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方法文章

评估微塑料的缺失组分：水生系统中微塑料（1-300 μm）的多样性、丰度与质量

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DOI：

10.3791/68148

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2025年8月22日

 ,  , 
1School of Marine and Atmospheric Science, Stony Brook University

本文内容

摘要

本方案描述了一种适用于滤膜上采集的水样中检测、鉴定和定量微米级（1-300 µm）微塑料（MPs）的方法。拉曼显微光谱法可识别微塑料颗粒的聚合物化学结构，并以颗粒数量和水中质量为基础对其丰度进行定量。

摘要

本文所述方案能够对直径小至约 1 µm 的微塑料（MPs）进行定量，准确鉴定聚合物类型，并估算颗粒体积，从而关键性地实现微塑料质量的计算。来自纽约州大南湾（GSB）样品的代表性结果表明，等效球形直径（ESD）在 1–6 µm 范围内的颗粒最为丰富，其中约 75% 的颗粒尺寸小于 5 µm。值得注意的是，预筛分步骤未能获得任何大于 60 µm 的颗粒，提示在所采样的沿海位点大尺寸微塑料较为罕见。在过滤前，采用化学氧化步骤去除有机碎屑，这有助于对单个采水瓶样品中较大体积的水样（>1 L）进行过滤，并减少滤膜堵塞。尽管该方法显著提高了过滤效率，但该方法学的某些方面仍需进一步优化，以缩短样品制备和数据分析所需的总时间。拉曼显微光谱及其相关数据处理过程仍然较为耗时，尤其是在复杂环境基质中准确分析小于 10 µm 的颗粒时。目前的研究工作重点在于尽量减少分析不确定性，优化颗粒计数准确性与处理时间之间的权衡，并降低检测流程中的假象干扰。

引言

微塑料（MPs）是一类高度异质性的颗粒，其在尺寸、形状、颜色、密度、化学组成及其他物理特性方面存在广泛差异，这使得它们的识别与定量尤为困难1。在微塑料调查中已采用多种分析方法，从光学显微镜等目视技术2，到热解-气相色谱等更先进的化学分析手段3。由于操作简便、快速且成本较低，光学显微镜常用于表征较大尺寸的微塑料（通常为0.5–5 mm）1。该方法可实现对类塑料颗粒的可视化识别与定量，同时提供颗粒表面形貌与结构信息2。然而，该技术无法提供有关化学组成的化学信息，且依赖于分析人员的专业经验。目视分析存在已被广泛记录的误判问题，误判率据报道在20%至70%之间，尤其针对微小且透明的颗粒。此类误差可能导致环境样品中微塑料浓度被显著高估4。

另一方面，热解-气相色谱（GC）联用质谱（MS）可通过分析微塑料的热降解产物，提供其化学组成的详细信息3。当结合热脱附步骤时，该方法还能在同一次分析中检测塑料添加剂5。然而，该方法需要手动预筛选类塑料颗粒，并将其小心地置入热解系统，导致样品通量较低1。

为了克服传统方法的局限性，能够同时实现微塑料（MPs）鉴定与定量的自动化技术正变得日益重要。拉曼光谱和傅里叶变换红外光谱（FTIR）通过其独特的光谱指纹可实现对聚合物的准确识别6,7,8。这些振动光谱技术通过检测光（拉曼使用激光，FTIR使用红外光）诱导的分子振动，生成反映特定分子结构的光谱图7。这两种技术已显著推动了在多种环境基质中对小尺寸微塑料颗粒（<300 µm）的检测与表征8。它们通过化学确认塑料样颗粒，减少了假阳性结果，降低了假阴性率，且具有非破坏性特点。当与显微镜联用（即显微光谱技术）时，这些方法可实现对小于0.3 mm的聚合物颗粒进行鉴定与定量（其中µFTIR可检测至约10 µm，µRaman可检测至约0.3 µm）8。然而，每种方法均有其局限性：拉曼光谱具有更高的空间分辨率，并对某些聚合物（如聚苯乙烯）具有更强的检测能力，但更容易受到荧光干扰，通常需要更长的采集时间。尽管如此，拉曼显微光谱技术可检测小于0.3 µm的颗粒，覆盖的微塑料尺寸范围比FTIR成像更广8,9。

本文所述工作的主要工具是SoMAS的纳米拉曼分子成像实验室（NARMIL）内配备的共聚焦拉曼显微光谱仪。本方案经过优化，可用于检测、鉴定和定量水样滤膜上微米级的微塑料（<300 µm），这些微塑料通常在使用浮游生物网或曼塔网采集海洋塑料时被忽略。此外，必须采用化学氧化法以减少非塑料残留物（有机碎屑）的存在。这可在拉曼显微光谱分析前最大限度地减少干扰，并且重要的是可防止滤膜孔隙堵塞，从而实现更大体积水样的过滤。利用该技术，可检测到水样滤膜上亚微米至毫米尺寸范围内的微塑料颗粒，并能够计算出微塑料的具体浓度、颗粒尺寸和质量。

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方案

本方案已对原始版本进行了修改9。该方案为水体样品（饮用水、河流、湖泊、近岸或开阔海域）中微塑料（粒径＜300 µm）在滤膜上的提取、检测与定量分析提供指导。所用试剂与仪器列于材料表中。

1. 质量控制

  1. 使用前须将所有试剂通过 0.22 µm 滤膜过滤。
  2. 确保工作人员穿着棉质实验服（不得使用合成材料），并在处理样品前后及之间洗手。
  3. 每次过滤前后，用 0.22 µm 滤膜过滤的去离子水冲洗过滤装置；不使用时，用洁净的铝箔覆盖。
  4. 现场空白：将已冲洗的样品瓶装入 0.22 µm 滤膜过滤的去离子水，并按环境样品同样流程处理。
  5. 实验室空白：每批样品处理过程中，将 1 L 0.22 µm 滤膜过滤的去离子水通过 Al2O3 滤膜进行处理。

2. 微塑料定量用天然水样的采集与制备

  1. 使用 0.22 µm 滤膜过滤的蒸馏水预冲洗所有样品瓶（包括 Niskin 瓶和玻璃容器），以尽量减少污染。
  2. 可采用标准采样方法从水体中采集离散的水柱样品（>1 L），例如使用玻璃瓶（表层水）或安装在采水器上的聚氯乙烯（PVC）Niskin 瓶（水柱），并直接转移至玻璃瓶中。
  3. 使用 200 µm 和 60 µm 金属筛网对采集的水样进行预过滤，以去除有机碎屑并将微塑料分离为不同粒径组分。
    注意：截留的颗粒可在显微镜下直接进行鉴定。
  4. 将通过 60 µm 金属筛网的水样储存于玻璃瓶中，随后将其过滤至氧化铝（Al2O3）膜滤膜（直径 25 mm，孔径 0.2 µm）上。

3. 水样的化学氧化

注意：为了尽量减少来自大量生物源性颗粒的分析干扰，在进行拉曼显微光谱分析之前，需通过化学氧化法对样品进行清洗。

  1. 在玻璃容器中，将 100 mL 的 30% (v/v) 过氧化氢与 1 L 样品混合，充分混匀。
    注意：H2O2 为强氧化剂，操作时需小心，可能引起皮肤和眼睛刺激。请佩戴手套和护目镜，并遵守实验室安全规程。
  2. 用盖子或铝箔覆盖容器，置于 60 °C 烤箱中加热约 10 小时。
  3. 让样品冷却 10 分钟，随后趁温热时进行过滤。

4. 水样的过滤

注意：由于滤膜本身具有固有脆性，在安装和拆卸过程中应仅通过手持与膜结合的环形聚丙烯环来操作，避免弯曲氧化铝（Al2O3）膜滤器。

  1. 在超净工作台中，使用带有烧结玻璃底座和金属夹的全玻璃过滤系统对 1 L 样品和空白样进行过滤。
  2. 过滤后，用 0.22 µm 滤过的蒸馏水冲洗滤膜。
  3. 将滤膜直接置于显微镜载玻片上（不加盖盖玻片），用于拉曼分析。

5. 过滤后微塑料颗粒的拉曼微光谱分析

注意：采用共聚焦拉曼显微光谱仪及其配套软件作为分析方法，用于识别和定量微塑料颗粒。该仪器配置包括改进型直立式落射荧光显微镜、计算机控制的电动x-y-z载物台（各维度步长为0.1 µm）、四种激光线（457/514 nm 氩离子激光、633 nm 氦氖激光、785 nm 二极管激光）以及一个1,040 × 256 帕尔贴冷却CCD检测器。

  1. 使用拉曼软件中的图像采集功能，设置用于水样中微塑料分析的仪器配置。
    1. 激光：633 nm He/Ne，激光功率约为 9.3 mW（通过 50× 物镜
    2. 光栅：1200 线/毫米。
    3. 光谱范围：200–2500 cm⁻¹-1.
    4. 曝光时间：0.7 秒/光谱。
  2. 在感兴趣区域（ROI）内建立网格，通过每隔一定间距采集光谱 1 µm 在x和y维度上。
  3. 将每个 ROI 定义为一个 100 µm x 100 µm 相机图像中的网格10,000 µm2).
    注意：ROI 区域可以调整；例如，较小的区域将缩短分析的总时间。
  4. 使用交叉图案模型随机选择约40个感兴趣区域（ROI）进行每种滤膜的分析，以代表微塑料在整个暴露滤膜区域上的空间分布。
  5. 自动采集数据后，使用软件中的图像采集功能生成每个 ROI 的详细二维化学分布图。
  6. 利用软件功能，通过组分分析（非负最小二乘相关法）从每张化学图谱中识别并定量微塑料颗粒。
  7. 将谱图与参考数据库进行比对。接受匹配得分符合要求的结果 >60（内部文库评分0-100）经确认的微塑料颗粒10.

6. 基于滤膜的微塑料颗粒定量计数

  1. 在统计约 40 个 ROI 中的微塑料颗粒总数后，根据公式 111 计算每升样品中微塑料颗粒的数量（N）。
    静态平衡公式，\( N = \frac{Af \times n}{b \times M \times V} \)，教学用公式。    (1)
    其中 Af 为滤膜的总暴露面积（mm2），n 为所有被检测 ROI 中计数的微塑料颗粒总数，b 为被检测的 ROI 数量，M 为单个 ROI 的面积大小（mm2），V 为样品过滤的水体积（L）。
  2. 通过计算每个样品所有 ROI 计数结果的标准误，确定样品中颗粒总数（N）的分析不确定性。
  3. 以 N ± 1S.E. 的形式报告每升样品中的颗粒总数。

7. 粒径、体积和质量的计算

注意：借助图像分析软件测定每个颗粒的尺寸、面积和等效球体直径（ESD）。

  1. 通过计算分配给每个颗粒图像的塑料阳性像素总数来确定面积。
  2. 利用该颗粒面积（Ap），应用公式211计算等效球体直径（ESD）：
    ESD计算公式，等效球体直径的数学表达式。    (2)
  3. 使用公式312计算每个颗粒的理想化椭球体积估计值。
    体积公式 V=(4/3)*π*(ESD/2)^3，公式，几何分析，示意图。    (3)
  4. 利用体积估计值和各塑料聚合物已发表的比密度（ρ；g cm3），通过公式 M = ρV 计算微塑料样品中每种塑料聚合物的质量（M）。质量通常以 µg/L 报告。
    注意：为估算每个颗粒质量计算中的不确定性传播（质量相对误差，RE = 标准差/均值），需结合体积算法和平均密度的分析不确定性，应用以下公式13：
    质量相对误差（R.E.）公式；公式示意图；教学用途；体积与密度关系分析。    (4)
    其中，R.E. vol 表示线性回归斜率（三维体积与“二维体积”）的相对误差（斜率的标准误/斜率）9；R.E. den 表示特定颗粒中各聚合物所报道密度值范围内的相对变异（标准误/均值）。

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结果

本文展示了使用最新版本方法所获得的结果。该方法在其原始应用基础上进行了修改9,14。本研究中使用的样品来自一项评估纽约长岛三大主要近岸水体中微塑料污染状况的项目：大南湾、佩科尼克河口和谢内科克湾。此处呈现的结果旨在验证我们改进后的方法的可行性，而非对这些水体水质的系统性评估。2024年8月28日，从位于美国纽约州大南湾（GSB）的两个站点采集了表层水样（图1）。在每个站点，使用一艘小型船只（约12米）采集1.5 L表层水样，并转移至玻璃容器中。样品随后在石溪大学海洋与大气科学学院（SoMAS-SBU）的实验室进行处理和分析。

图2 展示了两个直径约为 20 µm 的颗粒，它们在反射明场显微镜下形态相似。然而，通过拉曼光谱分析可区分其化学成分，并以相应颜色编码结果。较大的颗粒（约 20 µm）在 808 cm-1 和 840 c...

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讨论

该方法能够对滤膜上采集的水样中的微塑料（MP）颗粒进行定量分析，最小可检测至1 µm，从而实现对颗粒丰度、化学组成、尺寸和质量的详细测量。然而，在分析复杂环境基质中粒径小于10 µm的颗粒时，必须充分认识并解决该方法本身存在的不确定性来源。

目前微塑料（MP）研究中缺乏检测限（LOD）和定量限（LOQ）的标准化测定方法，这是亟需解决的重要问题。已有多种方法被提出用于校正背景污染对野外数据的影响，尤其是通过引入流程空白样本来实现15,16,17,18,19。例如，可通过计算野外和实验室空白样本中检测到的微塑料平均浓度加上空白测量值两倍标准差的方法，确定一个阈值，以此提供数据不确定性的评估指标。微塑料浓度低于该阈值的样品将被视为可能在采样或分析过程中受到污染，应予...

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披露

作者声明，他们不存在任何已知的相互竞争的经济利益或可能被认为影响本文所报告工作的个人关系。

致谢

作者感谢Larissa Chraim、Anthony Hill、Alanna Chen、Maya Butkevich和Leslie Mejia在实验室工作和数据分析方面的协助。所有拉曼光谱数据均在石溪大学（SBU）海洋与大气科学学院的纳米拉曼分子成像实验室（NARMIL）中获得，该实验室是一个致力于环境科学研究应用的共享资源平台，由美国国家科学基金会MRI项目资助建立（项目编号OCE-1336724）。本研究部分得到了石溪大学（SBU）种子基金以及SBU校长博士论文完成奖学金CF21的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
铝箔 任意商用品牌
分析用不锈钢筛网Retsch GmbH，德国DIN 4188
Anodisc 滤膜Whatman
滤器 holderFisherBrand-Millipore SigmaXX1012542
玻璃瓶FisherBrand-Millipore Sigma02-912-313任何玻璃容器均可用于采样过程
玻璃漏斗FisherBrand-Millipore SigmaXX1012514
30% 过氧化氢Innovating Sciences7722-84-1
inVia 共聚焦拉曼显微光谱仪 Renishaw
层流罩Labconco 或其他适用于实验室的层流罩
金属夹FisherBrand-Millipore SigmaXX1012503
金属镊子FisherBrand-Millipore Sigma13-820-061
显微镜载玻片Thermo Fisherhttps://www.thermofisher.com/
腈类手套Kimtech55080-54
硝酸纤维素膜滤器 0.22GVS Filter Technology 1214898
径向加热烘箱Lab Line Instruments 3609
真空泵Welch25468-01 A
WiRE 5.2Renishaw

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