一种简单有效的方法，用于测试从人 CD14+ 单核细胞生成致耐受性树突状细胞的免疫调节剂

Summary

我们描述了一种程序，用于评估药物在 体外 从幼稚单核细胞衍生的树突状细胞产生耐受性树突状细胞的能力，并通过自体调节性 T 细胞生成验证其效力。

Abstract

致耐受性树突状细胞 （tolDC） 是树突状细胞 （DC） 的一个亚群，已知会影响初始 T 细胞向调节性 T 细胞 （Treg） 表型发展。TolDC 目前正在作为自身免疫和移植的疗法进行研究，既作为细胞疗法，也作为从内源性 DC 诱导 tolDC 的方法。然而，迄今为止，已知的从幼稚 DC 诱导 tolDC 的药物数量相对较少，并且它们在 体内 产生 Treg 的效力一直不一致，尤其是从内源性 DC 诱导 tolDC 的疗法。这为探索产生耐受性的新型化合物提供了机会。

在这里，我们描述了一种 在体外 单核细胞衍生的 DC （moDC） 上测试新型免疫调节化合物并验证其生成自体 Treg 的功能的方法。首先，我们获得 PBMC 并使用市售的磁性分离试剂盒分离 CD14 ⁺ 单核细胞和 CD3 ⁺ T 细胞。接下来，我们将单核细胞分化为 moDC，用已建立的免疫调节剂（如雷帕霉素、地塞米松、IL-10 或维生素 D3）处理它们 24 小时，并测试它们在耐受性标志物中的变化作为对方案的验证。最后，我们在抗 CD3/CD28 刺激存在下将诱导的 tolDC 与自体 T 细胞共培养，并观察 Treg 群体和 T 细胞增殖的变化。我们设想该协议用于评估新型免疫调节剂将已经分化的 DC 重新编程为 tolDC 的疗效。

Introduction

树突状细胞 （DC） 是先天免疫和适应性免疫之间的关键介质。DC 主要存在于粘膜、皮肤和淋巴组织中，是主要的抗原呈递细胞 （APC）¹。DC 摄取外来蛋白质并加工并呈递到幼稚 T 细胞的主要组织相容性 （MHC） 蛋白上。DC 特异性表达 MHC II 类蛋白，例如人类中的人类白细胞抗原 DR （HLA-DR）。抗原暴露时 DC 的激活状态对于下游 T 细胞反应至关重要²。未成熟的树突状细胞表达各种模式识别受体 （PRR），这些受体识别称为病原体相关分子模式 （PAMP） 的分子类别，例如细菌壁成分脂多糖 （LPS）³。PRR 刺激后，树突状细胞变成成熟的树突状细胞，上调重要的 T 细胞共刺激蛋白，如 CD80、CD86 和 CD40，并分泌促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α （TNFα），促进初始 T 细胞分化为常规效应 T 细胞或辅助性 T 细胞²。相反，如果 DC 成熟中断或 DC 在耐受性环境中发育，则 DC 可以产生耐受性 DC 状态 （tolDC）⁴。TolDC 下调经典 T 细胞共刺激受体，上调程序性细胞死亡配体 1 （PD-L1） 和 B 淋巴细胞和 T 淋巴细胞衰减剂 （BTLA） 等耐受受体，并产生白细胞介素 10 （IL-10） 和转化生长因子 β （TGF-β）⁴ 等抑制性细胞因子。这不是一个完整的公差标记列表，事实上，对于哪些 tolDC 标记适合定义 tolDC 状态⁵，共识有限。考虑到这一点，我们建议调节性 T 细胞 （Treg） 生成作为功能标志物，应用于比较各种 tolDC 诱导剂的有效性。

除了 tolDC/成熟 DC 激活状态外，还可以根据其谱系或组织位置对 DC 进行分类，每个子集显示的功能略有不同。虽然 tolDC/成熟 DC 分裂不太明确，并且更多地作为一个连续体存在，但谱系分裂在人和小鼠中都有明确的标志物。DC 前体在骨髓中形成，但根据其谱系，DC 有两种主要亚型：1） 浆细胞样树突状细胞 （pDC），来源于淋巴系，和 2） 常规树突状细胞 （cDC），来源于骨髓谱系。在人类中，pDC 在淋巴器官中成熟，表达 CD303，并且在病毒感染中具有高度反应性⁶。同时，表达 CD11c 的 cDC 在外周组织中成熟，并存在于两种不同的亚型中，即 CD1c⁺ cDC1 和 CD141⁺ cDC2，它们各自产生不同的 T 细胞反应⁷。此外，所有 cDC 都可以存在于组织驻留 （CD103^-） 或迁移 （CD103⁺） 亚状态⁸ 中。最后，在某些条件下，来自单核细胞谱系 （CD14⁺） 的细胞可以被诱导成树突状细胞表型，并被鉴定为 CD14^-、CD141⁺、CD1c^{+ 9}。这些细胞被称为单核细胞衍生的 DC （moDC），是人类 离体 分析最常用的细胞，因为单核细胞约占人类外周血单核细胞 （PBMC） 的 10-30%，而 pDC 仅占 1-3%¹⁰。这使得 moDC 成为一个有吸引力的选择，但众所周知，moDC 比从原代组织中分离的典型 cDC 更具炎症^{性 9}。

目前有两大类努力使用 tolDC 来产生临床耐受性。首先，tolDC 由单核细胞产生，用作细胞疗法。在这种范式中，moDC 通常使用 IL-4/GM-CSF 与免疫调节剂（如维生素 D3、雷帕霉素 （rapa）、IL-10、地塞米松或这些^11,12 的组合）进行区分。这些 tolDC 已被探索为自身免疫和移植的自体细胞疗法¹³。tolDC 的另一个用途是使用游离药物或纳米载体将内源性 DC 重编程为 tolDC，以递送免疫调节剂和目标抗原 14,15,16。然而，由于通常与 tolDC 代谢相反的 DC 的稳健代谢表型的发展，已经分化的 DC 的诱导更具挑战性^17,18。对于大多数药物免疫调节剂来说，这是一个很高的标准;出于这个原因，大多数内源性 DC 重编程研究报告了有效的 DC 抑制和一些 Treg 诱导，但缺乏临床成功，通常是由于缺乏 T 细胞持久性 15,19,20。这突出了从现有 DC 中识别潜在 tolDC 诱导剂的策略的必要性。

在这里，我们提出了一种针对分化 moDC 的 免疫 调节剂体外评估方法，其最终指标为自体 Treg 诱导。该协议旨在评估免疫调节剂对已经分化的人类 moDC 进行重编程以实现耐受性的有效性。此外，该协议验证了重编程的 tolDC 的功能，以针对从同一 PBMC 样品中分离的自体 T 细胞产生 Treg。这与在分化过程中诱导耐受性和/或用来自同种异体供体的 T 细胞攻击 tolDC 的其他方案形成鲜明对比²¹。在该协议中，我们使用常见的耐受剂 rapa 作为示例，但也证明了 rapa 处理的 moDC 产生 Tregs 的有效性有限。在我们的代表性结果中，我们还显示了其他常见免疫调节治疗的疗效，例如 IL-10、地塞米松和维生素 D3。我们设想该协议用于筛选针对已建立的 moDC 的潜在更有效的 tolDC 诱导剂²²。

Protocol

所有人外周血单核细胞 （PBMC） 样本均来自宾夕法尼亚大学人类免疫学核心，来自身份不明的供体，事先获得宾夕法尼亚大学机构审查委员会 （IRB） 的批准并征得患者同意。

可选：虽然在这种方法中，我们使用了从学术实验室获得的新鲜分离的 PBMC，但 PBMC 可以从全血或富含白细胞去除术的血液制品中分离出来。我们建议使用密度梯度离心法，因为这是一种成熟且可靠的方法，将在别处描述²³。

1. 单核细胞/T 细胞的分离和 moDC 分化

1. 从 PBMC 中分离单核细胞和 T 细胞 - 第 1 天
   1. 从健康供体获得 2 亿个人 PBMC。将细胞保存在 15 mL 试管中，并在冰上转移。
   2. 将 50 mL 分离缓冲液（在市售分离试剂盒中提供）分装在锥形管中。
      注：分离缓冲液也可以用含 2% 胎牛血清 （FBS） 和 1 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA） 的 DPBS 代替。
   3. 从冰中取出 PBMC 管，并加入分离缓冲液。以 300 x g 离心 5 分钟。
   4. 使用 10 mL 血清移液管吸出上清液。使用血清移液管将细胞沉淀重悬于 4 mL 推荐培养基中。
   5. 将悬浮液分成两个不同的 15 mL 试管，每管添加 2 mL（每管 5 × 10⁷ 个细胞/mL）。将一根管标记为“T”，将另一根标记为“单核细胞”。
   6. 检索 人单核细胞分离试剂盒 并按照制造商的方案从单核细胞标记的试管中分离单核细胞。
   7. 检索 人 T 细胞分离试剂盒 ，并按照制造商的第二管方案分离 T 细胞。
2. 用于 T 细胞分化和冷冻的单核细胞铺板 - 第 1 天
   1. 在 37 °C 下预热 50 mL moDC 培养基（表 1）至少 10 分钟。
   2. 将 15 mL 管中富含单核细胞的管子和步骤 1.1 中含有 T 细胞的 15 mL 管以 250 × g 离心 5 分钟。
   3. 吸出上清液。通过上下吹打，将单核细胞重悬于 1 mL moDC 培养基中，重悬于 T 细胞培养基中的 T 细胞（表 1）。确保颗粒正确分散。
   4. 使用自动细胞计数仪或手动血细胞计数器和台盼蓝染色对细胞进行计数。
      注：对于代表性数据，分离了 1000 万个 T 细胞和 300 万个单核细胞。
   5. 取含有单核细胞的试管，向悬浮液中加入 9 mL 温热的 moDC 培养基，最终体积为 10 mL。然后，加入 10 μg/mL GM-CSF 和 10 μg/mL IL-4 储备液各 100 μL，使培养基中 GM-CSF 和 IL-4 的最终浓度为 100 ng/mL。将悬浮液转移到培养皿中，并标记为“moDC”（第 1 天），并在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育。
   6. 取 T 细胞管，将 1 mL T 细胞冷冻培养基（表 1）与 1 mL T 细胞悬液混合。分成两个 2 mL 冻存管（1 mL/小瓶）;密封（终浓度为每瓶 500 万个细胞）。将冻存管放入冷冻室中，并在未使用的孔中放置平衡管。将腔室在 −80 °C 下储存过夜，然后将冻存管转移到冻存管中。
   7. 第 4 天，加入 5 mL 新鲜 moDC 培养基刷新培养基，并添加 100 μL GM-CSF 和 IL-4 储备液。差异化的 moDC 将在第 7 天准备就绪。

2. 添加免疫调节药物以产生耐受性 moDC

1. 设置 moDC 板。
   1. 第 7 天，从培养箱中取回分化的 moDC，并将 moDC 细胞悬液转移到 50 mL 试管中。
   2. 将悬浮液以 250 × g 离心 5 分钟。吸出上清液，并通过上下吹打将细胞沉淀重悬于 1 mL 温热的 moDC 培养基中。用血细胞计数器计数细胞，并在含有 100 ng/mL GM-CSF 和 IL-4 的温热 moDC 培养基中将细胞稀释至 3 ×^{10 5} 个细胞/mL 的浓度。
   3. 在平底 96 孔组织培养板中，将 3 × 10 个⁴ 个细胞/孔的 100 μL 加入到所需孔数中。
      注意：对于代表性结果，我们总共使用了 48 个孔（四个条件一式三份，为第 3 节和第 4 节中的四种不同分析准备），但这最多可以调整为 60 个孔。用 100 μL/孔 PBS 填充所有剩余的孔，以防止干燥，尤其是外孔。我们建议为每种分析方法准备不同的板。
   4. 向所需的孔中加入 1 μL/孔的免疫调节药物（这里为 10 ng/mL rapa）。将板在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育过夜。
      注意：如果在第 8 天包括免疫刺激，请为有和没有免疫刺激的免疫调节药物准备孔。使用免疫刺激来成熟 moDC 是可选的。
2. 解冻 T 细胞。
   1. 第 8 天，从低温槽中取出两个冷冻管，并在 37 °C 的热珠浴或水浴中解冻冷冻管，直到内容物开始熔化（<3 分钟）。
   2. 当内容物开始熔化时，将样品瓶转移到细胞培养罩中，将 1 mL 温热的 T 细胞培养基移入样品瓶中以快速解冻。将样品瓶中的所有内容物转移到 50 mL 试管中。用 1 mL T 细胞培养基冲洗冻存管，以确保所有细胞都转移到试管中。
   3. 用流式染色液（表 1）将悬浮液加满至 15 mL。以 200 × g 离心 10 分钟并吸出上清液。然后，将沉淀重悬于 5 mL 流式染色溶液中并再次离心。
   4. 吸出上清液，并将细胞重悬于 1 mL 温热的 T 细胞培养基中。使用血细胞计数器计数细胞。
      注：现阶段的存活率应为 >70%;如果残留大量死细胞，则转移到新试管中，加入 10 mL 细胞染色溶液，以 200 × g 离心 5 分钟，重悬于 1 mL T 细胞培养基中，然后重新计数。
   5. 加入 9 mL 温热的 T 细胞培养基，使最终体积为 10 mL。将悬浮液转移到培养皿中。将其标记为“解冻的 T 细胞”，并在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育过夜，让细胞休息。
3. 如果需要，清洗 moDC 板并添加免疫刺激剂。
   1. 在第 8 天，将 moDC 板（从第 7 天开始）以 300 × g 离心 5 分钟。
   2. 吸出上清液，用温热的 HBSS 洗涤，重复离心，再次吸出，并将细胞重悬于含有 GM-CSF 和 IL-4（100 μL/孔）的温热 moDC 培养基中。
      注意：小心不要打扰细胞。吸液过程中倾斜板。孔中可保留约 10 μL。
   3. 如果使用免疫刺激，则向所需孔中加入 1 μL/孔的 100x 原液 LPS（或其他免疫刺激剂）。将板在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育过夜。

3. moDC 的流分析（验证 + 容差）

1. 用于验证 moDC 的流分析
   1. 第 8 天，为 验证组合准备抗体混合物，靶向以下标志物：HLA-DR、CD14、树突状细胞特异性 C 型凝集素 （DC-SIGN）、CD1c 和 CD40，如 表 2 所述。用流染剂溶液稀释所有抗体。
      注：该面板专为 7 通道红/蓝激光流式细胞仪而设计。
   2. 从培养箱中取出 moDC 板。将板以 300 × g 离心 5 分钟。去除上清液。 可选：根据制造商的说明，使用市售试剂盒保留上清液，用于细胞因子 IL-10 和 TNFα 的 ELISA 分析。
   3. 添加 200 μL/孔的流式染色溶液。将板以 300 × g 离心 5 分钟。
   4. 吸出上清液，加入 50 μL/孔的 Fc 受体结合抑制剂抗体，以 1：200 稀释于流式染色溶液中，以阻断非特异性结合。在室温 （RT） 下孵育 30 分钟。
   5. 加入 50 μL/孔的制备好的 Validation Panel 抗体混合物。
   6. 通过将 50 μL 补偿珠与 50 μL 每种稀释抗体混合，在板或 1.5 mL 试管中制备补偿对照。将板在 4 °C 下孵育 1 小时。
      注：此处使用补偿珠而不是细胞进行补偿，因为 moDC 上的标记物表达可能较低。
   7. 以 300 × g 离心 5 分钟，去除上清液，然后重悬于 200 μL 流式染色溶液中进行洗涤。执行两次洗涤。
   8. 最后一次洗涤后，再次离心并将细胞重悬于 110 μL/孔的流式染色液中。样品现在可用于流式细胞术分析。
2. 耐受性 moDC 的流量分析（公差面板）
   1. 与第 8 天的步骤 3.1 类似，为 耐受性面板准备抗体混合物，靶向以下标志物：CD86、PD-L1、DC-SIGN、CD1c、BTLA 和 CD40（表 2）。
   2. 重复步骤 3.1.2-3.1.8，用 Tolerance Panel 混合物替换抗体混合物。

4. T 细胞的流式分析

1. 将 T 细胞与处理的致耐受性 moDC 结合。
   1. 第 9 天，从培养箱中取出解冻的 T 细胞培养皿，并将所有 T 细胞转移到 50 mL 试管中。用流式染色液加满。
   2. 可选：如果进行 T 细胞增殖分析，请将 T 细胞分成两管。
      1. 使用第一根试管，以 250 × g 离心 5 分钟，然后去除上清液。根据制造商的说明用细胞增殖染料对该管进行染色。
         注：我们使用了 Fixable Viability Dye eFluor 670，它需要 30 分钟的孵育步骤，然后是两个洗涤步骤。我们建议使用 50 mL 锥形管来防止细胞丢失，并在染色后使用含 10% HIFBS 的 HBSS 进行洗涤。
      2. 使用含有未染色 T 细胞的第二支试管进行 Treg 分析。同样，以 250 × g 离心 5 分钟，去除上清液，重悬于温热的细胞培养基中，并在染色过程中保存在培养箱中。如果不需要 T 细胞增殖，则离心所有 T 细胞并用温热的 T 细胞培养基替换它们。
   3. 对细胞进行计数并获得至少 400 万个（仅用于 Treg 分析）或 800 万个（用于 Treg 和 T 增殖分析）。
   4. 从培养箱中取出带有剩余孔的 moDC 板，以 300 × g 离心 5 分钟，并加入上清液。以 1.6 × 10⁵ 个细胞/孔的密度添加 200 μL/孔 T 细胞。添加未染色的 T 细胞用于 Treg 分析板，添加染色的 T 细胞用于 T 细胞增殖板。
      注意：这将保持 T 细胞与 moDC 的比率为 5：1，因为最初的 3 ×10⁴ moDC 通常会略微膨胀。
   5. 向除阴性对照孔外的所有组添加 25 μL/mL 抗 CD3/CD28 抗体混合物以刺激 T 细胞。将板在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 72 小时，直至第 12 天。
      注：确保使用染色的 T 细胞进行增殖分析，使用未染色的 T 细胞进行 Treg 分析。
2. Treg 流分析
   1. 表面标记物染色
      1. 第 12 天，为 Treg 检测组合准备抗体混合物（表 2）。
      2. 将所有细胞悬液从 96 孔培养板转移到含有流式染色液的 V 形底板中。保留上清液用于细胞因子分析。
      3. 通过离心洗涤细胞 2 次（200 × g 5 分钟，然后加入 200 μL Flow 染色溶液）。留出一些单元格用于补偿控制。将一个留作 FOXP3 染色和未染色的对照。
         注：我们建议在步骤 4.2.1.3 的最终离心之前梳理 10 μL 所有样品，以获得必要的补偿对照。这提供了细胞上每个标记物的所有表面水平表达的代表性样品。
      4. 第二次洗涤后，在室温下以 200 x g 离心 5 分钟并吸出，然后加入 50 μL/孔 Fc 受体结合抑制剂抗体（在流式染色溶液中以 1：200 稀释）。在室温下孵育 10 分钟。
      5. 加入 50 μL/孔制备好的 Treg Panel 抗体混合物。
      6. 对于补偿对照，将 50 μL 未染色的补偿池与 50 μL 每种单一染色抗体混合。
      7. 将板和补偿对照在 4 °C 下孵育 1 小时。用 Flow Stain 溶液洗涤板一次，并以 300 × g 离心 5 分钟。
      8. 使用用 HBSS （1：1,000） 稀释的 Live/Dead 近红外染料以 200 μL/孔进行染色。在 4 °C 孵育 30 分钟。
      9. 用 300 × g 的流式染色液（200 μL/孔）洗涤板一次，持续 5 分钟。
   2. 根据制造商的说明用 FoxP3 染色，这需要过夜孵育。下面介绍了 FoxP3 染色方案的简要概述。
      1. 根据制造商的说明准备 FoxP3 固定/透化工作溶液 。将 1 份 FoxP3 固定/透化浓缩液与 3 份 FoxP3 固定/透化稀释剂混合。每个样品准备 200 μL 的工作溶液。
      2. 将所有样品在 200 μL/孔的工作固定/透化溶液中孵育。在 4 °C 下放置 1 小时。
      3. 制备 1x 透化缓冲液：将 1 份 10x 透化缓冲液（从商业试剂盒中获得）与 9 份蒸馏水混合。
      4. 用 1x 透化缓冲液（200 μL/孔）以 300 × g 洗涤板 2 次，持续 5 分钟。
      5. 用 FoxP3 抗体（PE-Cy5.5，在 1x 透化缓冲液中以 1：300 稀释）染色：加入 100 μL/孔稀释的 FoxP3 抗体，并在 4 °C 下孵育过夜。
      6. 用 1x 透化缓冲液（200 μL/孔）以 300 × g 洗涤板 2 次，持续 5 分钟。
      7. 将细胞重悬于 110 μL/孔的流式染色溶液中。
      8. 进行流式细胞术分析。
3. T 细胞增殖分析
   1. 为 T 增殖检测组合 准备抗体混合物（表 2）。
   2. 将所有细胞悬液从 96 孔培养板转移到含有流式染色液的 V 形底板中。保留上清液用于细胞因子分析。
   3. 通过离心洗涤细胞 2 次（200 × g 5 分钟，然后加入 200 μL Flow 染色溶液）。留出一些单元格用于补偿控制。将一个留作 FOXP3 染色和未染色的对照。
      注：我们建议在步骤 4.3.3 的最终离心之前梳理 10 μL 所有样品，以获得必要的补偿对照。这提供了细胞上每个标记物的所有表面水平表达的代表性样品。
   4. 第二次洗涤后，离心（室温下 200 × g，5 分钟）并吸出，然后加入 50 μL/孔 Fc 受体结合抑制剂抗体（在流式染色溶液中以 1：200 稀释）。在室温下孵育 10 分钟。
   5. 加入 50 μL/孔制备好的 T 增殖检测组合 抗体混合物。
   6. 对于补偿对照，将 50 μL 未染色的补偿池与 50 μL 每种单一染色抗体混合。
   7. 将板和补偿对照在 4 °C 下孵育 1 小时。用 Flow Stain 溶液洗涤板一次，并以 300 × g 离心 5 分钟。
   8. 使用用 HBSS （1：1,000） 稀释的 Live/Dead 近红外染料以 200 μL/孔进行染色。在 4 °C 孵育 30 分钟。
   9. 用 300 × g 的流式染色液（200 μL/孔）洗涤板一次，持续 5 分钟。
   10. 进行流式细胞术分析。

Results

我们已经描述了一种人 PBMC 的方案，使用市售磁性分离试剂盒分离 CD3 ⁺ T 细胞和 CD14 ⁺ 单核细胞，使用 GM-CSF 和 IL-4 将单核细胞分化为 CD14 ^- 、HLA-DR ⁺、CD141 ⁺、CD1c ⁺ moDC，处理它们 24 小时，并与抗 CD3/CD28 刺激的自体 T 细胞共培养 72 小时。实验原理图如图 1 所示。

单核细胞/T 细胞的分离和 moDC 分化
对于我们的初步代表性结果，从宾夕法尼亚大学人类免疫学核心 （HIC） 的一位健康供体那里购买了 2 亿个 PBMC，并按照方案第 1 节和第 2 节所述进行处理。第 1 天抽血，并在 HIC 设施使用标准 Ficoll 分级分离进行分离。我们使用 1 亿个 PBMC 进行 T 细胞和单核细胞分离，每个细胞分别产生 1000 万个 T 细胞和 300 万个单核细...

Discussion

在这里，我们描述了一种可靠且通用的方法，用于评估免疫调节剂从 moDC 诱导 tolDC 的功能，并验证它们从体外自体 T 细胞产生 Tregs 的功能。该协议有几个关键步骤。首先，单核细胞是众所周知的敏感细胞，必须从新鲜的、而不是先前冷冻的 PBMC 中获得，以获得最佳结果。应尽快分离单核细胞并置于分化混合物中。通常，前 24 小时内单核细胞产量低或单核细胞死亡率高是由于冻融循环或 PBMC 和单核细胞分离之间的时间延长。其次，用于 moDC 和 T 细胞培养基分化的细胞因子必须来自高质量的来源。通常，moDC 的分化不良是由于细胞因子的质量差或浓度不正确。第三，我们建议在第 1 天和第 7 天之间冷冻 T 细胞，不要保存在培养物中，以保留其初始和未受刺激的表型。第四，如果可能有助于让处理的 moDC 静息长达 72 小时，以允许增加耐受性标志物，如 PD-L1 和 IL-10，如图 6 所示。最后，从我们的数据中可以看出，Treg 生成能力存在很大的患者差异，因此必须对每个患者样本运行每个...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1-10 &微;L 过滤移液器吸头	VWR	76322-158	一般细胞培养
1.5 mL 离心管	VWR	77508-358	一般细胞培养
10 mL 血清移液管	VWR	414004-267	一般细胞培养
100-1000 &l 过滤移液器吸头	VWR	76322-164	一般细胞培养
15 mL 锥管	VWR	77508-212	一般细胞培养
20-200 &L 过滤移液器吸头	VWR	76322-160	一般细胞培养
2-巯基乙醇	MP 生物医学	194834	T 细胞培养
50 mL 锥形管	VWR	21008-736	一般细胞培养
60 x 15 mm 培养皿，Nunclon Delta	Thermo Fischer	150326	一般细胞培养
96 孔锥形 （V） 底板，未经处理的表面	Thermo Fischer	277143	通用细胞培养
96 孔平底板	Thermo Fischer	161093	通用细胞培养
APC/Cyanine7 抗人 CD272 （BTLA） 抗体	Biolegend	344518	流式细胞术
Attune NxT（红/蓝激光，7 通道）	Thermo Fischer	A24863	流式细胞术
BSA	Thermo Fischer	15260-037	普通细胞培养
CD14 单克隆抗体 （61D3）、PE	Thermo Fischer	12-0149-42	流式细胞术
CD1c 单克隆抗体 （L161）、PE-Cyanine7	Thermo Fischer	25-0015-42	流式细胞术
CD209 （DC-SIGN） 单克隆抗体 （eB-h209）、PerCP-Cyanine5.5	Thermo Fischer	45-2099-42	流式细胞术
CD25 单克隆抗体 （CD25-4E3）、APC	ThermoFischer	17-0257-42	流式细胞术
CD274（PD-L1、B7-H1）单克隆抗体 （MIH1）、PE	Thermo Fischer	12-5983-42	流式细胞术
CD4 单克隆抗体 （RPA-T4）、Alexa Fluor 488	Thermo Fischer	53-0049-42	流式细胞术
CD40 单克隆抗体 （5C3）、APC	Thermo Fischer	17-0409-42	流式细胞术
CD40 单克隆抗体（5C3）、APC-eFluor 780	Thermo Fischer	47-0409-42	流式细胞术
CD69 单克隆抗体 （FN50）、PE	Thermo Fischer	MA1-10276	流式细胞术
CD86 单克隆抗体 （BU63）、FITC	Thermo Fischer	MHCD8601	流式细胞术
CD8a 单克隆抗体 （RPA-T8）、PE-Cyanine7	Thermo Fischer	25-0088-42	流式细胞术
锥底（V 孔）96 孔板	Thermo Fischer	2605	流式细胞术
低温样品瓶，2 mL	Thermo Fischer	430488	T 细胞培养
二甲基亚砜 （DMSO），测序级	Thermo Fischer	20688	一般细胞培养
DPBS	Thermo Fischer	14200166	一般细胞培养
EasySep 人单核细胞分离试剂盒	干细胞技术	19359	细胞分离
EasySep 人 T 细胞分离试剂盒	干细胞技术	17951	细胞分离
EasySep 磁体	干细胞技术	18000	细胞分离
EDTA	Thermo Fischer	AIM9260G	通用细胞培养
Falcon 圆底聚苯乙烯管，5 mL	干细胞技术	38025	细胞分离
Fc 受体结合抑制剂 多克隆抗体	Thermo Fischer	14-9161-73	流式细胞术
牛血清	Thermo Fischer	A5670701	一般细胞培养
可固定活力染料 eFluor 780	Thermo Fischer	65-0865-18	流式细胞术
Foxp3 / 转录因子染色缓冲液套装	Thermo Fischer	00-5523-00	流式细胞术
FOXP3 单克隆抗体 （PCH101），PE-氰 5.5	Thermo Fischer	35-4776-42	流式细胞术
HBSS	Thermo Fischer	14170-112	一般细胞培养
热灭活	Thermo Fischer	A5670801	一般细胞培养
HEPES （1 M）	Thermo Fischer	15630106	moDC 细胞培养
HLA-DR 单克隆抗体 （L243），Alexa Fluor 488	Thermo Fischer	A51009	流式细胞术
人 CD3/CD28/CD2 T 细胞激活剂	StemCell Technologies	10970	T 细胞培养
人 GM-CSF 重组蛋白	Thermo Fischer	300-03	moDC 细胞培养
人 IL-10 ELISA 试剂盒，高灵敏度	Thermo Fischer	BMS215-2HS	ELISA检测
人 IL-4，无动物成分重组蛋白	Thermo Fischer	AF-200-04	moDC 细胞培养
人 PBMC（新鲜分离）	UPenn HIC	N/A	细胞
人 TNF α ELISA 试剂盒	Thermo Fischer	BMS223-4	ELISA
光学显微镜 （DMi1）	Lucia	391240	一般细胞培养
脂多糖 （LPS）	Invivogen	tlrl-eblps	moDC 细胞培养
LIVE/DEAD 可固定近红外死细胞染色试剂盒	Thermo Fischer	L34975	流式细胞术
MEM 非必需氨基酸溶液 （100x）	Thermo Fischer	11140050	T 细胞培养
霉素-链霉素 （100x）	Thermo Fischer	15140122	通用细胞培养
移液器控制器	VWR	77575-370	一般细胞培养
帕霉素，98+%	Thermo Fischer	J62473。MF	moDC 细胞培养
RPMI 1640 与 Glutamax	Thermo Fischer	61870-036	通用细胞培养
分离缓冲液	Stem Cell Technologies	20144	细胞分离
T 细胞刺激混合物 （500x）	Thermo Fischer	00-4970-93	T 细胞培养
UltraComp eBead Plus 补偿珠	Thermo Fischer	01-3333-41	Flow细胞术
可变移液器套件	Fischer Scientific	05-403-152	一般细胞培养