本方案描述了代表肿瘤进展不同阶段的食管类器官模型的建立及其组织学分析。该方法使研究人员能够研究从正常组织向癌变组织转变过程中细胞形态、空间结构以及分子标志物表达模式的变化。
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方法文章
建立模拟食管组织从正常向癌变进展的类器官模型及其组织学分析
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
类器官已成为推动肿瘤发生机制研究和癌症治疗理解的关键工具。通过构建代表不同肿瘤阶段的人类类器官模型，并进行组织学分析，可以更深入地理解肿瘤进展过程中细胞形态、空间结构以及关键分子标志物表达的变化。本研究提供了一套建立和培养食管鳞状细胞类器官的全面实验方案。此外，该方案还详细描述了利用固定、包埋和染色等技术，评估类器官内关键分子表达模式与空间分布的方法。通过该方案，研究人员发现了食管鳞状上皮细胞在肿瘤发生过程中其空间结构及多种肿瘤生物标志物表达的显著变化。该方案有助于类器官的构建及其组织学分析，使科研人员能够探究在肿瘤发生不同阶段及治疗干预过程中上皮细胞的空间架构与分子改变。
引言
肿瘤发生是一个复杂的多阶段过程，其特征是细胞发生渐进性的分子和形态学改变1,2。食管鳞状细胞癌（ESCC）是一种预后较差的常见恶性肿瘤3,4，其发展过程典型地经历了四个明确的阶段：正常黏膜、低级别上皮内瘤变（LGIN）、高级别上皮内瘤变（HGIN）以及浸润性癌5。在这些阶段中，上皮细胞表现出分子表达模式和空间组织的动态变化，同时伴随组织形态从正常向恶性状态逐步演进的系统性改变6,7。尽管对ESCC发病机制的理解已取得进展，但仍缺乏能够真实再现肿瘤演化过程中时空特征、同时支持系统性组织学和分子分析的实验模型，这限制了对疾病进展机制的深入理解以及治疗策略的开发。
尽管二维永生化癌细胞系在阐明肿瘤发生机制方面做出了重要贡献，但其在模拟原发肿瘤的生物学复杂性和病理特征方面存在固有局限性8。动物模型虽然提供了体内研究环境，但由于物种特异性差异，往往难以准确预测人类的反应9。相比之....
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方案
本研究经中国医学科学院肿瘤医院机构审查委员会批准（批准号：20/069–2265、22/221-3423 和 23/305-4047）。食管组织样本来源于2021年至2024年间在中国医学科学院肿瘤医院接受食管鳞状细胞癌（ESCC）手术或早期筛查的患者，用于建立人源食管类器官。本研究纳入的所有患者在样本采集前均未接受过化疗或放疗。所有参与者均签署了知情同意书，相关临床信息从病历资料中获取。本研究所用试剂与设备的完整清单见于 材料表.
1. 食管上皮类器官的制备
- 制备L-WRN条件培养基
- 制备L-WRN细胞系
- 将L-WRN细胞系（储存于-80 °C）在37 °C水浴中解冻1-2分钟。加入5 mL预热的基础培养基（DMEM添加10%胎牛血清FBS）混匀。
- 在室温（RT）下以200 × g 离心5分钟。
- 弃去上清液。用2-3 mL新鲜预热的选择培养基（含10% FBS、0.5 mg/mL潮霉素B和0.5 mg/mL G-418的DMEM）重悬细胞。
注：将培养基保存于4 °C（最长储存1个月）。 - 将细胞转移至含有选择培养基的10 cm培养皿中，在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养。
- 制备L-WRN细胞系
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结果
本方案描述了食管鳞状细胞癌（ESCC）肿瘤发生不同阶段的类器官取样与组织学分析（图1）。通过对 ESCC 患者的正常食管黏膜、低级别上皮内瘤变（LGIN）、高级别上皮内瘤变（HGIN）以及肿瘤组织进行取样，可构建代表肿瘤发生不同阶段的类器官。此外，对这些类器官进行石蜡包埋和切片，随后进行免疫荧光染色。
为研究肿瘤发生过程中免疫抑制分子的表达及细胞克隆的形态学特征，采集了食管上皮组织在肿瘤发育不同阶段的样本，并进行了免疫荧光染色。染色完成后，在扫描切片前为各标记物定义了四种伪彩色：PD-L1、Ki-67 和 KRT6A 分别被赋予绿色、红色和灰色的伪彩色，细胞核则用 DAPI 标记。实验结果表明，食管黏膜类器官的形态在肿瘤发生过程中发生变化，主要表现为结构更加紊乱。免疫荧光染色显示，随着肿瘤的发生发展，上皮细胞的增殖发生改变，并伴随免疫抑制分子（如 PD-L1）表达升高（图 2）。
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讨论
类器官的建立及其组织学分析在模拟肿瘤进展方面代表了重要的技术进步。该方案在研究肿瘤发生方面相较于现有方法具有显著优势20与传统的二维细胞培养系统不同，类器官具有复杂的三维结构和细胞异质性，能更真实地模拟 体内 条件。与动物模型相比，源自人体组织的类器官更能准确地反映人类疾病的特征9,21,22多重免疫荧光染色技术的引入可实现多种标志物的同步可视化，有助于揭示肿瘤演化过程中关键分子与组织结构之间的空间关系。通过采用这一先进方案，本研究揭示了食管鳞状细胞癌中的显著动态变化，具体表现为肿瘤细胞增殖水平在肿瘤发展过程中逐步改变，并伴随免疫抑制分子PD-L1表达的相应变化。
本方案提供了研究肿瘤发生过程中形态学和分子变化的全面方法，其中多个关键步骤需要特别注意。组织处理过程中的消化时间必须严格监控，因为消化过度会导致细胞大量死亡，而消化不足则.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性财务利益或利益冲突。
致谢
作者感谢中国医学科学院（CAMS）肿瘤医院和北京协和医学院（PUMC）参与研究的所有患者和医生。本研究由国家自然科学基金（82203156，项目负责人：S.Z.）、国家重点研发计划（2023YFC3503200，项目负责人：S.Z.）以及中国医学科学院医学与健康科技创新工程基金（2023-I2M-QJ-002，项目负责人：S.Z.）资助。图1 使用 BioRender.com 制作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 μm 滤膜 | Merck | Cat#SLGPR33RB | |
| 24 孔板 | Corning | Cat#3524 | |
| 4% 多聚甲醛 | Beyotime | Cat# P0099 | |
| 70 μm 无菌筛网 | Falcon | Cat#352350 | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | Cat# 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | Cat# 12634028 | |
| 琼脂 | Solarbio | Cat# A8190 | |
| Anti-Anti（抗生素-抗真菌剂） | Gibco | Cat# 15240062 | |
| B-27 添加剂 | Gibco | Cat# 17504044 | |
| CO2 培养箱 | Thermo | Cat#371GPCN | |
| 胶原酶 IV | Gibco | Cat# 17104019 | |
| Cryostor | STEMCELL | Cat# 07930 | |
| DMEM | Corning | Cat# 10-013-CV | |
| EGF | Gibco | Cat# PHG0313 | |
| 胎牛血清 | Cell Technologies | Cat# 30070 | |
| G-418 | Sigma | Cat# A1720 | |
| 明胶 | Solarbio | Cat# G8061 | |
| GlutaMAX | Gibco | Cat# 35050061 | |
| 生长因子减少型 Matrigel | Corning | Cat# 354230 | |
| HE 染色试剂盒 | 北京易利精细化学品有限公司 | NA | |
| HEPES | Gibco | Cat# 15630080 | |
| 组织学笔 | Zsbio | Cat#ZLI-9305 | |
| 潮霉素 B | Sigma | Cat# 400050 | |
| 免疫组织化学染色试剂盒 | ZSGB-BIO | PV-8000 | |
| L-WRN | ATCC | CRL-3276; RRID:CVCL_DA06 | |
| N-2 添加剂 | Gibco | Cat# 17502048 | |
| 中性树胶 | Zsbio | Cat#ZLI-9555 | |
| Opal 5-色手动免疫组化试剂盒 | PANOVUE | Cat# 10144100100 | |
| PBS | MeilunBio | Cat#MA0015 | |
| 兔单克隆抗 PD-L1 抗体 | CST | Cat# 13684; RRID:AB_2687655 | |
| 兔多克隆抗 Ki67 抗体 | Abcam | Cat# ab16667; RRID:AB_302459 | |
| 兔多克隆抗 KRT6A 抗体 | Proteintech | Cat# 10590-1-AP; RRID: AB_2134306 | |
| 羊血清 | Zsbio | Cat#ZLI-9056 | |
| TrypLE Express | Gibco | Cat# 12604021 | |
| TrypLE-EDTA | Gibco | Cat#15400-054 | |
| 全片图像扫描仪 | Hamamatsu | Cat#C13210 | |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | Cat# S1049 |
参考文献
- Zhang, S., et al. Tumor initiation and early tumorigenesis: Molecular mechanisms and interventional targets. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 149(2024).
- Sánchez-Danés, A., Blanpain, C. Deciphering the cells of origin of squamous cell ca....
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重印与许可
