实验筛选方案、免疫细胞化学及基于显微镜的成像技术在Penium margaritaceum中的应用

摘要

本报告介绍了培养和实验操作单细胞链型植物藻类Penium margaritaceum的基本方法。同时提供了基于显微镜成像的基本实验方案，包括利用单克隆抗体和其他荧光探针对活细胞进行标记以及扫描电子显微镜观察。

摘要

细胞壁是植物细胞在发育过程以及响应非生物和生物环境胁迫时进行信号接收与转导的第一个组分。细胞会持续监测其细胞壁的完整性，并在胁迫条件下对其进行调控。阐明细胞壁中发生的特定结构与生化改变是一项具有挑战性的任务，尤其是在使用多细胞植物及其器官或组织时。这主要是因为在一个复杂的多细胞网络中的单个细胞所能解析的信息存在局限性。近年来，单细胞轮藻门绿藻Penium margaritaceum已被用于研究果胶动态、基于细胞壁的表型可塑性以及藻类细胞生物学的多个方面。该藻表型简单，细胞壁结构清晰，且含有许多与陆生植物细胞壁高度相似的组分，加之其在免疫细胞化学和实验研究中的操作便捷性，使其成为植物细胞壁生物学研究中一个强有力的模式生物。本研究旨在提供一系列基本技术，用于该藻的培养、实验处理以及外加胁迫因子的筛选。同时包括用于细胞壁结构研究的免疫细胞化学、共聚焦激光扫描显微成像和扫描电子显微成像的筛选方案 。此外，文中所述许多技术也可经适当修改后应用于其他广泛的细胞与分子生物学研究。

引言

植物的细胞壁是一个复杂的聚合物网络，在植物细胞的生命活动中具有多种功能¹。细胞在发育过程中以及响应环境胁迫时，会持续监测细胞壁的完整性，并相应地调节其化学组成和结构。Penium margaritaceum 是一种单细胞绿藻，近年来已被用于链型藻类（Streptophyta，即与陆生植物亲缘关系最近且为陆生植物祖先的绿藻类群）的研究²。

在过去的二十年中，P. margaritaceum 一直是研究细胞壁和细胞外基质动态、内膜系统活动、细胞形态发生以及植物进化的重要模式生物^{3,4,5,6,7,8,9,10,11}。本研究的目的是为植物细胞壁研究人员提供....

方案

注意： Penium margaritaceum 在获得时 哥廷根大学藻类培养物收集中心 - 哥廷根大学藻类培养中心（SAG）；菌株编号 #2640。

1. 培养物的维持

1. 将藻类培养于液体伍兹霍尔培养基（WH¹²）中，该培养基可额外添加土壤水提取物（即每升培养基添加40 mL）。培养条件为20–25 °C，光照周期为16小时光照:8小时黑暗，光照强度为3.5 klux（74 µmol 光子/m²/s）的冷白色荧光灯。
2. 每周进行一次继代培养，使用培养10–14天的细胞。Penium 培养物在6个月内保持活性，期间可用于启动继代培养。该藻类也可在1%–2%琼脂固化的WHM培养基上生长。
3. 为实现常规细胞周期同步，将培养10–14天的藻细胞置于20–25 °C黑暗环境中处理2–6周。处理结束后，用新鲜WHM洗涤细胞（见下文），然后按上述条件进行培养。

2. 使用单克隆抗体标记细胞壁

注意：P. margaritaceum 具有一层初生细胞壁，其成分与陆生植物初生细胞壁中的许多成分相同

结果

P. margaritaceum 细胞壁经抗果胶单克隆抗体（如 JIM5）标记后，显示出由钙离子复合纤维及突起构成的规则网状结构或晶格模式（图1）。果胶沉积于细胞中央或峡部区域，并将较早形成的果胶向两极方向推移（图2）。使用另一种果胶抗体（如 JIM7）进行标记，可突出显示在峡部狭窄区域初始分泌的高甲酯化果胶（图3A、B）。细胞壁中还存在其他多聚物，包括可被单克隆抗体 JIM13 标记的阿拉伯聚糖蛋白（图4）。大量胞外多糖（EPS）被分泌至细胞壁外部（图5），支持细胞的滑行运动及细胞聚集体的形成。上述多种标记技术可整合应用于发育过程的研究中，包括对细胞壁和细胞扩展的定量分析（图6）。同样，利用扫描电镜（SEM）对果胶进行关联结构研究.......

讨论

P. margaritaceum 是研究植物和链型藻类细胞壁发育及胞外基质（ECM）分泌动态过程的有效模式生物。其主要特征包括：单细胞生长习性，易于培养和实验操作；具有初生细胞壁，其外层为明显的果胶晶格结构并含有其他多糖成分；可利用靶向细胞壁的单克隆抗体（mAbs）对活细胞进行标记，并能随时间追踪其发育过程或开展后续实验研究；能够产生大量胞外多糖（EPS），可通过荧光微球实现实时监测^1,2,3,6。此外，大多数标记技术均可提供简便的定量检测手段。

P. maragaritaceum 是一种较为强健的生物体，可耐受本文所述实验方案的一些小幅调整。但需注意以下几点：a）用于免疫细胞化学实验和实验操作的细胞，应取自培养时间少于21天的培养物；b）培养温度不应超过28 °C；c）抗体稀释比例应严格按照.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Fisher Scientific	01-549-740
12孔微孔板	Fisher Scientific	50-233-6077
22 x 22 mm 盖玻片	Fisher Scientific	12-541-016
45x50 厘米盖玻片	脑科学研究	4550-1.5D
琼脂	Sigma Aldrich	A9414
抗大鼠 FITC	Sigma Aldrich	F6258
抗大鼠 TRITC	Sigma Aldrich	T4280
氯化钙	Sigma Aldrich	C4981
Cambbridge 插头	EMS	75183-65
Fluoview 共聚焦激光扫描显微镜	明显	Fluoview 1200
JIM5	Kerafast	ELD004
JIM7	Kerafast	ELD005
微型离心机	Fisher Scientific	13-100-675
微量移液器	伯乐（BioRad）	1660499EDU
Penium margaritaceum	萨姆勒藻类培养物收藏中心ät Gö蒂宾根 - G藻类培养收集中心ö蒂宾根大学	2640
Polysphere试剂盒	Polysciences	18336
扫描电子显微镜	ThermoFisher	Quattro SEM
溅射镀膜仪	EMS	Q150V
涡旋混合器	Fisher Scientific	02-215-414