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方法文章

在陆地气候条件下对土耳其扁豆田间枯萎病和根腐病的筛查

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DOI：

10.3791/68156

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2025年4月11日

 ,  ,  , 
1Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, Yozgat Bozok University, 2Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, University of Tokat Gaziosmanpaşa, 3Department of Field Crops, Faculty of Agriculture, Yozgat Bozok University

本文内容

摘要

一项在约兹加特省开展的研究发现，萎蔫病和根腐病等真菌病害之类的生物因素限制了扁豆的生产。Fusarium 分离物在95.4%的样品中被检出，表明需要进行定期的本地调查和持续监测，以推动可持续技术的发展并制定有效的防控策略。

摘要

扁豆是一种重要的自花授粉豆科作物。其生产常受到多种生物因子的限制，尤其是引起枯萎病和根腐病复合症的真菌病原体。本研究旨在了解植物病原真菌的区域流行病学和病因，以制定针对土传病害的防控策略 镰刀菌属 spp. 本研究调查了约兹加特省83个扁豆播种地点的枯萎病、根腐病和冠腐病，这些病害由常见的 镰刀菌属 2022年和2023年期间的物种。采集有症状的扁豆植株用于真菌分离与鉴定。 镰刀菌属 根据菌落形态将分离物分组，并在PDA培养基上培养。此外，从获得的基因组DNA 镰刀菌属 分离株通过PCR进行分析，并与其他菌株进行比较 镰刀菌属 在NCBI GenBank中登记的分离株。各分离株间的遗传关系 镰刀菌属 使用 Mega 11 软件中的最大简约法（Maximum Parsimony, MP）确定了分离株的系统发育关系。约兹加特省枯萎病和根腐病的平均发病率和病情严重度分别为 16.9% 和 38.6%。 镰刀菌属 在95.4%的样本中检测到分离株。各分离株间的核苷酸序列同源性为99.5%至100%。 F. oxysporum, F. culmorum, F. graminearum, F. acuminatum 和 F. solani 分离株，其中分离次数最多的物种是 F. oxysporum. MP系统发育树的 镰刀菌属 分离株分为两个主要分支，第一个分支包含所有 F. solani 分离株。第二个主要分支包含其他 镰刀菌属 本研究及NCBI GenBank中分离的物种。该研究建议定期开展本地调查，以确定其出现频率 镰刀菌属 小扁豆中抑制萎蔫。及时抑制 镰刀菌属基于损伤的防控措施被强烈建议用于控制该病害并保护扁豆生产体系。

引言

扁豆（Lentil）扁豆 Medik.)，一种属于豆科的小型可食用籽粒豆类 豆科 豆科植物是一种自花授粉的冷季作物，具有针状叶片，花色从白色到淡紫色或深紫色。1大约10,000年前，人类在肥沃新月地带的美索不达米亚地区将其驯化，随后迅速传播至包括地中海流域和中亚在内的新地区，之后又归化于美洲2全球扁豆种植面积约为550万公顷，产量为660万吨3土耳其排名第四th 在扁豆生产方面，土耳其仅次于加拿大、印度和澳大利亚。土耳其的扁豆种植非常重要，占全球产量的6.7%。土耳其扁豆总产量为47.4万吨，至少在40个省份进行种植。4土耳其红扁豆和绿扁豆产量约占其扁豆总产量的89.5%，在安纳托利亚东南部地区占冬季作物的10.5%。其余作物作为夏季作物种植。约兹加特（39.5%）、科尼亚（23.7%）、克尔谢希尔（16.3%）、乔鲁姆（7.6%）和安卡拉（2.9%）等省份是绿扁豆生产的主要产区。4扁豆的产量可能受到生物和非生物胁迫因素的限制。在夏季绿皮扁豆生产中，霜冻和干旱是最常见的非生物胁迫因素。5由真菌引起的病害，如枯萎病、根腐病和冠腐病复合体 Ascochyta lentis, Rhizoctonia solani, R. bataticola，Aphanomyces euteiche，Pythium 和 镰刀菌属 丝核菌属（Rhizoctonia）和疫霉属（Phytophthora）是最重要的真菌病害，其引起的病害类型包括猝倒病、苗枯病、萎蔫病和根腐病，具体表现取决于侵染时间、寄主敏感性以及气象条件。6,7,8.

镰刀菌属 是一种存在于土壤、植物和有机基质中的丝状不完全真菌，在这些病原体中属于广泛分布的属9导致多种疾病，例如 镰刀菌属 枯萎、根腐和根颈腐病，以及小麦赤霉病、葫芦科植物的镰刀菌枯萎病和包括扁豆在内的大多数豆科植物的根腐病10,11,12. 由以下病原体引起的维管束萎蔫、根部及根颈腐烂 镰刀菌属 spp. 是全球许多扁豆种植区最重要的病害10. 尖孢镰刀菌 最常见的 镰刀菌属 与扁豆枯萎病、根腐病及根颈腐病相关的物种。在全球范围内，枯萎病、根腐病和冠腐病由以下病原引起 F. graminearum，F. sporotrichioides，F. equiseti，F. acuminatum，F. redolens，F. avenaceum，F. culmorum，F. solani 和 F. verticillioides 在扁豆种植区7萎蔫病、根腐病和冠腐病由 镰刀菌属 spp. 在幼苗期和成株期均可发生，导致叶片突然萎蔫、干枯，最终死亡。该病的症状包括种子腐烂、根部腐烂、上部小叶萎蔫、植株矮化、叶片皱缩和卷曲。在荚果发育的中后期，种子通常皱缩；根部症状包括生长受阻、根部呈褐色变色、主根根尖受损以及侧根大量增生。并非所有情况下均可观察到维管组织变色现象。13.

在安纳托利亚中部地区，关于扁豆枯萎病和根腐病发生状况的研究数量有限。与夏季相比，约兹加特冬季降水充沛，气候温和适中，根据柯本与盖格气候分类法被划分为Dsb型（温暖湿润大陆性气候）14。该地区年平均气温为9.6 °C，年平均降水量为512 mm。约兹加特位于北半球，夏季出现在6月、7月、8月和9月。了解引起病害的植物病原真菌在区域内的流行病学和病原学特征，对于制定针对土传Fusarium spp.的不同防控策略至关重要15。基于此，本研究旨在通过对约占全国绿扁豆总产量40%的单一化种植区——约兹加特省开展调查，评估并确定扁豆枯萎病、根腐病和冠腐病的病害参数（病害普遍性、发病率和严重程度）；通过形态学和分子分析鉴定引起扁豆枯萎病和根腐病的致病性Fusarium物种；并通过致病性试验测定各Fusarium物种的个体毒力水平。

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方案

注意：本研究中所用试剂和设备的详细信息列于材料表中。

1. 野外调查、取样与真菌分离

注意：根据 Endes16 的方法，于 2022 年和 2023 年开展了调查工作。共调查了位于约兹加特省九个地区的 83 个扁豆种植区，观察其枯萎病、根腐病和根颈腐烂病的发生情况（图 1）。

  1. 选择面积超过1000 m2的扁豆田作为采样区域。从田块边缘以之字形沿对角线随机走向田中心或中间位置，使用1 m2的取样框，在至少三个随机选定的不同点随机放置取样框进行采样。从每个点采集表现出病害症状的扁豆植株，放入纸袋中，并转移至实验室用于真菌分离与鉴定研究。
    注：转移至实验室的病株根部及根颈部位首先用自来水冲洗以去除粗大残留物；随后按照Endes16所述方法进行表面消毒，以分离真菌病原体。
  2. 将病组织浸泡于70%乙醇中10–15秒，然后用无菌水冲洗3次，每次3分钟。再将所有组织置于1%次氯酸钠（NaOCl）中5分钟，之后再次用无菌水冲洗3次，每次5分钟。
  3. 在无菌操作台中将湿润的植物组织置于滤纸上干燥，完成表面消毒过程。随后，将已消毒的植物组织切成5–10 mm长的小段，每段取4–5块置于含0.01%链霉素的PDA培养基（直径90 mm的培养皿）中。将培养皿置于25 ± 1 °C黑暗条件下培养4–7天，观察真菌生长情况。
    注：所获得的真菌分离物通过单孢子分离法进行纯化。为此，本研究对Choi等17关于子囊菌门、担子菌门、腔孢菌纲和丝孢菌纲真菌单孢子培养物获取方法进行了修改并采用如下所述方法。
  4. 为纯化真菌分离物，将分离实验结束时获得的真菌分离物置于25 ± 1 °C培养箱中，在12小时荧光光照/12小时黑暗条件下培养15天，以促进其在PDA培养基上形成无性繁殖结构。
  5. 用刮铲从15天龄的培养物中称取约100 mg真菌菌丝体，转移至1.5 mL无菌微量离心管中，再用无菌塑料研杵充分研磨以实现均质化。
  6. 加入1 mL无菌水，涡旋振荡1分钟，确保孢子充分转移至水中。为调节进入水中的孢子数量，用移液器吸取20 µL该混合液，在光学显微镜10倍物镜下观察孢子数量。
  7. 若孢子数量超过所需量，可将孢子-水混合液按1/10、1/100、1/1000等比例稀释，直至显微镜视野中每视野含有4–6个孢子为止。
  8. 取100 µL制备好的孢子悬浮液，转移至含补充0.1%链霉素PDA培养基的90 mm直径培养皿中，然后用Drigalski涂布棒将悬浮液均匀涂布于PDA表面。
  9. 将制备好的培养皿置于25 ± 1 °C黑暗条件下培养12–24小时。培养结束后，用接种环挑取由单个分生孢子发育而成的菌丝小片段，转移至含有PDA培养基的新培养皿中。每个由单个孢子获得的培养物即为单孢子纯培养物。保存这些纯培养物，用于致病性试验以及形态学和分子鉴定。
    注：主要目的是在不改变真菌分离物形态、遗传特性和毒力的前提下长期保存其活性。本研究采用两种不同方法进行保存18,19。以下将详细说明本研究所使用的所有保存方法。
    1. 第一种样品保存方法如下：将真菌分离物在25 ± 1 °C、12小时光照/12小时黑暗条件下于PDA培养基上培养15天，获得直径为4 mm的菌丝圆盘，可用于无菌水中保存。
    2. 使用打孔器从上述条件下生长的真菌培养物中切取菌丝圆盘（直径4 mm，共10片），转移至含有1 mL无菌水的微量离心管中。将样品置于-20 °C冰箱中保存6个月。
    3. 第二种样品保存方法如下：首先用接种环从单孢子纯培养物中挑取少量纯菌丝块，转移至含有添加氯霉素、乳酸、氨苄青霉素、利福平、四环素、链霉素等抗生素的PDA培养基的培养皿中。
    4. 在25 ± 1 °C、12小时光照/12小时黑暗条件下预培养5–10天后再进行保存。将1 cm × 1 cm的通用滤纸剪成小片，在121 °C、15 psi条件下高压灭菌60分钟。
    5. 将灭菌后的滤纸片放入新的培养皿中，培养基可为相同或选择性培养基。从纯真菌培养物中切取菌落或孢子，放置于每片滤纸表面。
    6. 密封培养皿后置于上述适宜生长条件的培养箱中培养。真菌分离物在滤纸上缓慢生长，约培养15天以确保完全定殖。
    7. 待滤纸上的真菌完成产孢或菌落完全形成后，将各滤纸片转移至不含培养基的新培养皿中。随后将培养皿放入培养箱中，直至滤纸和真菌完全干燥（约需20–30天）。
    8. 干燥后，将10片滤纸分别装入无菌纸信封中，标记每个信封，再将信封装入塑料袋中，并将装有信封的塑料袋置于透明塑料容器内，于-20 °C保存。
  10. 根据以下公式计算土耳其约兹加特省（Yozgat）扁豆萎蔫病、根腐病和冠腐病的发生率，计算时需考虑各扁豆田块的发病情况，并按省份下辖各区名称依次进行。
    病害发生率（%）= (a / b) × 100
    其中a表示发病田块数；b表示某区内调查的总田块数。
  11. 根据Bora和Karaca20报道的加权平均法计算病害发病率。统计田间每个样方内的植株数量，将每一样方内的植株分为病株与健康植株，并根据以下公式计算病害发生率。
    病害发生率（%）= (x / y) × 100
    其中x表示病株数；y表示调查的总植株数。
  12. 根据Öğüt21提出的0–4级病害严重度分级标准计算病害严重度，分级标准如下：0 = 无症状；1 = 25%叶片出现轻度症状；2 = 26%–50%叶片出现中度症状；3 = 51%–75%叶片出现严重黄化和萎蔫；4 = 超过75%植株出现极严重黄化、萎蔫、干枯、落叶、生长迟缓或死亡等症状（按此顺序）（图2）。
  13. 利用所得的分级数值，按以下公式计算病害严重度16。
    病害严重度（%）= [∑ [ i (ni × vi) / (V) × N)] × 100
    其中ni表示某一级别中的植株数；vi表示该级别的评分值；V表示最高评分值；N表示观察的总植株数；i表示级别数量。

2. 气象数据

  1. 开展调查研究。本方案中，调查在2022年和2023年的5月和6月期间进行。从约兹加特省气象局获取2022年、2023年及多年同期3月至7月的气温、相对湿度和总降水量数据（表1）。

3. 形态学鉴定

  1. 比较菌落特征（菌落颜色、气生菌丝、菌丝生长速率）和分生孢子特征（分生孢子大小、形态、颜色及隔膜数目） 镰刀菌属 将分离物与早期研究结果进行比对，并初步鉴定真菌种类。
  2. 从各组中选取代表性样本用于形态学鉴定。按照上述单孢子分离方法对这些样本进行纯化。在此期间，观察菌落色素特征 镰刀菌属 分离物以及微/大分生孢子和厚垣孢子结构。
  3. 为促进所获纯真菌培养物中微/大分生孢子及厚垣孢子等微形态结构的形成，将培养物置于PDA培养基上，在25 ± 1 °C、12小时黑暗:12小时光照条件下于培养箱中培养25–30天。测量每种分生孢子的长度和宽度 镰刀菌属 使用光学显微镜进行观察分离。此外，利用配备数字相机的光学显微镜记录分生孢子的结构、形状、颜色以及有无隔膜。
  4. 根据上述观察结果，将 镰刀菌属 根据 Leslie 和 Suerell 所述的方法按物种水平分离菌株22.

4. 分子鉴定

注意：采用以下方法提取尖孢镰刀菌（Fusarium）分离株的总基因组DNA，该方法略作修改自Cenis23的实验方案。尖孢镰刀菌分离株的PCR分析及电泳操作均依据Aras和Endes24所述方案进行。

  1. 真菌基因组DNA提取
    1. 从新鲜培养物（10天龄）中 镰刀菌属 在PDA培养基上培养的菌株，用无菌解剖刀刮取100 mg菌丝体，转移至2 mL微量离心管中。将离心管于-20 °C孵育过夜。
    2. 过夜孵育后，向各管中加入500 µL DNA提取缓冲液（200 mM Tris-HCl pH: 8.5，250 mM NaCl，25 mM EDTA，0.5% 十二烷基硫酸钠），并用无菌塑料研磨棒研磨破碎。
    3. 随后，向各管中加入 150 µL pH 5.2 的 3M 醋酸钠（NaOAc），在 -20 °C 下孵育 30 分钟。此步骤完成后，于 4,000 x g 10 分钟。
    4. 离心后，将管子顶部的400 µL上清液转移至新的1.5 mL离心管中，并加入等体积的异丙醇（2-丙醇）。将新离心管于-20 °C孵育30分钟。在此期间，轻柔混匀管内液体5至6次。
    5. 在 4,000 x g 10分钟以沉淀基因组DNA，弃去管中所有残留液体。
    6. 向管底含有基因组DNA的白色或乳白色沉淀中加入1 mL 70%乙醇。轻轻上下颠倒混匀4–5次，持续约1分钟，随后弃去管中所有乙醇。然后将管盖打开置于超净工作台中30分钟，使DNA沉淀中的乙醇完全蒸发。
    7. 为溶解基因组DNA并长期保存，向各管中加入50 µL TE缓冲液（1M Tris-HCl pH: 8.0；0.5M EDTA pH 8.0），并将试管置于65 °C水浴中孵育1小时。在此期间，轻柔上下颠倒混匀8–10次。将溶解于TE缓冲液中的基因组DNA置于-20 °C超低温冰箱中保存，用于后续分子生物学研究。
  2. 用于PCR研究时，使用寡核苷酸引物ITS5 F（5′GGAAGTAAAGTCGTAACAAGG3′）/ ITS4 R（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）扩增rDNA的ITS区域25每次PCR反应使用2.5 µL的10x PCR缓冲液、2.5 µL的MgCl2 (25 mM)、2.5 µL dNTP (2 mM)、0.5 µL 正向引物 (10 µM)、0.5 µL 反向引物 (10 µM)、2 µL 模板 DNA、0.5 µL Taq DNA 聚合酶 (1 U/µL, Fermantas) 及 14 µL 无菌去离子水，总体积为 25 µL。
  3. 对于25 µL的PCR反应，运行以下PCR程序：95 °C预变性2 min，随后进行40个循环：95 °C变性30 s，55 °C退火45 s，72 °C延伸90 s，最后72 °C终延伸5 min。将PCR产物在1×TAE（Tris碱-冰乙酸-EDTA）缓冲液配制的1.5%琼脂糖凝胶中，90 V电压下电泳1.5 h。
    1. 为制备用于凝胶电泳的TAE缓冲液，将242 g Tris碱溶解于700 mL无菌水中；加入57.1 mL冰醋酸；加入100 mL 0.5 M EDTA溶液，并用无菌水定容至1 L。将1 L 50x TAE缓冲液的最终pH值调节至8.5。配制1x TAE工作缓冲液时，按1份50x TAE缓冲液加入49份无菌水的比例稀释。
  4. 用0.5 µg/mL溴化乙锭对凝胶染色，并在紫外透射仪上观察。
  5. 为了分析根腐病和冠腐病病原菌分离物之间的系统发育关系，通过PCR扩增获得ITS基因的碱基序列，该序列由供应商双向合成（5´-3´和3´-5´）。将所得序列与NCBI（国家生物技术信息中心）网站上的基因数据及其他病原菌ITS基因的碱基序列进行比对 镰刀菌属 使用Blast程序鉴定全球范围内的分离株。按照下述方法利用该程序在物种水平上鉴定分离株。
    1. 前往 https://www.ncbi.nlm.nih.gov 网站。点击 BLAST 热门资源部分的标签
    2. 点击 核苷酸BLAST 在新窗口的“输入查询序列”部分，以 FASTA 格式输入碱基序列，并在“任务标题”部分填写研究名称。
    3. 随后，检查 标准数据库（nr 等） 在底部的“选择搜索集”部分的“数据库”选项卡中。
    4. 检查 高度相似序列（megablast） 在“程序选择”部分的“优化”选项卡中，点击 BLAST 页面底部的标签
  6. 使用 MEGA 11 系统发育分析程序确定以下序列之间的系统发育关系 镰刀菌属 分离物。使用 ClustalW 程序对碱基序列进行比对，并根据 ITS 基因的最大简约法构建分离物的遗传系统发育树26.
    1. 下载 MEGA 软件，请访问网站 https://www.megasoftware.net 并安装 MEGA 软件。MEGA 软件在科研和教育领域可免费使用。
    2. 首先，将序列以 FASTA 格式保存在桌面的记事本文件（.txt）中。运行 Mega 软件程序，然后点击 对齐 标签。单击 编辑/构建比对 在窗口中。随后，检查 创建新的比对 在新窗口中并单击 好的 以确认。
    3. 点击 DNA 删除窗口中自动出现的 1. 序列，然后转到编辑文件，点击 从文件插入序列 打开位于桌面的包含序列的记事本（.txt）文件。
    4. 此时，所有序列均显示在屏幕上。首先，点击 任意序列 屏幕上显示的内容，然后标记所有序列 CTRL + A打开对齐文件并点击 使用 Clustal W 进行比对 从那里，点击 好的 以默认设置运行程序。
    5. 在分析序列比对的差异后，转到数据文件，点击 系统发育分析 然后点击 无 在窗口中勾选序列是否合成蛋白质的复选框。我们的序列不合成蛋白质，因为它们属于ITS区域。
    6. 返回 Mega 软件的主窗口。点击 系统发育 并选择 构建/检验最大简约树在新窗口中，选择 Bootstrap 方法 进行系统发育分析时，输入自举值（bootstrap values）1,000 以检验分支支持强度。在“Gaps/missing Data Treatment”选项卡中，选择 部分缺失，选择 子树剪切-重接（SPR） 作为MP搜索方法，然后单击 好的 以确认操作。
    7. 等待分析结果，显示系统发育树。

5. 致病性检测

  1. 对通过分子方法鉴定出的每种代表性Fusarium物种，各选取四个分离株进行致病性研究。在空调室内进行致病性研究，条件为24 °C、16小时荧光光照/8小时黑暗光周期，相对湿度65%。
  2. 将扁豆种子播种于带有45个直径5 cm孔洞的黑色塑料管中。将每个管中的种子在1%次氯酸钠溶液中浸泡3分钟，然后用无菌蒸馏水冲洗3次。在无菌操作台中干燥种子24小时，并在每个孔中播种一粒种子。
    注：所有致病性试验均使用对病害敏感的Kayı 91品种扁豆种子6。接种方法采用幼苗浸渍法27。
  3. 将每个分离株的纯培养物在PDA培养基中24 °C下培养7–10天。用接种铲刮取斜面培养物表面的菌落，用无菌蒸馏水制备孢子/菌丝悬浮液。
  4. 通过四层纱布过滤去除悬浮液中的大颗粒残渣，并借助血球计数板将孢子/菌丝浓度调整至1 × 106 个孢子/mL。
  5. 在此阶段之后，当先前在塑料管中生长的幼苗长出2–3片真叶时，将其拔出，用自来水冲洗根部，并用无菌针头轻微刺伤根部。将这些幼苗浸入制备好的孢子/菌丝悬浮液中3分钟，然后移栽至含有无菌土壤/泥炭（2:1，v/v）混合物的塑料管中。
  6. 对于对照组幼苗，拔出根部并进行刺伤处理后，仅浸入无菌水中，随后进行移栽。接种后3周，根据0–4级标准进行致病性试验评价。
  7. 将计算得到的病害严重度数值进行反正弦转换后，进行方差分析，并采用Tukey HSD（p = 0.05）检验评估平均值之间的差异。病害严重度分级标准如下：0%–15%的分离株评为极低毒力（LV），16%–35%的分离株评为低毒力（LV），36%–50%的分离株评为中等毒力（O），51%–70%的分离株评为高毒力（VV），71%–100%的分离株评为极高毒力（VV），无病害症状的分离株则评为腐生或表生型分离株。

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结果

疾病参数的测定
共评估了位于约兹加特9个不同地区的83个扁豆播种区的枯萎病、根腐病和冠腐病症状，调查范围达1.1984 × 10⁴ m²。6 m2 (表2）。所有田地中均出现了枯萎病或根腐病的症状。然而，约兹加特省的索尔根和萨里卡亚地区枯萎病和根腐病的发生率为16.9%，病害严重度为38.6%。谢法特利地区（26.4%）、博加兹拉扬地区（23.0%）和索尔根地区（20.1%）也表现出较高的病害发生率。矛盾的是，病害严重度最高的地区为索尔根（45.2%），其次为博加兹拉扬（36.0%）和萨里卡亚（35.4%）。此外，在所调查标记区域的扁豆田间采集的样本中，共有679株植株表现出病害症状（表3随后对分离得到的真菌病原体进行形态学鉴定，并将其分为两组。 镰刀菌 第一组中的分离物包括病原菌或腐生菌，如链格孢属（Alternaria sp.）、壳二孢属（Ascochyta sp.）以及 立枯丝核菌

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讨论

镰刀菌属 枯萎病在世界某些地区已知会造成严重的经济损失和产量下降31该疾病首次在匈牙利被报道32 随后在埃及、印度、缅甸、尼泊尔、巴基斯坦、Türkiye、叙利亚、美国等多个国家报道33. Kumar 等34 报道指出，扁豆枯萎病、根腐病和根颈腐烂病在全球至少26个国家均有发生，分布广泛。在最近一项研究中，从印度不同邦采集的感病扁豆植株中分离出12种真菌物种， F. oxysporum 专化型 lentis 被确定为最重要的病原体（30%），其次为 Rhizoctonia bataticola (17.5%) 和 Sclerotium rolfsii (15.7%)31同样，在本研究中，分离频率最高的真菌属是 镰刀菌属 （95.4%）。根据 Zitnick-Anderson 等人的研究

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由博祖克大学项目协调应用与研究中心（BAP）资助，项目编号为FÇD-2022-1096。本研究是Sevim Atmaca博士论文的一部分。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
(S)-乳酸Merck100366在研究中用作抗生素。
2-丙醇Merck109634用于分子学研究。
可调微量自动移液器（0.1–2.5 µL）Eppendorf ResearchLB.EP.3123000012用于测量液体的小体积。
可调微量自动移液器套装（2 – 20 µL，20 – 200 µL，100 – 1.000 µL）Eppendorf ResearchLB.EP.4924000916用于测量液体的小体积。
琼脂Merck110453用于真菌培养基的制备。
琼脂糖Sigma-Aldrich18300012用于电泳凝胶的制备。
空调室?klimlab用于在受控条件下培养植物。
氨苄青霉素Sigma-AldrichA9393在研究中用作抗生素。
分析精密天平Shimadzu ATX224用于称量研究中使用的固体材料。
高压灭菌器Zealway GF-120DR用于在研究的各个阶段对固体和液体材料进行灭菌。
双目显微镜Leica DM750用于形态学诊断。
生物安全柜HFsafe Class II A2用于确保工作区域、操作者、环境及实验操作的安全。
离心机DLAB DM1424LB.DL.903001124用于根据样品中颗粒的形状、大小和密度进行分离。
氯霉素Sigma-Aldrich220551在研究中用作抗生素。
打孔器套装Sigma-AldrichZ165220用于从培养皿中的真菌培养物中取样。
盖玻片和载玻片ISOLAB075.01.006 / 075.02.005用于显微镜研究的样品制备过程。
D(+)-葡萄糖一水合物Merck108342用于真菌培养基的制备。
带数码相机的DFC450Leica带C型接口的数码显微相机，配备500万像素CCD传感器。
Dm750双目显微镜 LeicaMIC5246用于真菌的形态学鉴定。
DNA凝胶电泳仪thermo fisher scientificB2-UVT
DNA凝胶上样染料（6x）Thermo ScientificR0611用于分子诊断。
dNTP混合液Thermo ScientificR0192用于分子学研究。
DreamTaq PCR预混液（2x）Thermo ScientificK1082用于分子诊断。
Drigalski刮铲ISOLAB082.03.001用于刮取和涂布培养皿中生长的真菌培养物。
EDTA Thermo Scientific17892用于分子诊断。
乙醇Merck100983用于分子学研究和表面消毒研究。
溴化乙锭Sigma-AldrichE7637用于在凝胶电泳过程中对凝胶中的DNA进行染色。
乙二胺四乙酸（EDTA）Sigma-AldrichE6758用于分子学研究。
滤纸ISOLAB107.58.158用于保藏培养研究。
强制通风干燥柜ZHICHENG ZXDS-A-1090用于孵育过程。
通风橱Elektromag EM1201LB.EM.EM1201用于控制有害的化学蒸气、气体和粉尘。
凝胶成像系统Syngene G:BOX Chemi XX6用于分子诊断。
GeneRuler 50 bp DNA MarkerThermo ScientificSM0372用于分子诊断。
冰醋酸Merck1005706用于分子学研究。
甘油Merck104094用于真菌保藏培养。
手术刀片ISOLAB048.50.002用于从植物样品中去除病变组织。
氯化镁Sigma-Aldrich814733用于分子学研究。
卷尺ISOLAB016.07.500用于测量液体体积。
微量离心管ISOLAB0778.03.001 / 0778.03.002 / 0778.03.003用于储存不同体积的液体。
PCR管ISOLAB123.01.002用于在PCR研究中盛装DNA混合液。
培养皿ISOLAB120.13.090用于真菌培养物的培养。
移液器吸头ISOLAB005.01.001 / 005.01.002 / 005.01.003 / 005.01.004用于转移分析中使用的液体体积。
塑料袋ISOLAB039.30.005用于将样品运送至实验室。
塑料盆ToXA用于植物培养。
钳子、夹子ISOLAB048.08.130用于在真菌于培养皿中生长后将滤纸放入信封中。
瓷研钵ISOLAB038.02.150用于研磨真菌菌丝。
马铃薯葡萄糖琼脂Condalab1022用于真菌的鉴定和培养。
纯水系统human CORPORATIONLT.HC.NHP009用于研究全过程中的溶液配制和分析。
冰箱（+4 °C / -20 °C）Vestel用于储存保藏材料。
利福平Sigma-Aldrich557303在研究中用作抗生素。
乙酸钠Merck106268用于分子学研究。
氯化钠Merck1064041000用于分子学研究。
十二烷基硫酸钠Sigma-Aldrich436143用于分子学研究。
次氯酸钠溶液Merck105614用于表面消毒。
刮铲ISOLAB047.33.210用于刮取培养皿中生长的真菌培养物。
硫酸链霉素BioShop CanadaSTP101用于防止真菌培养过程中的污染。
Teksoll超纯级TekkimTK.200650用于工作各阶段的消毒。
四环素Sigma-AldrichT3258在研究中用作抗生素。
PCR扩增仪（热循环仪）Bio?Rad T100用于基因组分析。
血球计数板（Thoma板）ISOLAB075.03.002用于孢子计数。
Tris HClRoche10812846001用于分子学研究。
TrizmaSigma-AldrichT1503用于分子学研究。
吐温80Merck822187用于致病性检测中的孢子溶液。
涡旋混合器（Vortex mixer）Velp WIZARDLB.VLP.F202A0175用于混合液体中的物质。
水浴锅Memmert WNB 221018-5702用于DNA提取研究中的孵育过程。

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