前，请先执行步骤3.1和3.2。

  1. 将磁珠从冰箱中取出，置于室温下平衡30分钟。或者，涡旋磁珠原液瓶以充分重悬所有磁珠，吸取1,280 µL分装至新管中（用于21个样本的纯化），并置于室温下平衡。
  2. 通过将7.2 mL纯乙醇加入1.8 mL过滤灭菌水中，配制9 mL的80%乙醇。
    注意：以下步骤可在生物安全二级（BSL2）实验室的实验台上进行。
  3. 在使用前，充分涡旋磁珠原液瓶或已准备好的分装液，确保磁珠完全重悬。每处理10个样本后重复涡旋一次，以维持均匀悬浮状态。
  4. 向提取的DNA（130 µL）中加入1.2倍体积（156 µL）的磁珠。
    注意：对于DNA含量较高的样本（如培养物），可处理较小体积的样本（例如50 µL），并使用1.2倍体积的磁珠进行纯化。
  5. 通过移液吹打10次混匀样本。室温孵育5分钟。
  6. 将样本置于1.5 mL管磁力架上3分钟，或直至液体变澄清。小心吸除并弃去上清液，避免扰动磁珠。
  7. 保持试管在磁力架上，加入200 µL 80%乙醇，确保磁珠不被扰动，并静置孵育30秒。
  8. 小心吸除并弃去乙醇，避免扰动磁珠。
  9. 重复步骤3.7，共进行两次洗涤。
  10. 第二次洗涤后，移除并弃去乙醇。使用1–10 µL移液器去除残留的微量乙醇。
  11. 打开管盖，使磁珠在空气中干燥10分钟，或直至磁珠表面呈现哑光外观。
    注意：切勿使磁珠过度干燥而开裂。
  12. 当磁珠呈现哑光外观后，立即将试管从磁力架上取下，并在每个样本中直接加入50 µL无核酸酶水（NFW）。加完所有试管的无核酸酶水后，通过移液吹打10次混匀每个样本。检查试管内壁是否有磁珠粘附，必要时重复混匀步骤。室温孵育5分钟。
    注意：孵育时间可从5分钟延长至10分钟，但不得少于5分钟。
  13. 将试管重新放回磁力架上3分钟，或直至液体变澄清。在试管仍处于磁力架上的情况下，将含有DNA的上清液转移至已明确标记的无菌低吸附管中。确保未将磁珠转移至上清液中。
    注意：若在转移过程中移液枪头中可见磁珠，应将上清液重新吹回磁力架上的试管中，再分离3分钟。切勿将磁珠转移至新管中。
    安全暂停点：如需暂停，可将样本在-20 °C冷冻保存，待后续使用适用于NGS的方法进行定量及MTB tNGS检测的PCR扩增时再继续操作。

磁珠DNA纯化示意图；过程包括混匀、孵育、分离、乙醇洗涤。
图3：使用磁珠进行DNA纯化与浓缩。 缩写：NFW = 无核酸酶水；tNGS = 靶向下一代测序。 请点击此处查看该图的放大版本。

结果

样本描述
共收集了165份痰沉渣样本，这些样本经显微镜检查抗酸杆菌（AFB）呈阳性，细菌载量至少为1+，由南非开普敦格雷恩波因特国家卫生实验室服务局（NHLS）常规收集并处理。采用两种不同体积的痰沉渣样本提取DNA [约2 mL (n = 102) 和 500 µL (n = 63)]。开展此项比较旨在评估较小体积的沉渣样本是否能够获得足量DNA，用于后续的靶向下一代测序（tNGS）。

图4 显示了不同痰涂片分级（1+、2+ 和 3+）及痰沉渣体积（2 mL 和 500 µL）下总DNA浓度（ng/µL）的箱线图比较。使用500 µL沉渣进行提取时，总体DNA得率普遍降低，且在不同涂片分级间存在变异性。因此，按样本的抗酸杆菌（AFB）分级分层后，体积至少为2 mL的沉渣样本所提取的平均DNA浓度高于500 µL沉渣样本的DNA浓度。

DNA浓度箱线图，涂片分级，组间比较；数据分析，2 mL与500 µL样本。
图4：痰沉渣体积对不同涂片分级下DNA得率的影响。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5 显示了箱线图，展示了从不同涂片分级（1+、2+ 和 3+）的痰沉渣样本中获得的所有靶标的平均测序读数（平均覆盖深度），这些样本分别采用两种不同的起始体积（2 mL 和 500 µL）进行处理。离群值以单独的点表示，y 轴采用对数刻度以适应覆盖度的差异。从 500 µL 沉渣中提取的 3+ 样本较高的四分位距表明，随着细菌载量升高，变异程度更大。

不同样本体积（2 mL、500 µL）下各涂片等级覆盖率的箱线图比较。
图 5：不同涂片等级和样本输入体积下所有靶标的平均测序读数（覆盖深度）比较。请点击此处查看该图的放大版本。

图6展示了利用相关网络应用程序的生物信息学分析流程对测序结果可接受性进行评估的情况。测序质量评分分为+++（高度可接受）、++（可接受）、+（勉强可接受）、-（不可接受）和ND（未确定）。图中若无柱状图表示该特定类别未获得结果。在500 µL加样体积样本集中，涂片等级1+的不可接受和ND结果比例高于涂片等级2+和3+。从500 µL痰沉淀物提取的样本平均测序覆盖深度为4,316，而从2 mL痰沉淀物提取的样本为4,810。这表明无论加样体积如何，从痰沉淀物中提取的DNA均足以满足后续靶向下一代测序（tNGS）的要求。

根据测序结果可接受性的分布情况，涂片等级为3+的样本具有最高的成功率，大多数样本序列评分为++和+++，高于1+和2+涂片等级的样本。对于500 µL上样量的样本，在所有涂片等级中，-和+类别的样本比例相对高于2 mL上样量的样本。这表明500 µL上样量的样本中有更多样本落入低质量、较不可接受的类别。而对于2 mL上样量的样本，高质量（++和+++）类别的样本比例更高，尤其是涂片等级为3+的样本。这表明与500 µL上样量相比，2 mL上样量的样本更有可能产生更优的测序质量评分。

样本质量分析；按体积（500 μL、2 mL）和涂片等级比较样本百分比的直方图。
图6：按涂片等级和样本输入体积分布的质量评分。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

基于基质的提取方法与高速匀浆仪联用的技术最初由 Shea 等人发表9。该方法最初为从结核分枝杆菌复合群（MTBC）培养物中提取DNA进行全基因组测序（WGS）而开发并优化9,10。我们对该方法进行了优化，以适用于MTB靶向下一代测序（tNGS）检测。21个样本的DNA提取与纯化总周转时间为4小时40分钟，包括孵育和离心步骤。该所述方案在结合珠子纯化步骤用于涂片分级从1+至3+的样本DNA提取时，其可靠性可通过平均得率（图4）、所有靶标合并后的总体覆盖深度（图5）以及由配套网络应用程序确定的测序结果可接受性评分（图6）得以验证。

最近一项研究发现，涂片分级与DNA浓度或测序读长深度之间不存在一致的关系。作者指出，样本处理和纯化步骤的差异可能会影响高涂片分级样本的检测性能，尤其是在污染物未能有效去除的情况下。此外，由于痰沉淀物中DNA混合物的复杂性，非目标DNA可能与结核分枝杆菌（MTB）DNA竞争，导致测序仍具挑战性11。尽管我们未观察到输入DNA浓度与测序深度之间存在明显相关性，但需注意的是，根据制造商的说明，靶向PCR前的DNA输入量不应超过100 ng，否则可能导致PCR抑制。此外，细菌载量较高（2+和3+）的痰沉淀样本可能含有更多污染物，如人源DNA、细胞碎片及其他抑制物，这些物质可能干扰PCR扩增和文库构建。

纯化步骤同时起到浓缩作用，可在靶向下一代测序（tNGS）前提高分枝杆菌DNA的得率。该方法适用于处理细菌载量较低的样本，且已证明在低至500 µL的样本体积下仍具有可靠的性能，因此适用于样本量有限的常规检测环境。该方法的应用可减少患者需再次前往诊所复诊的需求，从而降低随访过程中失访的风险。此外，该方法操作简便，无需高级的实验室技术，有利于在资源有限的环境中推广应用。

然而，关于该实验方案有几点需要注意。样本在80 °C孵育后不应立即冷冻或冷藏。热处理后立即快速冷却可能导致试管内表面形成冷凝水，从而稀释样本，并可能影响后续的DNA提取。此外，突然冷却可能会增加样本降解的风险，促进核酸断裂或残留的酶活性（这些酶可能在热处理过程中未被完全灭活）。这些因素在处理用于结核分枝杆菌（MTB）检测的痰样本时尤为重要。根据世界卫生组织（WHO）对齐-尼染色法的建议，涂片等级1+表示每100个油镜视野中有10-99条抗酸杆菌（AFB），2+表示至少50个视野中每个视野有1-10条AFB，3+表示至少20个视野中每个视野有超过10条AFB12。

该方法的一个局限性是由于需要使用高速匀浆器或珠击打装置进行手动匀浆，因而无法实现自动化。为解决这一问题，目前的研究工作正致力于通过测试更短的孵育时间、更低的孵育温度以及替代高速匀浆的其他方法来优化该实验方案。

因此，这种基于基质的DNA提取方法结合高速均质器，是一种快速DNA提取技术，通过加热和珠击来释放基因组DNA，同时去除PCR抑制剂（如金属和蛋白质）。

披露

作者 T. R. 通过与加州大学圣地亚哥分校的服务合同获得 FIND 的资金支持。作者 T. R. 获得了美国国立卫生研究院（NIH）的拨款，用于开发和评估一种用于耐药结核病的靶向下一代测序解决方案（R01AI176401）。作者 T. R. 是 Verus Diagnostics Inc. 的联合创始人、董事会成员和无薪酬股东。

致谢

作者谨此感谢南非国家健康实验室服务（NHLS）格雷恩点结核病实验室团队提供的技术支持。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）和创新诊断基金会（FIND）资助，TS ELiOT 项目资助编号：R01AI153213，Unitaid 资助编号：2019-32-FIND MDR。插图使用 BioRender.com 制作。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
替代型号：Benchmark BeadBlaster 24Benchmark ScientificD2400
基于磁珠的 AMPure XP 试剂Beckman CoulterA63881
高压灭菌或无菌玻璃珠（2 mm）Sigma-AldrichZ273627-1EA
乙醇，纯级 Sigma-AldrichE7023-500ML
滤芯吸头（10 µL）Bio-Smart ScientificFT-10-R
滤芯吸头（1000 µL）Bio-Smart ScientificFT1000-R
滤芯吸头（20 µL）Bio-Smart ScientificFT20-R
滤芯吸头（200 µL）Bio-Smart ScientificFT200-R
加热模块，温度范围 37 °C 至 100 °C Eppendorf5382000031
高速均质器（HSM），如 FastPrep-24MP Biomedicals116005500
80 °C 恒温培养箱Lasec GroupIBLPDHG-9030A
InstaGene MatrixBio-Rad Laboratories Inc.BBRD7326030
低吸附微量离心管（1.5 mL 或 2 mL）EppendorfEP0030108051-250EA
适用于 1.5 – 2 mL 管的磁力架Thermo Fisher Scientific Inc.12321D
磁力搅拌器MerckZ671886
微量离心机Eppendorf5406000046
Milli-Q IX 7015 纯水净化系统MerckZIX7015T0C
无核酸酶水（NFW），分子生物学级别Thermo Fisher Scientific Inc.AM9937
移液器（P10、P20、P200 和 P1000）EppendorfEP3123000918-1EA
Qubit 检测管Thermo Fisher Scientific Inc.Q32856
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒Thermo Fisher Scientific Inc.Q33231
Qubit 荧光仪Thermo Fisher Scientific Inc.Q33226
螺口管（1.5 mL）Scientific Specialties Inc.P2TUB056C-0001.5ST
涡旋振荡器Lasec GroupWMBB0L0E0216

参考文献

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