本报告介绍了培养和实验操作单细胞链型植物藻类Penium margaritaceum的基本方法。同时提供了基于显微镜成像的基本实验方案，包括利用单克隆抗体和其他荧光探针对活细胞进行标记以及扫描电子显微镜观察。
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本文内容
摘要
摘要
细胞壁是植物细胞在发育过程以及响应非生物和生物环境胁迫时进行信号接收与转导的第一个组分。细胞会持续监测其细胞壁的完整性，并在胁迫条件下对其进行调控。阐明细胞壁中发生的特定结构与生化改变是一项具有挑战性的任务，尤其是在使用多细胞植物及其器官或组织时。这主要是因为在一个复杂的多细胞网络中的单个细胞所能解析的信息存在局限性。近年来，单细胞轮藻门绿藻Penium margaritaceum已被用于研究果胶动态、基于细胞壁的表型可塑性以及藻类细胞生物学的多个方面。该藻表型简单，细胞壁结构清晰，且含有许多与陆生植物细胞壁高度相似的组分，加之其在免疫细胞化学和实验研究中的操作便捷性，使其成为植物细胞壁生物学研究中一个强有力的模式生物。本研究旨在提供一系列基本技术，用于该藻的培养、实验处理以及外加胁迫因子的筛选。同时包括用于细胞壁结构研究的免疫细胞化学、共聚焦激光扫描显微成像和扫描电子显微成像的筛选方案 。此外，文中所述许多技术也可经适当修改后应用于其他广泛的细胞与分子生物学研究。
引言
植物的细胞壁是一个复杂的聚合物网络，在植物细胞的生命活动中具有多种功能1。细胞在发育过程中以及响应环境胁迫时，会持续监测细胞壁的完整性，并相应地调节其化学组成和结构。Penium margaritaceum 是一种单细胞绿藻，近年来已被用于链型藻类（Streptophyta，即与陆生植物亲缘关系最近且为陆生植物祖先的绿藻类群）的研究2。
在过去的二十年中，P. margaritaceum 一直是研究细胞壁和细胞外基质动态、内膜系统活动、细胞形态发生以及植物进化的重要模式生物3,4,5,6,7,8,9,10,11。本研究的目的是为植物细胞壁研究人员提供培养 P. margaritaceum 的基本方法，利用基于微孔板的技术对其进行实验操作，并通过活细胞免疫细胞化学标记结合光学显微镜和电子显微镜技术对其细胞壁结构进行观测。P. margaritaceum 在细胞壁生物化学方面与陆生植物的初生细胞壁具有诸多相似之处。我们已设计出多种实验方案，充分利用该藻类独特的单细胞表型，为研究在多细胞植物中通常难以监测的细胞壁动态提供了快速手段。这些技术将有助于致力于阐明细胞壁动态细节（尤其是果胶相关过程）的植物细胞壁生物学家，并可作为开展植物及链形植物藻类细胞生物学研究的起点。
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方案
注意： Penium margaritaceum 在获得时 哥廷根大学藻类培养物收集中心 - 哥廷根大学藻类培养中心（SAG）；菌株编号 #2640。
1. 培养物的维持
- 将藻类培养于液体伍兹霍尔培养基（WH12）中，该培养基可额外添加土壤水提取物（即每升培养基添加40 mL）。培养条件为20–25 °C，光照周期为16小时光照:8小时黑暗，光照强度为3.5 klux（74 µmol 光子/m2/s）的冷白色荧光灯。
- 每周进行一次继代培养，使用培养10–14天的细胞。Penium 培养物在6个月内保持活性，期间可用于启动继代培养。该藻类也可在1%–2%琼脂固化的WHM培养基上生长。
- 为实现常规细胞周期同步，将培养10–14天的藻细胞置于20–25 °C黑暗环境中处理2–6周。处理结束后，用新鲜WHM洗涤细胞（见下文），然后按上述条件进行培养。
2. 使用单克隆抗体标记细胞壁
注意：P. margaritaceum 具有一层初生细胞壁，其成分与陆生植物初生细胞壁中的许多成分相同11。许多针对陆生植物细胞壁表位产生的单克隆抗体（mAbs）可识别 P. margaritaceum 细胞壁中的组分。这些抗体的来源包括佐治亚大学复杂碳水化合物研究中心（ccrc@uga.edu）或 Kerafast（kerafast.com）。使用针对细胞壁表位的特异性一抗 mAbs 及荧光素偶联的二抗（如 FITC、TRITC）对活细胞的细胞壁进行标记后，可将细胞重新放回培养环境中，而不会影响细胞活性或细胞壁的沉积过程。细胞壁的荧光标记可长期保留，新分泌的细胞壁区域则呈现为暗区（即无标记区域），可通过测量这些区域来确定细胞扩展速率，或再次使用 mAbs 或其他探针进行标记。
- 取5 mL处于活跃生长期的液体细胞培养物（培养10–14天），置于15 mL塑料离心管中。在台式离心机中以1,000 x g 1 分钟。
- 倒掉上清液并弃去。将沉淀重悬于5 mL新鲜WHM中。盖紧管盖，剧烈振荡试管10秒，以充分重悬沉淀并去除细胞壁表面的胞外聚合物（EPS）。
- 在 1,000 x 下离心 g 1分钟。重复步骤2.2并离心。将沉淀重悬于1 mL新鲜WHM中，取200 µL细胞悬液分装至1.5 mL微量离心管中。
- 盖上管盖，在微量离心机中以1,000 x g离心 g. 去除上清液，将沉淀重悬于 400 µL 新鲜 WHM 中。
- 向悬浮液中加入 20 µL 单克隆抗体（例如 JIM5，一种对低甲基化 酯化的 同型半乳糖醛酸聚糖；最终稀释倍数为1/20 与 WHM 一起）。 涡旋振荡试管，用铝箔包裹，并置于实验室旋转仪上孵育90分钟。为获得最佳效果，在90分钟孵育过程中涡旋振荡试管2次。
- 将细胞悬液在1,000 x g条件下离心 g 孵育1分钟。移除上清液，将沉淀重悬于500 µL新鲜WHM中。盖紧管盖，涡旋振荡细胞悬液10秒。
- 重复步骤 2.6 两次。离心后，将沉淀重悬于 400 µL WHM 和 8 µL 山羊抗大鼠 TRITC 或 FITC（用 WHM 按 1/75 稀释）中。涡旋混匀，用铝箔纸包裹管子，并置于实验室旋转仪上孵育 90 分钟。
- 重复步骤 2.6 和 2.7。将沉淀重悬于 100 µL 培养基中，盖紧管盖，并用铝箔包裹，待成像前保存。
注意：在加入单克隆抗体之前，也可将细胞在含有阻断剂（如1%脱脂卡纳申速溶奶粉或1%牛血清白蛋白）的WHM中孵育，但据我们经验，该步骤对标记质量或强度并无改善。 Penium 在黑暗条件下，细胞不会扩张其细胞壁，也不会产生大量胞外多糖（EPS）。标记的抗体至少可保持完整3-4天，因此成像无需立即进行。此处也可使用其他单克隆抗体，但需测试其浓度。对于化学和物理筛选研究，可标记数毫升细胞悬液，避光保存数天后用于微孔板实验。细胞也可在处理前仅用一抗标记，之后再加入二抗。
3. 随时间测量细胞壁和细胞扩张速率
- 取1 mL经JIM5-TRITC标记的细胞，加入1 mL WHM至1.5 mL微量离心管中。在1,000 × g 条件下离心1分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于250 µL WHM中，并涡旋振荡以混匀细胞。
- 向12孔培养皿的每孔中加入1 mL WHM。此时可根据需要向各孔加入特定抑制剂或生长调节剂。本文中，我们展示了在孵育过程中提高钙离子浓度的影响。
- 取30 µL标记的细胞悬液（步骤1），加入微孔板的每孔中。轻轻摇动培养板以混匀。用透明封膜密封。
- 按上述条件（步骤1.1）分别培养24小时、48小时或72小时。在指定时间点，从每孔中取出250 µL细胞悬液，转移至1.5 µL微量离心管中。
- 在1,000 × g 条件下离心1分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于50 µL生长培养基中，并涡旋振荡。
- 取15 µL细胞悬液滴加到载玻片上，加盖22 × 22盖玻片（厚度1.5）。使用TRITC滤光片在10×–20×荧光显微镜下观察细胞。
- 采集至少50–100个细胞的图像。对每个细胞，测量并记录其总长度以及暗区长度（即标记后孵育期间新生成的细胞壁部分）。
- 计算培养物中新细胞壁的平均百分比。对48小时和72小时收集的细胞重复该步骤，以获得随时间变化的细胞壁扩展信息。
注意：步骤3.5–3.8可获得浓度较高的细胞悬液，便于在单个视野中观察多个细胞，从而显著提高手动测量的效率。许多相机配套软件可提供便捷甚至自动化的细胞尺寸测量功能，适用于该藻类。此外，也可收集细胞并按上述方法用JIM5标记，但将二抗替换为抗大鼠FITC。使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），可同时用FITC和TRITC滤光片成像。荧光信号可分别赋予不同的伪彩色，从而能够区分不同处理条件下新形成的细胞壁结构（JIM5-FITC标记）与标记前的原有细胞壁（JIM5-TRITC标记）。
4. 细胞壁扩展的延时成像
- 按照上述方法（步骤 2.1–2.8）用 JIM5-TRITC 标记细胞壁。将细胞用 WHM 稀释 10 倍，取 50 µL 细胞悬液滴加到盖玻片或玻璃底培养皿上。
- 在避光条件下静置 2 分钟，使细胞贴附于玻璃表面。用 1 mL WHM 轻轻冲洗未贴附的细胞，使用移液器将 WHM 逐滴小心加入玻璃表面。
- 在贴附于玻璃表面的细胞上加入 30 µL WHM。再在 WHM/细胞液滴上方加入 30 µL 温热的 4% 琼脂糖/WHM 溶液。让琼脂糖自然冷却至室温并凝固。
- 对于培养皿中的样品，加入足量 WHM 以完全覆盖包埋在琼脂糖中的细胞。对于盖玻片上的细胞，将盖玻片翻转，轻轻放置在盛有 WHM 的凹面载玻片上。
- 将样品置于荧光显微镜下观察。可设置外部光源（灯），或利用显微镜自身的光照为细胞生长和运动提供能量。在 Olympus Ix83 或 Ix63 显微镜上，透射光灯电压设为 5–6 V 效果较好。具体参数可能需根据您的系统进行优化。
- 使用 TRITC 滤光片每 10–30 分钟拍摄一次图像，以追踪细胞壁扩展情况。如有需要，可在步骤 3.8 所用的 WHM 中添加化学试剂或酶。
5. 观察胞外聚合物（EPS）的产生
- 细胞制备：从培养10至14天的培养物中取5 mL细胞，按上述步骤1-4进行洗涤。
- 荧光微球制备：向1.5 mL微量离心管中加入1滴（约100 µL）0.75 µm荧光微球（Polysphere）。向管中加入1 mL WHM，并剧烈振荡以重悬微球。在10,000 × g 条件下离心3分钟。弃去上清液。向沉淀中加入1 mL WHM并振荡。再次在10,000 × g 条件下离心3分钟。将沉淀重悬于500 µL WHM中。
- 孔板准备：向12孔板的各孔中加入1 mL WHM培养基。加入抑制剂或生长调节剂至所需浓度，并轻轻摇晃混匀。向每孔中加入10 µL微球溶液，并轻轻摇晃孔板以分散微球。再向每孔中加入10 µL洗涤后的细胞，并轻轻摇晃孔板。
- 按上述（1.1）条件培养细胞。24小时后，将孔板轻轻置于配备FITC滤光片的倒置荧光显微镜上（注意避免扰动液体）。微球会黏附于胞外多糖（EPS），从而显示出EPS释放的模式。以4×、10×或20×放大倍数拍摄细胞图像。
6. 胞外多糖轨迹形成的延时成像
- 按照上述步骤准备的12孔板（步骤3.2）或单个培养皿中进行延时成像。执行步骤1-4。细胞培养时无需使用荧光灯照明，而可在倒置荧光显微镜上固定后进行培养。
- 每5-10分钟对细胞成像一次，以最佳捕捉细胞运动过程。使用FITC滤光片组可观察到荧光微球；但对于高浓度微球，建议使用明场通道。可设置外部光源（灯），或利用显微镜自身的光照为细胞生长和运动提供能量。在Olympus Ix83显微镜上，透射光灯电压设为5-6 V效果较好。具体参数可能需要根据您的系统进行调试和优化。
7. 利用扫描电子显微镜（SEM）对细胞壁进行相关结构分析
注意：在用细胞特异性抗体标记的活细胞中观察到的细胞壁结构改变，可通过扫描电镜（SEM）成像以获取其详细特征。这种关联分析方法可获得超微结构数据，并可与荧光数据进行比较。
- 取1 mL细胞悬液（对照组或实验处理组）至1.5 mL微量离心管中。在4,000 x g 1 分钟。
- 弃去上清液。将含有沉淀的离心管浸入液氮中，若无液氮，则置于-80 °C冰箱中。冷冻细胞可在-80 °C条件下保存数月。
- 在进行细胞壁处理时，将离心管从冷冻器中取出，室温解冻15分钟。用20 µL WHM重悬沉淀，取一滴浓细胞悬液置于45 mm × 50 mm的盖玻片上。
- 在液滴上放置第二块盖玻片，形成三明治结构。将其置于实验台上，持续按压该三明治结构以破裂细胞（例如 30 s）。
- 小心分离玻璃盖玻片，将破裂的细胞冲洗至15 mL离心管中。500 × g离心 g 1 分钟。
- 弃去上清液。沉淀物应呈白色或微绿色。如果后续成像显示细胞破裂数量不足，可将此处的沉淀物重新进行步骤3。
- 将含有细胞壁的沉淀重悬于 D-H 中2O，并重复步骤 7.4 和 7.5。将沉淀重悬于 100 µL 的 D-H2O，并将其放入一个1.5 mL离心管中。
- 获取一个剑桥载台（6 mm 或 8 mm 半径），并在其表面粘贴碳导电胶带（EMS）。随后，将 5 µL 重悬的细胞壁悬液（步骤 7）滴加到碳胶带上。使用解剖显微镜观察细胞壁的数量。若悬液过于浓密，可用去离子水（D-H2O）稀释。
- 将载片放入有盖容器中干燥（2小时至过夜）。使用钯靶对载片进行溅射镀膜，时长50秒（也可使用其他靶材）。在距二次电子探测器10 cm处，以5 kV加速电压和指定束斑尺寸观察细胞。
注意：在将悬液滴加到碳胶带上之前，先稀释细胞壁悬液，可防止细胞壁相互重叠沉积。
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结果
P. margaritaceum 细胞壁经抗果胶单克隆抗体（如 JIM5）标记后，显示出由钙离子复合纤维及突起构成的规则网状结构或晶格模式（图1）。果胶沉积于细胞中央或峡部区域，并将较早形成的果胶向两极方向推移（图2）。使用另一种果胶抗体（如 JIM7）进行标记，可突出显示在峡部狭窄区域初始分泌的高甲酯化果胶（图3A、B）。细胞壁中还存在其他多聚物，包括可被单克隆抗体 JIM13 标记的阿拉伯聚糖蛋白（图4）。大量胞外多糖（EPS）被分泌至细胞壁外部（图5），支持细胞的滑行运动及细胞聚集体的形成。上述多种标记技术可整合应用于发育过程的研究中，包括对细胞壁和细胞扩展的定量分析（图6）。同样，利用扫描电镜（SEM）对果胶进行关联结构研究...
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讨论
P. margaritaceum 是研究植物和链型藻类细胞壁发育及胞外基质（ECM）分泌动态过程的有效模式生物。其主要特征包括：单细胞生长习性，易于培养和实验操作；具有初生细胞壁，其外层为明显的果胶晶格结构并含有其他多糖成分；可利用靶向细胞壁的单克隆抗体（mAbs）对活细胞进行标记，并能随时间追踪其发育过程或开展后续实验研究；能够产生大量胞外多糖（EPS），可通过荧光微球实现实时监测1,2,3,6。此外，大多数标记技术均可提供简便的定量检测手段。
P. maragaritaceum 是一种较为强健的生物体，可耐受本文所述实验方案的一些小幅调整。但需注意以下几点：a）用于免疫细胞化学实验和实验操作的细胞，应取自培养时间少于21天的培养物；b）培养温度不应超过28 °C；c）抗体稀释比例应严格按照...
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披露
未报告任何利益冲突。
致谢
本工作由美国国家科学基金会（NSF）资助（MCB 项目编号 2129443，授予 DD）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微量离心管 | Fisher Scientific | 01-549-740 | |
| 12孔微孔板 | Fisher Scientific | 50-233-6077 | |
| 22 x 22 mm 盖玻片 | Fisher Scientific | 12-541-016 | |
| 45x50 厘米盖玻片 | 脑科学研究 | 4550-1.5D | |
| 琼脂 | Sigma Aldrich | A9414 | |
| 抗大鼠 FITC | Sigma Aldrich | F6258 | |
| 抗大鼠 TRITC | Sigma Aldrich | T4280 | |
| 氯化钙 | Sigma Aldrich | C4981 | |
| Cambbridge 插头 | EMS | 75183-65 | |
| Fluoview 共聚焦激光扫描显微镜 | 明显 | Fluoview 1200 | |
| JIM5 | Kerafast | ELD004 | |
| JIM7 | Kerafast | ELD005 | |
| 微型离心机 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| 微量移液器 | 伯乐（BioRad） | 1660499EDU | |
| Penium margaritaceum | 萨姆勒藻类培养物收藏中心ät Gö蒂宾根 - G藻类培养收集中心ö蒂宾根大学 | 2640 | |
| Polysphere试剂盒 | Polysciences | 18336 | |
| 扫描电子显微镜 | ThermoFisher | Quattro SEM | |
| 溅射镀膜仪 | EMS | Q150V | |
| 涡旋混合器 | Fisher Scientific | 02-215-414 |
参考文献
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