En face 小鼠视网膜冷冻切片用于高维空间分子分析

摘要

视网膜在其层状结构中表现出复杂的空间组织。现代空间转录组学和测序技术需要厚度小于< 20 µm的组织切片，这限制了其在视网膜研究中的应用。本新鲜冷冻冷冻切片方法可在保持视网膜平面空间关系的同时，制备小鼠视网膜的薄层en face切片，从而实现跨层的全面分子图谱绘制。

摘要

视网膜复杂的层状结构为全面的空间分子图谱绘制带来了重大挑战。目前用于研究组织结构和分子相互作用的技术受限于各种技术瓶颈，这些限制会破坏空间关系或限制分子谱型分析。现有方法如切片、整体装片制备、化学或机械解离以及较厚的en face切片，要么破坏组织完整性，要么丢失关键的空间背景信息，而更多情况下则根本无法与高维度空间测序平台兼容。

本研究介绍了一种冷冻切片技术，可制备出薄（<20 µm 正面 在保持视网膜细胞分布空间关系的同时进行切片，该方法在生成适用于高通量分子分析平台切片的同时，维持了RNA完整性和组织结构。由于该技术采用新鲜冷冻组织切片，而空间转录组学平台制造商官方支持新鲜冷冻组织优于固定后组织，因此能够保持RNA的完整性。我们通过多种分子谱型分析方法验证了该方法，证明其可成功整合于手工RNAscope检测 原位 杂交（12个靶标）和Xenium空间测序（300个靶标）。该技术在不同样本中均能稳定保持组织结构完整性，同时维持适合此类高灵敏度分子应用的RNA质量。

这一方法学进展使得研究者能够深入探究视网膜细胞类型的分布、各层间分子梯度以及视网膜病理的空间特征。该技术具有良好的通用性，并可与现代空间生物学平台兼容，为全面解析视网膜复杂细胞结构的分子图谱奠定了基础。

引言

视网膜神经元已进化出促进信息处理的空间拓扑结构，在许多物种中形成了诸如中央凹、中央区和条状区等明显的特化区域^1,2,3。与光感受器分布的多样性已被充分研究相比，由视网膜神经节细胞（RGCs）构成的视网膜输出信号的空间特化仍不明确。对于大多数物种而言，RGCs的空间分布完全未知。即便是小鼠—— arguably 是视觉功能研究最深入的脊椎动物模型之一，也仅有不到三分之一的RGC亚型通过全层免疫组织化学等传统技术完成了定位 mapping²。这些技术之所以受限，是因为大多数RGC亚型缺乏特异性的遗传标记，需要借助单细胞RNA测序^5,6,7获取更高维度的分子信息，才能实现对RGC的准确分类⁴。

关于RGC分布的信息非常重要，因为小鼠中观察到的拓扑结构显示出RGC定位与视觉功能之间明确的生态学关联。最显著的例子是αON-S RGCs的空间组织，它们在颞侧视网膜中成簇分布。该区域接收捕食对象的图像⁸ 在捕食行为期间⁹同样广为人知的是，不同亚型的视网膜神经节细胞（RGC）对疾病的易感性存在差异¹⁰，且一些常见疾病（如青光眼）的进展具有空间特征^11,12因此，该领域面临的一个重要问题是：RGC亚型在视网膜上铺展时的空间分布模式是什么¹这一知识空白目前限制了人们对其他视觉引导行为及其相关疾病的理解。

本方法的重点是通过一种en face冰冻切片技术来弥补这些分子层面的知识空白，该技术在保持空间结构关系的同时，实现高分辨率的分子分析。以10X公司的Xenium为代表的现代空间测序平台在分子图谱分析方面代表了革命性进展，为组织结构和细胞间相互作用提供了前所未有的洞察。然而，这些平台以及诸如RNAscope等低重检测技术、Visium等空间条形码测序方法，均存在一个关键的技术限制：它们所需的组织切片厚度必须小于20 µm。这一要求对视网膜组织尤为具有挑战性，因为其厚度通常约为200 µm。

迄今为止，研究人员在将这些技术应用于视网膜组织时，主要依赖于横切面¹³。虽然横切面能够有效揭示核层和网状层内分子在垂直回路背景下的相互关系，但其在呈现视网膜细胞更广泛的空间分布方面不如全层铺片制备方法传统上所展现的效果⁸。近期对en face切片的尝试受到切片厚度限制，相关研究仅能获得50 µm的切片——对于现代高重分子分析平台而言过厚¹⁴。其他曾用于研究单个视网膜层的历史方法，如酶消化结合机械解离^15,16，或单独的机械解离^17,18,19,20，均无法与现代空间测序技术兼容。本文中，我们介绍一种专为薄而弯曲的视网膜组织设计的新型冷冻切片技术，可克服上述局限。简而言之，该方法包括取出眼球后段，在视网膜和巩膜上制作减张切口，将内层视网膜朝下贴附于盖玻片上展平组织，用OCT包埋组织，最后从外层至内层进行冷冻切片（图1）。该方法在保持空间关系的同时，生成的切片足够薄（<20 µm），适用于高维空间生物学工具，已通过手动RNAscope（12个靶标）和自动化Xenium平台（300个靶标）的成功应用得到验证，表明其适用于不同复杂程度的分子分析体系。

方案

所有实验均按照机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定并经其批准进行，同时遵循科罗拉多大学监督这些方法的相关机构指南。所有涉及动物使用和安乐死的步骤必须遵守当地法规和实验许可要求。所有小鼠均饲养在经认证的兽医设施中，接受标准护理，并可自由获取食物和水。这种en face冷冻切片技术基于为C57BL/6小鼠优化的标准视网膜解剖技术。为开发该技术，共使用了约150只不同性别的小鼠，年龄范围为6周至2岁。本文所描述的最终技术无论小鼠的人口学特征如何，成功率均约为95%。请注意，若某步骤未注明温度，则默认为室温，约20–25 °C。未标明温度的溶液在冷藏条件下亦可使用，因此溶液的工作温度范围为4–25 °C。

1. 解剖

1. 使用异氟烷麻醉小鼠，并通过脚趾夹捏法验证麻醉效果；或根据当地法规采用其他适宜的方法进行麻醉诱导与确认。
2. 通过颈椎脱位法处死小鼠：一手固定小鼠头部，另一手握住尾根部，向相反方向拉扯。随后通过断头法实施二次安乐死。
3. 在角膜上对眼球的颞极位置进行烙印，以保持方向性，并为后续解剖创造薄弱点（图2B 和 图3A）。
4. 将眼球浸入含有滤纸片（大小应大于眼球但小于培养皿）的培养皿中的Ames溶液中。
   注：使用非Ames溶液将导致视网膜退化（图4A）。
5. 使用锋利的#5镊子和虹膜剪，小心去除眼球表面的所有肌肉、筋膜、血管和神经（图2E、F 和 图3B），避免刺穿巩膜（图2D）。
   注：此步骤中若刺穿巩膜（图4B），将导致组织疝出（图4C）。
6. 将一把虹膜剪的一侧刀尖垂直于角膜上的烙印点放置，剪刀方向与视神经乳头平行，在该位置刺穿眼球（图3C、D）。
7. 从角膜经角膜缘切开，继续切入巩膜和视网膜，直至视神经乳头处，完成一次干净利落的直线切口（图3E）。
   注：切口不应穿过视神经乳头，否则巩膜与视网膜将发生分离。该切口的具体长度需根据眼球大小调整，而眼球大小在老年与年轻动物之间，以及某些Cre品系与野生型动物之间可能存在显著差异。建议切口最深端与视神经乳头之间保留约1 mm的组织。
8. 将剪刀刀片垂直于初始切口方向放置（图3F、G），位置大约位于角膜缘后方1 mm处（图2C），开始沿径向剪开巩膜和视网膜。
   1. 使用锐利镊子引导并旋转眼球，以保持切割线始终位于角膜缘后方且与其平行。虽然应尽量减少剪切次数，但优先确保径向切口的整齐。若视网膜与巩膜发生分离，应重新调整虹膜剪位置，将两者一同剪开。
      注：若剪入角膜缘区域，可能在摘除晶状体时导致视网膜与巩膜分离。允许进行小幅度剪切和旋转操作，但避免用力固定，以防引起视网膜疝出。
   2. 可借助虹膜剪刀片中部宽度估算1 mm的后置距离。当不确定时，宜偏向更靠后的位置，因为视网膜与角膜缘的连接向内弯曲。更靠后的切口有助于平坦地取出视网膜。
9. 完成与角膜缘平行的径向切口后，检查是否存在残留的视网膜连接，使用虹膜剪小心切断这些连接，直至眼球前段与后段完全分离。
10. 使用两对锋利的#5镊子，轻柔地分离眼球的前段与后段（图3H）。在老年小鼠中，晶状体与视网膜杯之间可能存在透明纤维连接，需用虹膜剪小心切断，同时尽量减少视网膜与巩膜的分离。
    注：晶状体应保持附着于角膜缘和角膜上。
11. 以滤纸作为支撑平台，使用虹膜剪将视网膜剪成三叶草形（又称铁十字形）切口模式（图3I-K）。
    注：若需利用此切片记录方向，则三叶草形切口应短于最初通过角膜缘所做的主定向切口。建议将这三个新的径向切口长度比主切口缩短约1–2 mm。若将使用其他特征（如视蛋白梯度）进行定向，则所有切口长度可一致，但始终需在切口最深点与视神经乳头之间保留约1 mm组织，以防止视网膜与巩膜分离。
12. 对另一只眼睛重复上述解剖操作。为尽量减少坏死，应在处死动物后10分钟内完成第二只眼的前房去除。

2. 冷冻保存

1. 通过剪切一次性塑料移液管的尖端，制备一个开口大于已分离的视网膜和巩膜（以下统称为视网膜）的移液管。
2. 轻柔地将视网膜吸入移液管，并将其转移至玻璃显微镜载玻片上。使用实验室擦拭纸小心去除视网膜周围的过量艾姆斯溶液，直至视网膜不再自由漂浮并可被展平。
3. 使用两把尖头#5镊子将视网膜展开，并使其内侧眼杯朝上平铺。根据组织大小，在每个三叶草形区域做0.5–2 mm的减张切口以进一步展平视网膜，并小心调整组织位置以防止折叠（图5A）。继续去除多余的艾姆斯溶液，仅保留少量液体紧邻视网膜周围。
4. 用盖玻片快速按压并转移视网膜及其周围的液体，使外侧巩膜朝上，内侧眼杯接触盖玻片，即视网膜神经节细胞朝上（图5B、图5C）。
5. 确认视网膜无折叠，必要时进行调整；如需更方便操作，可添加艾姆斯溶液。由于过量液体可能导致组织卷曲，应使用实验室擦拭纸彻底去除多余液体，并让视网膜在空气中干燥5–10秒。
   注意：若未进行短暂空气干燥，冷冻切片过程中可能出现组织与OCT包埋剂分离的现象；过度干燥则可能导致盐结晶引起的组织损伤。
6. 滴加OCT包埋剂覆盖视网膜，并用镊子将其均匀铺展于盖玻片表面，防止视网膜漂浮。静置30秒，使OCT包埋剂充分渗透视网膜。
7. 使用经液氮蒸气间接冷却的金属板或将样本直接接触干冰的方法，对OCT中的视网膜进行速冻（图5D）。
8. 若需立即使用，将视网膜保存在干冰上；若需长期保存，则将其置于含干燥剂的塑料袋或容器中，储存在-80 °C超低温冰箱中。

3. 冷冻切片

1. 将冷冻切片机腔室温度设为 -18 °C，载物台温度设为 -12 °C。将视网膜放入腔室中，使其达到平衡温度。
2. 在样品夹头上制备OCT包埋帽。若使用相同型号的冷冻切片机，请确保该包埋帽占据内侧2-3圈环形区域。待冻结后，修整OCT包埋帽，使其表面平整并与刀片平行，以保持组织层的平面性（图6A）。
3. 建立或标记夹头与冷冻切片机载物台之间的方向参照。
   注意：在我们推荐的型号冷冻切片机中，方向参照是一条蚀刻在夹头 holder 上方12点钟位置的中心线，而夹头本身在外圈环形区域有一个三角形切口。我们将这两个特征共同称为方向参照。如果您的冷冻切片机不具备此类结构，建议使用永久性记号笔自行标记。
4. 使用刀片准备视网膜转移：从侧面去除视网膜周围的多余OCT，然后小心地将视网膜从盖玻片上分离，使其可移动。
5. 将夹头从载物台上取下，并在已修整好的平整OCT表面滴加少量液态OCT。
6. 将视网膜直接放置于液态OCT上。使用预冷（-18 °C）的玻璃载片压住视网膜并保持10-30秒，直至其完全冻结固定。
7. 在视网膜及载物台表面再覆盖一层OCT，以确保完全粘附。将其置于冷冻切片机的快速冷冻区域进行速冻。随后将视网膜/OCT载物台置于冷冻切片机内孵育至少30分钟，以确保充分粘合。
8. 开始切片：
   1. 小心修去多余OCT，直至视网膜可见（图6B）。使用刀片去除组织块边缘的多余OCT。
      注意：每次手动径向修块后，在恢复切片前务必先将载物台回缩。对于表面切片（en face）的修块，建议采用与目标切片相同的厚度；但修块厚度也可根据用户偏好在10 µm至100 µm之间调整。
   2. 持续修块并观察切片中巩膜的存在情况。当巩膜可见时，根据需要调整载物台角度。继续修块，直至切片中巩膜分布均匀，以确保最佳平面性和每张切片中最大的三叶草区域面积。
   3. 收集组织切片（图6C）。
      注意：最佳切片厚度取决于后续检测方法，必须符合下游实验方案要求。例如，若使用10X Xenium技术，建议切片厚度为20 µm；而对于10X Visium，则15 µm厚的切片更为合适。
   4. 使用预冷的载玻片，并用两把画笔将切片调整至合适位置。
   5. 用手指托住切片下方，直至OCT融化且组织牢固粘附（约5秒）。
   6. 将载玻片放回低温表面，使组织重新冻结。
      注意：当在小区域收集切片时（如用于Xenium），可能需要多次冻融循环。虽然这对基于探针的技术无显著影响，但可能会影响无偏倚测序方法中的RNA质量。
9. 切片完成后，立即将载玻片置于干冰上用于即时使用；如需次日进行RNAscope检测，则储存于-20 °C；如需长期保存，则储存于-80 °C。

4. 靶标检测与显微镜观察

注意：尽管该技术可与其他分子分析方法兼容，但我们以RNAscope作为已验证的一个示例进行详细说明。

1. 样品制备：
   1. 从 -80 °C 取出载玻片，在 -20 °C 下解冻 1 小时。
      注意：载玻片可在开始后续操作前于 -20 °C 保存最多 12 小时，但不宜在 -20 °C 放置过久，以尽量减少 RNA 降解。
2. 将载玻片在 37 °C 快速加热 10 秒。
3. 将载玻片浸入新鲜的 4% 多聚甲醛（PFA）中，在室温下固定组织 30 分钟。
4. 用 1x PBS 充分洗涤载玻片。
5. 通过乙醇系列进行组织脱水：50% 乙醇 5 分钟，70% 乙醇 5 分钟，100% 乙醇 5 分钟，新鲜 100% 乙醇再 5 分钟。
   注意：这是组织贴附过程中的关键质量控制步骤。若在脱水过程中发生组织脱落，表明贴片时相邻切片之间存在 OCT 包埋剂重叠。在切片和贴片过程中仔细修除多余的 OCT 可避免此问题。
6. 疏水屏障制备：
   1. 将载玻片在室温下于实验台面上空气干燥 5 分钟。
   2. 使用疏水性屏障笔在每份组织切片周围画出屏障，室温下静置使其完全干燥 5 分钟。
7. 分子检测：
   1. 应用 Protease IV 处理以实现组织通透化。
   2. 按照制造商提供的方案进行靶标探针杂交（40 °C 下 2 小时）、信号扩增步骤（三个连续扩增剂）和荧光染料检测（三重染色需进行四轮连续检测）。
8. 成像：
   1. 每次加盖玻片前进行 DAPI 核复染。
   2. 使用抗荧光淬灭封片剂封片。
   3. 使用配备适当滤光片组的荧光显微镜进行成像。
   4. 对于多重检测，需在所有四轮检测中采集同一视野图像，以便进行计算配准。
   5. 各轮检测之间保持一致的曝光设置，以实现准确的信号比较。
      注意：有关 RNAscope 实施的完整细节，请参阅制造商提供的方案（见 材料表）。对于 Xenium 等全自动平台，应严格遵循制造商提供的全部操作步骤。在所有实验方案中，应预见到因 OCT 重叠导致组织脱落而引起的失败最可能发生在早期脱水或洗涤步骤，如本示例方案所述。

结果

成功实施本方案可获得完整的en face视网膜切片，适用于多种分子谱型分析方法，同时保持视网膜表面的空间关系。我们通过系统的验证方法展示了该方案的实用性，从传统的免疫组织化学检测，到人工多重RNA检测，再到自动化高通量分子谱型分析，逐步推进。

本方案的初步验证采用两种特征明确的标志物，以评估所有视网膜层的组织完整性和结构保存情况（图7）。视网膜神经节细胞通过抗RBPMS免疫染色进行标记，而血管网络则使用番茄凝集素（Tomato Lectin）进行可视化。由于这两种标志物在健康视网膜中具有明确且文献记载清晰的分布模式，因此该组合可为方案的成功实施提供即时反馈。

在制备良好的组织中，RBPMS 免疫反应性表现为神经节细胞层中清晰的细胞标记，信号分布于整个视网膜表面。当在不同深度进行切片时，番茄凝集素（Tomato Lectin）标记的三层血管丛应可明确区分：浅层血管丛位于神经纤维层，中间层血管丛位于内丛状层，深层血管丛位于外丛状层。重要的是，这些 dis...

讨论

本文所述方法通过制备适用于现代分子分析技术的薄层en face切片，解决了视网膜空间生物学领域的一项关键技术障碍。该实验方案中最关键的步骤集中在初始解剖过程中的组织处理，以及冷冻保存和切片过程中对温度与湿度的精确控制。成功实施该方法尤其依赖于在OCT包埋前实现适当的组织展平，并在整个切片过程中保持稳定的温度控制。

常见技术假象及故障排除：
在方案实施过程中可能出现多种技术挑战，每种问题均有其特定的原因和解决方案：

组织脱落：最常见的技术失误发生在脱水步骤期间，即组织从载玻片上脱落。这通常是由于在贴片过程中相邻切片之间的OCT包埋剂重叠所致。在贴片步骤中，必须仔细注意在放置后续切片前将每一片切片上多余的OCT彻底修除。当出现此类人为假象时，通常会在乙醇脱水过程中显现，从而可作为贴片质量的早期指标。

组织开裂与退化：另一种常见的假象表现为切片过程中出现组织碎片化。这通常是由于不同冷冻切片机之间的温度不匹配所致。尽...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ames′ 培养基	Sigma-Aldrich	A1420-10X1L	品牌无特殊要求
Beadsmith Thread Zap 线材燃烧器	The Beadsmith Store	7.90524E+11	可使用其他替代灼烧工具
冷冻切片机	Leica	cm1950	重要考虑因素是腔体温度与载物台温度可独立控制
干冰	NA	NA	NA
Fine Science Tools Dumont #5 镊子	Fine Science Tools 1129500	NC9889584	品牌无特殊要求
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. 包埋剂	Fisher Scientific	23-730-571	品牌无特殊要求
Fisherbrand 高精度直头细尖镊子/镊钳	Fisher Scientific	12-000-127	品牌无特殊要求
Fisherbrand 标准解剖剪刀	Fisher Scientific	08-951-20	品牌无特殊要求
Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisher Scientific	22-037-246	品牌无特殊要求
Integra Miltex Noyes 虹膜剪刀	Integra Miltex 181510	12-460-278	品牌无特殊要求
Olympus IX81 转盘共聚焦落射荧光显微镜			用于图7
RNAscope HiPlex	ACDBio
矩形盖玻片	Fisher Scientific	12-541-033	品牌无特殊要求
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S6014-25G	品牌无特殊要求
Thermo Scientific Nunc 玻底培养皿	Fisher Scientific	12-567-400	品牌无特殊要求
World Precision Instrument Precision Stereo Zoom Trinocular Microscope (IV) 带臂支架体视显微镜	World Precision Instrument PZMTIVBS	50-253-8607	品牌无特殊要求
Zeiss Axio Imager.M2 落射荧光显微镜			具备光学切片功能（用于图8）