本文介绍了一种可将自体脂肪组织转化为多种具有不同理化特性和功能的脂肪组分物质的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
传统的自体脂肪组织移植常用于容积填充和组织再生。然而，脂肪移植物均匀的物理和生物学特性在不同患者的临床情况及多样化需求下，往往导致效果不够理想。在自体脂肪移植的基础上，我们提出一种创新性技术——自体脂肪组分移植。这一全新理念整合了一套精心设计的操作流程，旨在将自体脂肪组织转化为多种具有独特理化特性的脂肪组分，以满足不同临床应用场景下的特定需求。通过一系列物理方法，脂肪组织可被转化为提供充分刚性支撑的脂肪基质复合物（AMC）、用于进一步填充的高密度脂肪（HDF）、适用于小范围或精确注射的基质血管组分（SVF）-凝胶，以及针对细小皱纹和/或面部年轻化需求的脂肪胶原片段（ACF）。这些不同的脂肪组分具有各自固有的特性，适用于精准化、靶向性的移植策略，能够更好地满足个体化患者的复杂需求。这种新型的脂肪组织分选技术在革新脂肪移植领域方面展现出巨大潜力，为实现更精细、更个性化的移植提供了全新的视角与方法。
引言
自体脂肪组织移植是一种广泛用于容积增加和组织再生的技术，其发展得益于供区准备、脂肪提取、处理及植入等环节的进步1,2,3,4。然而，传统脂肪移植物在物理和生物学特性上的均一性常常限制了其在应对多样化临床需求方面的有效性5。为了克服这些局限，我们的研究团队开发了一种创新的脂肪组织分馏技术，可将自体脂肪转化为具有不同理化特性和功能的特化组分。
本方案的主要目标是将自体脂肪组织分离为具有特定功能的组分——脂肪基质复合物（Adipose Matrix Complex, AMC）、基质血管组分凝胶（Stromal Vascular Fraction-gel, SVF-gel）以及脂肪胶原片段（Adipose Collagen Fragment, ACF），每种组分均针对特定的临床需求而设计。通过提供具有独特性能的组分，如增强的刚性、高细胞密度以及富含胶原的配方，该方案可实现精确且靶向性的移植策略6,7,8,9,10,11。
传统的脂肪移植技术虽然在容积填充方面有效，但往往难以满足复杂临床情况的精细需求。其脂肪吸收的不可预测性导致容积恢复不稳定。此外，由于传统脂肪移植物具有均一的物理和生物学特性，无法针对具有特定移植需求的区域进行靶向填充，例如提供结构支撑、实施精确的小范围注射或实现靶向胶原刺激。这些问题常导致需要多次手术，从而增加患者的痛苦和经济负担1,2,5。本分离技术通过从传统脂肪组织中富集具有特定价值的成分，有效克服了上述局限。通过该过程，我们可制备出具备定制化特性的脂肪组织组分，从而为临床医生提供个性化的治疗工具包。与合成填充物或传统脂肪移植相比，该方法采用自体组织，避免了免疫排斥风险，确保了良好的生物相容性3。此外，分离过程可获得具有独特特性的组分，例如AMC，其可提供结构支撑且吸收率低；SVF-gel，适用于精确注射，且富含基质血管组分细胞；以及ACF，一种可控制释放脂肪因子的胶原蛋白支架，在皮肤年轻化方面具有临床应用潜力7,9,11。该方法还可通过提高移植物存留率和患者满意度，减少重复治疗的需求10,12。
通过分离生物组织以优化治疗效果的理念已有充分依据，例如将血液分离为血浆、红细胞和血小板，用于特定的医学应用。近年来，脂肪组织组分的研究与临床应用也逐步推进13,14,15,16,17,18。本脂肪组织分离方案基于这一原理，旨在分离出具有不同特性的组分，以实现个体化的临床应用。临床医生可根据患者的解剖需求、预期疗效（如容积填充、结构支撑或皮肤年轻化）以及可用设备，判断该方法的适用性。该方案在需要精确控制移植物特性的临床场景中尤为有效，例如面部年轻化、瘢痕修复或复杂的重建手术7,10,12。
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方案
本研究经中国广州南方医院伦理审查委员会批准。脂肪组织取自签署书面知情同意书并自愿参与本研究的健康供体。所有动物实验均经南方医院实验动物管理和使用委员会批准，并依照中国国家卫生与医学研究理事会的指导原则进行。
1. 脂肪组织制备
- 全身麻醉与肿胀液浸润
- 对患者实施全身麻醉。在静脉诱导阶段，给予丙泊酚（2 mg/kg）、芬太尼（1.5 µg/kg）和罗库溴铵（0.6 mg/kg）联合用药，随后以七氟烷（1.5%）和瑞芬太尼（0.1 µg/kg/min）维持麻醉深度。在整个手术过程中，根据BIS监测（目标值40–60）、循环参数（MAP >65 mmHg）和呼气末二氧化碳（EtCO2，35–45 mmHg）动态调整麻醉方案。
- 将患者置于仰卧位，在受压部位使用保护性衬垫，并用氯己定-酒精对手术区域进行严格消毒。遵循无菌操作规程，以最大限度降低感染风险。
- 使用20 mL注射器将含有0.06%利多卡因和0.001%肾上腺素的肿胀液浸润至吸脂区域（如腹部或大腿）的皮下组织。保持浸润液体积与预期脂肪抽取体积之间的比例为2:1，并根据患者的具体解剖特征和治疗区域大小调整总注射量。
- 检查麻醉效果，确认肿胀液已充分浸润。在进行下一步操作前，轻刺或捏压吸脂区域。若患者仅感到轻微压力，则表明浸润充分，可实现更少不适感的脂肪采集。
- 脂肪采集
- 采用直径为3 mm、侧孔为1 mm锐孔的多孔套管进行脂肪采集。在−0.75 atm的负压下操作，以尽量减少对脂肪组织的损伤，确保所采集脂肪细胞的完整性和活性。
- Coleman法脂肪处理
- 将采集的脂肪置于60 mL注射器中，静置10分钟，使液体成分沉降至容器底部。
- 小心弃去底部的液体部分，收集上层相对纯净的脂肪层，以去除血液和肿胀液等杂质。
- 将收集的脂肪保留在 60-milliliter syringe 中，在室温下以1,200 x g离心3分钟，进一步分层。
- 离心后再次弃去底部液体部分。保留上层脂肪 （定义为Coleman脂肪）于60-
milliliter syringe中。
- 高密度与低密度脂肪样本采集
- 将Coleman脂肪上部的2/3转移至一个20 mL试管中，定义为低密度脂肪（LDF）。
- 将剩余下部的1/3 Coleman脂肪转移至另一个20 mL试管中，定义为高密度脂肪（HDF）。
2. 组分提取
- 脂肪基质复合物（AMC）的制备
- 将 HDF 通过带有套筒和三个内部筛网（1.5 mm 滤网间距）的过滤装置。
- 收集附着的组织，并用纱布包裹的 100 目滤袋进行脱水。通过镊子夹起组织时观察其状态来判断终点；当镊子夹起时无明显液滴下落，表明脱水已达到理想效果。最终产物被确定为 AMC。将剩余的 HDF 储存以备后续使用。
- 基质血管组分（SVF）-凝胶的提取
- 机械乳化 LDF：使用内径为 1.4 mm 的雌-雌鲁尔锁接头连接两个注射器，以 10 mL/s 的速度将 LDF 在两注射器之间反复推注 1 分钟，进行机械乳化。
- 将乳化后的 LDF 在 1,600 × g 条件下离心 3 分钟。收集中间层呈凝胶状的物质，即为 SVF-凝胶。
- 脂肪胶原片段（ACF）的制备
- LDF 粉碎：将 LDF 置于专用 ACF 提取器中，以 30,000 rpm 转速粉碎 60 秒，获得脂肪悬液。
- 过滤：将脂肪悬液转移至 20 mL 注射器中，连接 0.25 mm 单向滤器，推动活塞，将滤液收集至另一支 20 mL 注射器中。随后将该注射器连接至 0.15 mm 单向滤器，再次推动活塞，将最终滤液收集至第三支 20 mL 注射器中。然后将脂肪悬液在 3,000 × g 条件下离心 3 分钟。
- 收集底部的固体部分作为 ACF。
3. 脂肪成分的检测
- 硬度测试
- 使用带有测力传感器的设备，其量程为 0 N 至 225 N，并配备电磁致动器，可实现 6 mm 的轴向行程。
- 夹紧每份组织样本（AMC 和 Coleman 脂肪），施加 25 - 30 N 的预载荷以消除松弛并引起拉伸。设置加载速率为 8 mm/s，并电子记录样本破裂前达到的最大力值。设备随后计算组织硬度。
- 苏木精-伊红（HE）染色与Masson染色
- 使用 4% 多聚甲醛固定样本，以保存其结构。通过梯度乙醇脱水去除水分，为后续包埋步骤做准备。
- 将样本包埋于石蜡中，以利于切成薄片。随后对石蜡包埋的样本进行切片。
- 使用HE染色和Masson三色染色对切片进行染色。采用扫描电子显微镜（SEM）观察样本。
- 移植研究
- 选取 70 只健康 SPF 级裸鼠，体重 15 - 18 g，年龄 4 - 6 周（不分性别）。按照机构指南饲养，每只小鼠单独饲养于笼中，维持 12 小时光照/12 小时黑暗循环，并自由提供标准饲料和饮水 ad libitum。
- 通过腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）对小鼠进行麻醉。使用脚趾夹捏反射检测麻醉深度。涂抹眼膏以防止角膜干燥。
- 将 0.3 mL 制备好的 AMC 或脂肪组织（对照组为 Coleman 脂肪）注射至每只小鼠的皮下组织，作为脂肪移植物的基线。监测动物直至其恢复意识，然后将其转移回笼中。
- 在移植后第 7、14、30、60 和 90 天，小心分离移植物与周围组织，获取移植物并测量其体积。移植物存留率定义如下：
存留率 (%) = 取材时移植物体积 / 注射脂肪体积（此处为 0.3 mL）× 100%。
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结果
通过手术过程中执行的各种机械操作，我们成功将脂肪组织转化为具有不同特性的多种脂肪组分。依次为：可提供充分强韧支撑的AMC（图1A）；用于进一步填充的HDF（图1B）；适用于小范围精确注射的SVF-gel（图1C）；以及用于改善细小皱纹或面部修复的ACF（图1D）。脂肪组分物质AMC、SVF-gel和ACF的特性及功效已得到充分验证。
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讨论
该脂肪组织分馏方案包含多个关键步骤，可确保成功分离出具有特定功能的组分。首先，对获取的脂肪组织进行离心处理，将其分离为高密度脂肪（HDF）和低密度脂肪（LDF），二者具有不同的细胞成分和细胞外基质（ECM）组成23,24。HDF富含活性脂肪细胞和基质血管组分（SVF）细胞，经进一步处理可获得脂肪基质复合物（AMC），其因含有丰富的胶原蛋白而具备良好的结构支撑作用7。而LDF则通过机械乳化制备成SVF凝胶，该产物适用于小范围的精确注射10。最后，通过对LDF进行机械粉碎可得到脂肪胶原片段（ACF），这是一种富含胶原蛋白的制剂，特别适用于皮肤年轻化治疗11。这些步骤共同实现了将均质的脂肪组织转化为具有特定功能特性的专业化组分。
离心后，脂肪组织样本表现出不同的密度，反映了细胞和细胞外基质（ECM）组成的多样性，而非均一性
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本工作由国家自然科学基金（项目编号 81801932、81901976、81971852、81772101 和 81901975）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.001% 肾上腺素 | Sigma-Aldrich | E4375 | |
| 0.06% 利多卡因 | Sigma-Aldrich | L5647 | |
| 3-mm 多通道套管 | Tulip Medical Products, San Diego, CA, USA | / | |
| 50-ml 离心管 | Corning | 430829 | |
| BOSE ElectroForce 力学测试装置 | Bose Corporation | / | |
| 胶原酶 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| 雌-雌鲁尔锁紧接头 | BD Biosciences | 309628 | |
| 带套筒和筛网的过滤装置 | 定制（上海天工仪器有限公司） | / | |
| 纱布 | Medline Industries | MDS093944 | |
| 苏木精/伊红染色试剂盒 | Sigma-Aldrich | HT110116 | |
| 马松三色染色试剂盒 | Sigma-Aldrich | HT15 | |
| 裸鼠 | 南方医科大学 | / | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| 圆形不锈钢过滤筛网（0.15 mm） | 上海天工仪器有限公司 | / | |
| 圆形不锈钢过滤筛网（0.25 mm） | 上海天工仪器有限公司 | / | |
| 灭菌 100 目滤袋 | 上海天工仪器有限公司 | / | |
| 基质血管组分（SVF）-凝胶提取器 | 上海天工仪器有限公司 | / | |
| 胰蛋白酶 | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Western 印迹分析试剂盒 | Bio-Rad | 1705061 |
参考文献
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