高分辨率秀丽隐杆线虫（C. elegans）在所有幼虫阶段的成像

摘要

本方案描述了基于微流控技术的秀丽隐杆线虫（C. elegans）在整个胚胎后发育过程中的延时成像。

摘要

Caenorhabditis elegans 已成为生物学中研究最广泛且最被深入理解的动物模型之一。C. elegans 作为模式生物的成功主要归功于三个关键特征：固定的细胞谱系、通体透明以及易于进行遗传操作。这些特性使其成为多种基于显微镜的活体研究的理想对象。秀丽隐杆线虫（C. elegans）的活体幼虫和成虫在图像采集过程中通常需要被固定。传统的固定方法会对线虫的发育产生不利影响，尤其是在延时成像应用中。本文介绍了一种新型微流控成像方法的详细装置搭建与操作流程，该方法克服了传统琼脂垫固定及其他微流控策略所存在的局限性。该技术能够同时对不同幼虫阶段的线虫进行活体成像，并在长时间内保持个体的方向性和身份识别。为实现这一目标，采用了一种几何结构经过精确设计的微流控捕获通道阵列，可在支持线虫生长和蜕皮的同时，维持其稳定的方向。固定过程通过一个主动液压阀实现，该阀仅在图像采集期间施加压力，将线虫压紧在盖玻片上。这种设计使得高分辨率成像成为可能，同时对线虫的存活率和发育时间影响极小。

引言

C. elegans 的成像可根据应用需求、通量和分辨率要求采用多种方式进行。当需要高分辨率时，标准方法是使用琼脂垫^1,2,3，其结构简单，由载玻片、琼脂糖和盖玻片组成。线虫在这些载玻片上通过盖玻片施加的压力被固定。为进一步提高固定效果，可添加麻醉剂，例如左旋咪唑或叠氮化钠^1,2，从而使琼脂垫上的线虫完全静止，适用于高分辨率成像，包括多种超分辨率成像方法²。然而，已知琼脂垫会影响线虫的发育进程，较高的压力结合麻醉剂可能导致发育延迟或完全发育停滞^4,5。

除了这些标准方法外，近年来还出现了一些微流控技术，每种方法都有其各自的优缺点或特定的应用场景^{6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19}。例如，Gritti 等人²⁰提出了一种将线虫限制在较大腔室内的方法。将胚胎置于这些腔室内后，可在显微镜的指定观察区域内自由发育和移动。尽管该方法总体上有效，但仅适用于明亮的荧光标记物。最近，Keil 等人²¹提出了该方法的改进版本，通过在芯片上集成液压阀，在图像采集期间固定动物，从而克服了原始方法的一些局限性。然而，由于这两种方法所使用的腔室均大于用于固定线虫的腔室，动物在整个实验过程中仍会持续移动和旋转。因此，追踪发育过程变得困难，需要进行大量图像后期处理以校正动物的运动。

为解决这些局限性，本研究采用了 Berger 等人¹⁸提出的方法（图1），该方法不将动物置于大型腔室中，而是将其饲养在一种专门设计的捕获通道内，适用于发育时间窗较短的动物（最多涵盖2.5个幼虫阶段）。与现有的微流控方法不同，该方法在整个实验过程中保持了动物的朝向和个体身份，并可在单个装置内同时对多个线虫在多个幼虫阶段进行高分辨率成像。

利用一种特殊的通道结构来固定动物，该通道的高度在实验开始时接近动物的厚度，从而防止其发生旋转。通道的宽度和长度经过选择，使动物能够在其中活动并随时间生长，便于蜕皮以及从一个幼虫阶段过渡到下一个阶段。通过将多个捕获通道并排排列，即可实现并行化操作，使得在单个视野（FOV）中可同时观察多个动物。 图1A'），单个设备单元最多可对41只动物进行成像（图1A芯片上的动物持续获得高浓度的细菌食物悬浮液 通过 一个低高度通道，同时有助于将动物限制在捕获通道阵列末端（高度台阶， 图1A，红色）。与 Keil 等人采用的方法类似。²¹，采用了一种大型液压片上阀门，可在图像采集期间充气，将动物压向盖玻片，从而增强动物的固定效果（图1B）。将液压阀的驱动限制在图像采集期间，可最大限度地减少对动物发育的不利影响，确保所有幼虫阶段的发育均可靠。与Gritti等人描述的方法不同²⁰ 和 Keil 等人²¹，无法在同一装置中对动物整个 post-embryonic 发育阶段进行成像。相反，本研究引入了五种不同的装置，分别称为 L1、L1-4、L2-A、L3-A 和 L4-A，它们分别覆盖 L1 全阶段及早期 L2 阶段、中期至晚期 L1 至中期 L4 阶段、中期至晚期 L2 至年轻成虫期、中期至晚期 L3 至年轻成虫期，以及晚期 L4 至年轻成虫期（图1C），从而实现对胚胎后发育大部分过程的连续成像。采用该方法的原因在于动物从L1期到成体的体型增长显著：若通道尺寸仅适合L1期动物，则对成体而言过小，会导致发育停滞；而若通道尺寸适合成体，则对L1期动物而言过大，将导致过度移动、旋转以及动物逃逸出捕获通道。

采用这种方法，可实现多种组织可靠的发育进程记录¹⁸，例如表皮的胚后发育（L1至L4阶段）、外阴细胞命运的诱导（L2和L3阶段）、外阴形态发生（L3至成虫期¹⁹）以及锚定细胞的侵袭过程。自问世以来，这些长期成像装置已被用于研究多种生物学过程^22,23，该平台甚至已与AiryScan超分辨率显微技术相结合²⁴，实现了此前无法完成的多项重要发现。

下文将逐步介绍这些长期成像设备的操作步骤，重点说明系统搭建过程中的预期结果以及可能遇到的一些挑战。

方案

本研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。

1. 器件制备

注意：所有器件均采用以下方案制备，但也可直接向作者获取。每种器件类型均在独立的晶圆上制备，每个器件晶圆由两层不同高度的 SU8 材料构成（即食物层和捕获层）。阀门晶圆在另一独立晶圆上制备，仅使用单一高度的 SU-8 材料，并省略步骤 1.3–1.6。硅烷具有毒性并会释放腐蚀性蒸气，因此该步骤必须在通风橱中进行。有关制备工艺的详细信息，请参见 Berger 等人¹⁸。

1. 使用空气等离子体清洁晶圆。
2. 旋涂第一层 SU8，然后在 95 °C 下进行预烘。
3. 曝光第一层，随后在 95 °C 下进行后烘并显影。
4. 晶圆显影并干燥后，再次进行等离子体清洁。
5. 旋涂第二层 SU8，然后在 95 °C 下进行预烘（如有必要，可先在 65 °C 下进行初始烘烤）。
6. 利用晶圆两侧的对准标记，将第二层掩模与已有结构精确对准，然后曝光第二层。
7. 进行后烘并显影晶圆，随后在 200 °C 下进行硬烘。
8. 用三甲基氯硅烷处理晶圆至少 2 小时。
9. 准备 20 g PDMS 预聚物（A 组分），并彻底混合 1 g 交联剂（比例 20:1，B 组分）（参见 材料表）。
10. 脱气 10 分钟，或直至所有气泡消失。
11. 取出 2 mL PDMS 混合物，留作步骤 1.13 使用。
12. 向剩余的 PDMS 混合物中再加入 3 g 交联剂，并充分混合（最终比例约为 5:1）。
13. 使用 20:1 的 PDMS 混合物，在器件晶圆上以 750 rpm 旋涂 30 秒。
14. 将阀晶圆放入铝制培养皿中，并浇注 5:1 的 PDMS。对器件晶圆脱气约 10 分钟。脱气后，用移液器去除残留气泡。
15. 将阀层和器件层分别在 70 °C 下烘烤约 15/20 分钟。
16. 用移液器尖端或镊子轻轻探触，评估器件层和阀层的固化程度。阀层应已固化，而器件层应仍略有黏性。
17. 将阀层剥离，并使用手术刀或剃刀片修剪至所需尺寸。
18. 在阀通道上打一个接入孔（20 号针头）。
19. 将器件晶圆置于配备顶部照明的体视显微镜下。
20. 小心地将含有阀层的 PDMS 片段放置在器件晶圆上。
21. 精确对准阀层与器件层的结构，确保完全排除层间夹带的空气。
22. 将组装好的器件转移至烘箱，并在 70 °C 下烘烤过夜。
23. 将器件从晶圆上剥离。
24. 打穿所有剩余的接入孔（20 号针头）。
25. 使用空气等离子体将 PDMS 键合到盖玻片上，然后将键合后的器件置于 70 °C 烘箱中数小时。

2. 线虫制备

注意：本节描述通过漂白法进行线虫制备，该方法可获得大量（数百条）同步化线虫。其他同步化方法（如手动挑取）也可行，但通常更耗时且劳动强度较大。本实验方案中所用线虫均按照标准操作程序在20 °C条件下培养，置于接种有大肠杆菌OP50的NGM平板上维持培养。 E. coli OP50

1. 从含有大量怀卵动物的平板开始。
2. 使用 M9 缓冲液将动物从平板上冲洗下来。
3. 向线虫悬浮液中加入 5% 次氯酸钠（NaClO）和 5 M 氢氧化钠（NaOH）（每 1 mL 线虫悬浮液加入 200 µL 次氯酸钠和 100 µL 氢氧化钠）。
4. 轻轻振荡漂白混合液，直至动物开始解体（约 10 分钟）。
5. 在室温下以 1300 × g 离心 1 分钟。
6. 用移液器移除上清液，并加入等体积的新鲜 M9 缓冲液。
7. 再次在室温下以 1300 × g 离心 1 分钟。
8. 移除上清液，将沉淀的线虫转移至含有 5 mL 新鲜 M9 缓冲液的 15 mL 离心管中。
9. 在 20 °C 下振荡过夜。
10. 将线虫悬浮液通过 10 µm 细胞筛过滤。
11. 在室温下以 1300 × g 离心 1 分钟。
12. 弃去上清液，用等体积的 M9 缓冲液重悬线虫。
13. 再次在室温下以 1300 × g 离心 1 分钟。
14. 移除上清液，将线虫转移至 NGM 平板。若需要 L1 幼虫，请立即使用。
15. 当线虫达到所需发育阶段后，使用经 0.2 µm 滤膜过滤的新鲜 S-Basal 缓冲液将其从平板上冲洗下来。
16. 让线虫通过重力沉降，或在室温下以 750 × g 离心 1 分钟形成沉淀。
17. 弃去上清液，加入等体积的新鲜 S-Basal 缓冲液。
18. 重复沉降或离心步骤（步骤 2.16 和 2.17）。
19. 移除上清液，加入等体积的新鲜 S-Basal 缓冲液。
20. 最后进行一次沉降或离心操作。
21. 移除大部分上清液。
22. 将线虫保留在离心管中，直至实验开始。

3. 细菌制备

注意：芯片上可使用不同的细菌菌株（例如 OP50、NA22、HT115 等）。根据细菌密度的差异，调整加入食物混合物中的密度梯度介质的比例。所有缓冲液均需通过 0.2 µm 滤膜过滤，以去除颗粒物。

1. 准备40 mL LB培养基，可分装为2 × 20 mL至离心管或无菌锥形瓶等容器中。
2. 从保存平板上挑取细菌接种至LB培养基中。
3. 在37 °C条件下振荡培养过夜（约16小时）（OD₆₀₀ = 1.9）。
4. 在3000 × g 条件下离心10分钟，收集细菌。
5. 弃去上清液，向每管中加入2 mL新鲜S-Basal缓冲液，合并所有管中的菌液。
6. 使用移液器通过机械方式重悬细菌。
7. 在3000 × g 条件下离心5分钟。
8. 弃去上清液，再次向每管中加入2 mL新鲜S-Basal缓冲液。
9. 使用移液器通过机械方式重悬细菌。
10. 在3000 × g 条件下离心5分钟。
11. 尽可能彻底去除上清液，加入1 mL新鲜S-Basal缓冲液，并通过机械方式重悬全部细菌。
12. 将0.60 mL密度梯度介质、0.38 mL含1%（质量分数）Pluronic F-127（一种非离子型三嵌段共聚物，本文简称为PF）的S-Basal缓冲液与1 mL OP50细菌悬液混合；或使用0.65 mL密度梯度介质、0.33 mL含1%（质量分数）PF的S-Basal缓冲液与1 mL NA22或HT114细菌悬液混合。
13. 使用涡旋振荡器充分混匀食物制备液。
14. 通过5 µm或10 µm细胞滤筛过滤食物。当使用较小装置（如L1装置）时，建议使用更小孔径的滤筛。
    注意：食物可在室温下保存最多2天。

4. 芯片制备

注意：设备、管路和连接的示意图参见图2。所有缓冲液均需通过0.2 µm滤膜过滤，以去除灰尘。后续步骤中提到的钢针是一种短的中空管，用于将较大外径的管路（1/16"）与在PDMS装置中加工出的小直径孔连接。这些钢针只需插入管路的内径中，然后推入PDMS材料内，即可有效实现两者的连接。

1. 首先用去离子水（DI 水）填充注射器。
2. 安装一个 23 G 针头和一段较长的 1/16" 管路，管路末端连接一根空心钢针（弯成 90° 角）。管路长度应足以从电磁阀延伸至显微镜载物台。
3. 用注射器将去离子水注入管路中，并通过将钢针插入打孔处，将管路连接至阀门入口（图 2A，J）。
4. 取下注射器和针头，然后将管路连接至芯片外的电磁阀（图 2A，J）。
5. 使用成像软件打开电磁阀，并对装置加压数分钟，以排出阀门中的所有空气。通过肉眼观察芯片上的气-水界面来确认是否完成：界面应呈暗色并消失于 PDMS 材料中（图 2B）。
6. 关闭电磁阀（图 2C）。
7. 用过滤后的细菌溶液填充一支 1 mL 注射器（约 0.5 mL 食物已足够）。
8. 在注射器上安装一个 30 G 针头，并连接一段较长的 1/32" 管路。
9. 推动推杆，使针头和连接的管路完全充满液体，确保注射器和管路中无残留空气。
10. 使用镊子将 1/32" 管路直接插入微流控装置的食物入口，以防止管路损坏（推荐使用 SMD 镊子）（图 2D，K）。
11. 将注射器安装到注射泵上（图 2D）。
12. 使用注射泵后部的螺钉推动注射器推杆，使液体充满装置。每个开放连接处应出现液滴（图 2D，箭头）。
13. 用密封钢针封闭线虫入口和出口（将一段短的 1/16" 管路连接至钢针，并通过灼烧密封）（图 2E，L）。
14. 使用螺钉施加额外压力，以去除装置中残留的空气（图 2E，箭头）。
15. 移除出口处的封闭钢针，并连接废液收集容器（由冻存管或微量离心管制成，盖子上插入两根钢针并用胶水固定）。使用一段短的 1/16" 管路连接废液容器，一端连接容器，另一端连接一根弯成 90° 的空心钢针（图 2F，G，M）。
16. 推动注射器，确保废液容器连接正确且系统中无堵塞。为此，通过系统推动少量液体（旋转注射泵上的螺钉），直至液体流经废液管路（图 2G，箭头）。
17. 移除第二个封闭的钢针。
18. 推动注射器，直到线虫入口处出现一小滴液体（图 2H，N）。
19. 使用 23 G 针头，将一段较长的 1/16" 管路（15–20 cm）连接至装有 S-Basal 缓冲液的 1 mL 注射器（图 2H，N）。
20. 在管路的另一端连接一根直的 23 G 钢针。
21. 用注射器中的缓冲液填充针头和管路，确保注射器和管路中无残留空气。
22. 将管路末端的钢针插入含有线虫的管中。
23. 推动少量液体通过管路，确保无空气残留。
24. 将线虫吸入管路中，但不要吸入注射器内。
25. 推动连接线虫的注射器，直到钢针末端出现一小滴液体（图 2H）。
26. 将钢针插入线虫入口（图 2I）。
    注意：装置准备可在最终线虫处理前完成，并将其留在显微镜上，直至线虫准备好。

5. 线虫加样与成像

1. 将装置置于显微镜低倍镜（5倍或10倍）下或体视显微镜上。
2. 确认当前正在使用的装置单元，并在明场照明下找到线虫入口。
3. 调整装置位置，使入口位于视野一侧，而捕获通道入口的后端位于视野另一侧。
4. 轻轻推动线虫注射器的活塞。液体将明显从入口经通道阵列流向出口。由于细菌的存在以及密度梯度介质的加入导致折射率差异，液体流动清晰可见。
5. 确保线虫从入口出现，并向通道阵列后端流动。
6. 轻柔地将线虫推向通道阵列。当线虫头部对准通道时，将其推入通道，并对其他线虫重复此操作。
   注意：为便于取食，线虫需保持头部朝向出口方向。可通过推动或回抽活塞以及利用线虫自身的游动来调整其方向。
7. 当足够数量的线虫被捕获后，将仍连接着线虫入口的注射器放置于显微镜载物台上，并在整个实验过程中保持该状态。为释放可能积聚的压力，可短暂将线虫导管从注射器上拆下，随后小心地重新连接至钝针头。
8. 若装载操作是在体视显微镜上完成的，则将装置转移至成像显微镜。导管可保持连接在芯片上，同时将注射器连接至泵。
9. 开启注射泵，以预设速率1 µL/h运行0.5 µL，随后将速率提高100 µL/h运行0.5 µL，再恢复至1 µL/h。该循环将在整个实验过程中自动重复。有关泵的编程操作，请参阅设备的用户手册。
10. 将装置放置于显微镜载物台上，并确保其被牢固固定（固定装置的建议可参见图3A）。
11. 若装载未在成像显微镜上进行，则需在低倍镜下识别目标装置单元。
12. 切换至所需的成像放大倍数。
    注意：该装置适用于所有类型的物镜。
13. 在捕获通道阵列中识别目标线虫及感兴趣区域，并设置所需的成像条件。
14. 在设定的成像条件下进行成像，成像前10秒通过电磁阀驱动芯片上的阀门，使线虫固定在原位。
    注意：驱动芯片上的阀门会使线虫被拉长并压平，可能需要调整成像的感兴趣区域（ROI）。

6. 实验准备

注意：本节涉及设备控制机制的初始准备工作，无需在每次实验前重复进行。请参考 图3B，C由于许多电磁阀需要较高的电压，因此电磁阀很可能不会直接连接到微控制器上 通过 继电器或MOSFET（参见 图 3C).

1. 确定一个加压空气源（例如，墙壁供气装置或气体钢瓶）。
2. 使用6 mm管路将压力源连接至合适的压力调节器（压力范围0-2 bar）（墙壁气源），或直接将合适的调节器连接至气体钢瓶。
3. 使用6 mm管路将压力调节器连接至电磁阀的输入端（参见图3B）。
4. 将电磁阀尽可能放置在靠近显微镜载物台的位置（建议距离载物台约0.5-1 m，但根据需要也可更远）。
5. 将电磁阀通过电子方式连接至选定的控制器。可选方案包括使用独立的微控制器板（例如Arduino）或现有的数据采集卡（DAQ）进行控制。

7. 清理与储存

1. 实验完成后，将装置从显微镜上取下。
2. 清除浸没液体。浸油可用有机溶剂（如丙酮、甲醇等）去除。
3. 将装置放置在平坦表面上，并断开所有管路，仅保留阀门管路。为安全断开每根管路，请在靠近管路的PDMS处向下按压，然后轻轻拉出。切勿抬起或弯曲装置，以免盖玻片破裂。
4. 用70%乙醇清洁PDMS表面。
5. 将装置在室温下保存，并保持阀门管路连接。
   注意：该装置可重复使用，直至所有单元均被使用，期间通常无需重新填充阀门管路。然而，阀门管路中的水会在长时间存放后蒸发，最终可能需要重新加水。

结果

装置设计与尺寸
设计了五种不同的装置，以适应全部四个幼虫阶段。这些装置分别命名为：L1，用于孵化后立即加载的L1幼虫，并成像至L2阶段；L1-L4，可容纳从中晚期L1阶段到早期至中期L4阶段的幼虫；L2-A，适用于从大约中期L2阶段到年轻成虫阶段的线虫；L3-A，用于从大约中期L3阶段到年轻成虫阶段的线虫；以及L4-A，可容纳从大约晚期L4阶段到年轻成虫阶段的线虫。

所有装置均遵循相同的基本布局，包括一个线虫入口、一个（或两个，用于培养基更换）细菌食物入口，以及一个共用的废液出口。在入口和出口部分之间，设有41条平行的捕获通道，入口侧与出口侧通过高度较低的食物供给通道有效分隔（图1A，A′）。通道尺寸的设计显著长于和宽于实验开始时加载的线虫，L1型装置的通道长/宽为400/15 µm，L1-L4型装置为575/22 µm，L2-A型装置为800/27 µm，L3-A型装置为900/30 µm，L4-A型装置为1000/65 µm（补充文件1、补充文件2、补充文件3、补充文件4和补充文件5）。

通道长度根据实验结束时动物达到的大小进行选择，而通道宽度则设定为使实验开始时的线虫占据通道宽度的约三分之二。该设计为线虫在蜕皮期间的生长和运动提供了充足空间，同时防止其发生转向或旋转。与宽度不同，通道高度设定为接近实验开始时线虫的厚度：早期L1幼虫为8 µm，中晚期L1幼虫为12 µm，中期L2幼虫为15 µm，中期L3幼虫为17.5 µm，晚期L4幼虫为22.5 µm，分别对应L1、L1-L4、L2-A、L3-A和L4-A装置。通过降低通道高度，并结合精心选择的宽度（保持高度与宽度比为0.5–0.6），可确保线虫保持固定的取向。值得注意的是，当通道高度足够小时，所有线虫均能稳定地保持在所需的侧向位置。

L1 的食物供给通道高度制作成 3 µm，其他所有装置则为 5 µm，以确保细菌能够轻易到达线虫，同时防止线虫从捕获通道中逃逸。所有装置均使用相同的食物供给层（补充文件 6）和相同的阀门层（补充文件 7）。需注意，阀门层是在单独的晶圆上以 20 µm 高度制作而成，并仅在 PDMS 装置制作过程中（步骤 1.21）才放置到装置层上。

这些特定发育阶段的几何限制对于防止线虫旋转或头尾倒转至关重要，因此需要使用三种不同类型的装置来适应所有幼虫阶段。如果将L1幼虫置于为年轻成虫设计的通道中，它们将无法保持稳定，并会迅速逃离捕获通道。

秀丽隐杆线虫 制备
除非另有说明，线虫均按照标准方案进行培养²⁵ 在接种了的NGM平板上 E. coli 在20 °C条件下使用OP50培养。蠕虫制备部分详细描述了用于成像实验的同步化蠕虫群体的制备过程。同步化操作依据标准方案，采用次氯酸钠漂白法进行。²⁶，通过增加一个过滤步骤，以去除经一夜饥饿后的碎片和未孵化的个体。目的是获得大量同步化的L1幼虫，随后将其接种到NGM平板上或直接加载至成像设备中。其他同步化方法，如人工挑选或控制产卵，同样适用，但在获取足够数量的个体（建议每组200只）时更为耗时费力。

当线虫发育至所需阶段后，可使用洁净的S-Basal缓冲液（最好经0.2 µm滤膜过滤）轻轻将虫体从NGM平板上冲洗下来。目的是尽可能收集虫体，同时避免收集到平板上的细菌或碎片。将虫体收集至小型离心管中，用新鲜S-Basal缓冲液洗涤2–3次，最后尽可能去除上清液。随后直接从浓缩的虫液中取用虫体。若虫体浓度过低，则上样速度会较慢，需要更多的液体流经装置，从而增加碎片堵塞捕获通道的风险。

细菌食物制备
细菌培养按照标准操作流程进行，将初始细菌浓度（OD₆₀₀ = 1.9）在S-Basal缓冲液（经0.2 µm滤膜过滤）中约扩增40倍，随后与密度梯度介质及含有PF的S-Basal缓冲液（经0.2 µm滤膜过滤）混合。该步骤的预期结果是制备出高浓度的细菌悬液，并在成像实验过程中防止细菌沉降。高浓度细菌悬液对于在低流速（1 µL/h）培养基输送条件下芯片内喂养线虫至关重要。密度梯度介质的作用是防止实验过程中细菌沉淀，而PF的作用是防止细菌黏附于微通道壁。密度梯度介质和PF均无毒性，不会影响线虫的存活能力。

如果实验中使用了不同类型的细菌，则需要确定密度梯度介质的合适浓度。可通过将细菌悬液与不同量的介质混合后进行离心来实现。若密度梯度浓度过低，细菌会沉降；若浓度过高，细菌则会上浮。一旦找到合适的浓度，建议将细菌混合物在室温下静置约48小时，以验证结果，从而指示食物在整个实验过程中可能的表现。实验结束后，同样建议检查用于供给细菌的注射器，确保细菌既未沉降也未上浮。由于加入不同量的Optiprep导致的体积差异，可通过增加或减少S-Basal + 1%（质量分数）PF的量来补偿。类似地，可在悬液中添加其他培养基或化合物（例如生长素），其额外体积应从S-Basal + 1%（质量分数）PF的体积中扣除。

实验准备设置
将压力供应系统尽可能靠近显微镜设置，以便于方便操作。所有管路，尤其是连接到芯片的1/16英寸外径管路，应保持较短（1/16英寸外径管路长度小于0.5米）图2 和 图3B）。如上一节所述，芯片阀门的计算机控制可通过多种方式实现。可在任何显微镜软件中（已在Micro-Manager、Metamorph、NIS和ZenBlue中测试）实现控制，方法是连接专用的微控制器板（例如Arduino），或通过数字输出将系统连接至现有的数据采集（DAq）卡。所选板卡的输出应配置为快门，使其在图像采集前10秒开启，或在设备设置期间手动触发。如前所述，不建议将电磁阀直接连接至微控制器；而应通过连接 通过 MOSFET 或继电器开关，以确保电磁阀与微控制器在电气上保持隔离（图3C).

与压力供给管类似，应尽量缩短所有连接到芯片的其他管路（外径1/16英寸和外径1/32英寸）。蠕动管和废液管（外径1/16英寸）长度应分别控制在2.5 cm和20 cm以内。细菌供给管（外径1/32英寸）必须足够长，以便在装置放置于显微镜载物台后仍能从注射泵连接至装置。尽管如此，仍强烈建议尽可能缩短该管路，并将注射泵放置在靠近显微镜载物台的位置，例如载物台旁的支架上或培养箱顶部。系统中增加的任何长度管路都会在将生物样本加载至装置时增加所感受到的反向压力，并提高对被捕获生物样本施加的总压力。

设备操作
在此阶段（方案步骤4的开始），可将所有管路预先准备好，并连接至相应的钝头针、钢针和注射器。如上所述，应尽量保持管路长度最短（图2J-N）。重要的是，必须确保注射器和管路中无残留气泡，因为气泡会干扰动物的装载，并可能导致实验过程中动物从捕获通道中逃逸。可通过多种方式去除注射器中的气泡，例如，先将注射器充满液体，然后将其倒置并轻轻摇晃，使气泡上升至注射器顶部（不建议弹击注射器，因为这可能导致更多气泡滞留）。或者，也可将注射器插入缓冲液中，快速上下移动活塞，以迅速排除大部分气泡。

当注射器充满液体且无气泡后，将钝头针和管路连接并用缓冲液充满。填充注射器时需格外小心，因为空气容易滞留在钝头针的塑料部分。如果已有空气滞留，应更换针头。或者，可通过预先用液体填充针头（例如使用移液器）来避免此问题。

当所有组件安装到位后，即可将管路连接到装置上，首先连接电磁阀与芯片阀门之间的管路（图 2A-C,J）。该管路最初需充满去离子水，并对系统加压，以去除死端阀门通道中的所有空气。聚二甲基硅氧烷（PDMS）具有透气性，因此在加压条件下，通道内的空气会透过PDMS材料排出，从而使阀门通道完全充满水。此过程可在显微镜下观察，确保整个阀门通道被水完全填充。完成阀门通道填充后，可连接细菌供给源，并通过封闭所有开放的进出口对装置进行填充和加压（图 2D,E,K,L）。在此过程中，空气被液体置换，可通过显微镜监测该过程。当所有空气被完全排出后，细菌应均匀地充满整个装置。随后移除封闭针，连接废液收集管（图 2F,G,M）。此时应有少量液体流经装置进入废液收集管，以确保所有与管路的连接均通畅。在将管路连接至收集管之前，可通过肉眼确认液体流动情况。若无液体流入废液收集管，则可能管路存在堵塞。这将导致实验过程中压力积聚，对被捕获的生物样本产生不利影响。若发现管路或其连接处堵塞，应将其拆下，并使用细针清理所有连接部位，或用装有水的注射器冲洗清洁。

最后，可以连接蠕虫导管（图2H，N）。将蠕虫从离心管中拾取时，只需用连接在装有S-Basal的注射器上的导管将其吸入即可。应仅将动物吸入导管中，而非注射器内。随后可将导管连接至装置。连接前，需从装置和蠕虫导管中推出少量液体，并使两滴液体相接，以确保在加载过程中无空气进入装置。

线虫上样
在完成所有连接后，可通过推动和拉动线虫注射器的活塞来加载动物。动物将从入口被冲向捕获通道阵列；然而，它们会自然地逆着所受流体流动方向游动。因此，需要将动物重新调整方向，使其头部朝向捕获通道。正确的动物方向可通过反复推动和拉动活塞，并给予动物一定时间旋转至理想方向来实现。这几乎可以逐条线虫进行操作，但需要一些练习。一旦动物方向正确，便可将其推入捕获通道，并使其滑行至通道末端，此处的高度台阶会阻止其进一步移动（图1A、B）。如果动物无法进入通道，则说明其体型过大，不适用于所选装置，需改用更大尺寸的装置进行成像。如果动物在进入捕获通道后仍能旋转或掉头，则说明其发育过早，应使用更小的装置，或让动物继续生长数小时后再进行操作。

重要的是，不同通道中的动物不会相互影响。因此，加载错误的动物不会影响加载正确的动物，但它们将无法充分获取食物，从而导致生长缓慢或发育停滞。

如果在合适的年龄加载动物，沿纵向通道轴的运动应极小。然而，动物可以自由扭动（图1B），并在几分钟内开始进食。如果动物沿纵向通道轴出现明显移动，可能是由于装置内压力积聚，或输液管、钝针或注射器中存在卡住的气泡所致。装置内的压力积聚可通过轻轻将蠕虫输液管从钝针上取下并重新轻轻连接来释放。如果尽管已采取上述步骤和预防措施，仍有气泡卡在系统中，则可能需要将整个蠕虫注射器取下，并更换为无气泡的新注射器。系统中的气泡会起到弹簧的作用：在加载过程中被压缩，并在加载动物后缓慢释放。气泡膨胀所产生的流动可能导致系统不稳定，将动物推出捕获通道。

芯片上成像与发育过程的观察
最后，一旦将动物样本加载完毕，即可开始图像采集。原则上，该装置适用于大多数成像方法，包括明场、落射荧光^18,19,22,23（图4）、转盘共聚焦显微镜^19,，甚至超分辨率成像模式（如AiryScan²⁴），因为所有成像均通过厚度为170 µm的盖玻片进行。因此，微流控装置对芯片上可实现的图像质量几乎没有影响。然而，无论采用何种成像方式，都必须选择不会影响动物存活率的适当成像条件。过高的激发强度会因向样品传递高能量和热量，导致荧光染料迅速漂白以及发育停滞。建议采用较短的曝光时间（约10 ms）和较低的激发强度（低于典型荧光LED光源的10%），在使用16位相机时，将对比度设置为最小值=0、最大值=1000，即可获得可用的图像（图4）。

使用 L1、L1-4 和 L2-A 装置获得的代表性数据如图4所示。图4A和补充视频1展示了秀丽隐杆线虫（C. elegans）上皮细胞从孵化/过夜饥饿到中期二龄幼虫阶段的发育过程；图4B和补充视频2展示了从晚期一龄至早期四龄幼虫阶段中命运决定为1°型的外阴前体细胞的诱导及其后续分裂过程；最后，图4C和补充视频3展示了从早期三龄幼虫阶段开始直至成虫转变时外翻完成的秀丽隐杆线虫（C. elegans）外阴结构形成过程。

每项应用均附有对不同发育时间参数的量化结果。图4A、B中的图像未进行任何后期处理，即未应用去卷积或图像配准。而图4C中的图像则经过了去卷积²⁷和配准处理，突显了使用长期成像设备时图像质量可能实现的提升。

首先，确定所示动物每个缝合细胞分裂的起始时间 图4A （参见 补充视频 1 对于全日制课程），表明在12只动物中所有细胞均保持一致且及时的分裂图4D）。利用缝合细胞，还评估了全部四个幼虫阶段的总体发育时间，发现L1期所有缝合细胞分裂在12.0 h ± 1.7 h（均值 ± 标准差，n = 22）、L2期在10.2 h ± 1.0 h（n = 27）、L3期在10.9 h ± 1.4 h（n = 27）、L4期在14.6 h ± 2.2 h（n = 19）内完成。这些数据与文献报道值一致。^2,28 以及在平板上培养的动物中测得的数值，得出L1期中位发育时间为15小时（n = 21），L2期为10小时（n = 15），L3期为12小时（n = 21），L4期为12.5小时（n = 61）（改编自Berger等）¹⁸观察到的轻微延迟可能是图像采集及其导致的光毒性，或是动物生长后活动空间受限于通道陷阱所致。

其次，我们追踪了动物在L2和L3阶段的生长过程，通过量化性腺长度来评估发育进程（图4E，完整时间序列见补充视频2）。与缝合细胞分裂的观察类似，由于线虫体轴呈直线排列，性腺长度可被精确测量，并且在所有成像个体中观察到一致的性腺生长趋势（n = 19）。在本实验中，首次VPC分裂发生在实验开始后14.26 h ± 2.47 h（约接种后30 h），第二次分裂则在此基础上延迟1.46 h ± 0.13 h（n = 19）。这些数据与在NGM平板上已报道的文献数值高度一致^29,30。Euling和Ambros³⁰报道首次分裂发生在约29 h，第二次分裂则约在其后3 h。

最后，量化了到达特定外阴发育阶段所需的时间（图4F，完整时间过程见补充视频3），具体评估了根据Mok等³¹定义的亚阶段从内陷期（L4.0，t1）进展到中L4期（L4.5，t4）所需的时间。t1至t2的平均进展时间为3.8 h ± 1.2 h，t2至t3为3.5 h ± 1.2 h，t3至t4为2.8 h ± 1.6 h（n = 7），表明发育进程大致呈线性。与发育时间测定类似，这些时间，尤其是t1至t2，相较于文献报道值（t1-t2：0.7 h，t2-t3：3 h，t3-t4：2.3 h³¹）略有延迟，可能是由于微流控装置尺寸狭窄导致蜕皮减缓所致。尽管如此，个体间的发育时间仍高度一致，所有个体均成功发育至成虫阶段。

补偿动物运动和显微镜漂移
当芯片上的阀门被激活时，单次Z轴扫描过程中动物的运动通常极小。然而，不能期望动物完全保持静止。单次扫描中观察到的残余抖动可通过增加驱动芯片阀门的压力、缩短曝光时间或增大选定的Z轴步长以加快扫描采集速度来补偿。通过使用压电Z轴驱动器，可进一步缩短扫描采集时间，其Z轴移动速度显著快于传统的显微镜调焦驱动器；或者使用多通道滤光片（例如GFP/mCherry），从而无需耗时更换滤光片即可同时采集不同荧光信号。作为参考，在所提供的示例中（图4以及补充视频1、补充视频2和补充视频3），扫描采集时间通常在3至8秒之间。如有必要，也可通过多种图像配准方法去除残余运动。

芯片上的动物预计会持续生长。因此，感兴趣区域将不可避免地沿通道的纵向轴发生位移（图4A、B，补充影片1和补充影片2）。因此，建议设置成像视野（FOV），使感兴趣区域能够生长进入FOV，从而确保在整个实验过程中不会丢失该区域（图1B和图4A、B）。或者，也可在多个相邻的FOV中对动物进行成像，以覆盖整个动物体。然而，这种方法可能带来额外的光毒性和应激反应。与Z轴运动类似，可通过多种配准方法来补偿动物在通道内随时间发生的位移。若动物沿纵向轴出现超出生长所致范围的不规则运动，则很可能是由气泡引起的。

每个长期成像装置包含六个独立的成像单元，每个单元可用于一个独立的实验。每个单元最多可容纳41只动物，且捕获通道的间距设计使得可在单个视场（FOV）内同时成像多只动物。此外，可在单个单元或装置内对多个视场（FOV）进行成像。与所有显微镜样品一样，样品表面的移动可能导致浸没介质流失，从而引起焦距漂移。这种漂移可通过使用较低黏度的浸油或采用多种自动对焦模式来补偿。然而，某些硬件自动对焦系统在与PDMS微流控装置联用时可能无法正常工作，因为这些系统依赖于从玻璃到水性介质的过渡作为参考点（即盖玻片的样品侧）。装置内的大部分视场被硅胶填充，其折射率高于水；虽然这不会影响图像质量，但可能对自动对焦产生负面影响。在对单个视场（FOV）成像时，装置内观察到的焦距漂移极小（小于2 µm）。若观察到过大的焦距漂移，可能源于显微镜系统或环境的热不稳定性、在获取多个视场时过度的XY方向移动，或装置在显微镜上安装不当（参见图3A中建议的安装方式）。

同样，过大的XY方向移动和不当的安装也可能导致XY漂移。由于装置与显微镜物镜是相连的 通过 浸液中，X、Y 或 Z 方向的快速移动可能会对设备施加作用力。如果设备安装正确且无外部力作用，其稳定性极佳，焦点漂移极小，且无 XY 漂移。

最后，如果特定系统参数设置不当，PDMS微流控装置可能会对动物发育产生不利影响。过高的阀门压力、因激发光强度过高导致的光毒性、过长的曝光时间或连续图像采集之间过短的时间间隔均会影响动物的存活率。尤其是初次使用该系统时，强烈建议使用明亮的荧光标记或明场成像来评估动物的存活情况，以确保成像条件不会影响动物的正常生长。一旦动物能够稳定发育，可根据需要调整成像参数。

图1：装置布局与原理示意图。（A）装置整体结构，显示单个单元的蠕虫进样口（i）、细菌食物进样口（ii）和通用出口（iii）。（A'）L2-A装置中捕获通道的放大视图，突出显示在不同放大倍数（40x–100x）下单个视野（FOV）中可见的蠕虫数量。（B）芯片上阀门的功能原理。当阀门关闭（OFF）时，通道高度设定为允许动物在捕获通道中自由容纳；当阀门开启（ON）时，通道高度降低，将动物压向盖玻片，从而可逆地固定被捕获的动物。图像显示两个在芯片上被捕获的动物，分别在阀门关闭和开启状态下采集，动物在压力下明显伸直并拉长。上方的动物正确加载并朝向食物源（），下方的动物则朝向相反方向（X）。（C–C"）装置结构示意图。（C）可选装置尺寸。L1适用于L1至中期L2阶段的动物，L1-4适用于中期L2至中期L4幼虫阶段的动物，L2-A适用于中期L2幼虫阶段至成虫阶段的动物。标尺分别为（A）1000 µm，（B）100 µm，和（C）50 µm。该图部分改编自Berger等人的研究¹⁸。请点击此处查看此图的放大版本。

图2设备设置与连接 (A-我) 实验装置搭建过程的示意图。A) 使用空心钢针（灰色）将充满水的1/16英寸管路连接至阀门入口，另一端连接至压力供应系统。 (B芯片上液压阀的填充 通过 芯片外的螺线管并加压装置数分钟。C在进行下一步操作前，需先释放压力。D) 使用1/32英寸管路和30 G钝针将装有细菌食物的注射器连接至食物入口，随后注液直至两个开放连接端均出现液体。E用一段1/16英寸管子堵住钢针，将蠕动泵的进样口和废液出口密封）并使用食品注射器和泵对装置加压（通过 拇指螺丝调节），保持压力数分钟。F) 移除 (E），确保每个开口连接处形成液滴。G) 废液容器的连接 通过 一段1/16英寸的短管和一根空心钢针。H) 使用中空钢针和23 G钝头针将装有缓冲液的注射器连接至装置。在将管路连接至装置前，先将线虫吸入管路中，并通过使液体液滴在入口端和管路末端对齐，确保无空气进入。我) 所有设备连接建立后的最终设置。J) 带有连接至入口和电磁阀（背景）的阀门管路的装置图像，对应于（A-C). (K) 带有食物供给管的装置放大视图，显示蠕虫入口和废液出口处的两个液滴（箭头），对应于（D). (L) 装置的放大视图，显示已连接食物供给管路，且蠕虫入口与废液出口已阻塞，对应于（E). (M) 连接废液管和废液容器的装置放大视图，对应于（G). (N) 所有管路连接就位后的最终组装，对应于 (我）。部分改编自 Berger 等人。¹⁸. 请点击此处查看此图的放大版本。

图3：硬件装置示意图。（A-A'）建议的设备安装方式。（A）直立式显微镜的可能安装方式。设备固定在一个带有大中心开孔的矩形3D打印框架上。首先在盖玻片上、设备PDMS部分的两侧各贴一小段双面胶带，然后将3D打印框架覆盖在设备上，使PDMS部分穿过开孔，同时将框架牢固地压在双面胶带上，从而将设备永久固定在框架上。因此，该框架可稳固地固定设备，并通过框架和显微镜载物台插件中嵌入的磁铁将其固定在显微镜载物台上。这确保了设备安装的稳定性，并防止显微镜物镜与任何安装部件发生碰撞。所有管路均布设在设备前方。（A'）倒置显微镜的可能安装方式。使用一组夹具紧密固定设备，确保夹具将设备压紧在载物台插件上，以防止运行过程中发生任何XY方向的移动。（B）压力系统各部件示意图。（i）外径6 mm的聚氨酯管连接至压力源；（ii）G1/8至6 mm的快接接头将管路（i）连接至压力调节器（iii）；随后通过M5至6 mm的快接接头（v）将管路连接至电磁阀（vi），最后通过鲁尔锁紧式转接头（vii）和23 G钝针（viii）连接至外径1/16"的管路，该管路再连接至微流控设备。（C）电子连接及组装完成的压力系统示意图。（i）由Arduino、数据采集卡或任何其他微控制器产生的TTL触发信号（+3.3–5 V），配合合适的电源（ii，24 VDC），按照图示连接至MOSFET（iii）和电磁阀的电子接口，并在电磁阀的电源接口两端连接一个续流二极管（iv）。当微控制器向MOSFET的栅极发送TTL信号时，+24 VDC电压施加于常闭型电磁阀，从而充气打开芯片上的液压阀；当TTL信号撤除后，压力释放，芯片上的液压阀随之关闭。请点击此处查看该图的放大版本。

图4代表性结果。 (A) 显示上皮连接标志物的动物（ML2615， dlg-1(mc103[dlg-1::gfp]) 从过夜饥饿状态开始培养至早期/中期L2幼虫阶段，使用L1装置。可见缝合细胞正在分裂，以及P细胞在晚期L1幼虫阶段前后发生迁移和分裂。B使用L1-4装置培养从晚期L1幼虫阶段至早期L4阶段的线虫。可见1°命运的阴道前体细胞（VPC）标记（AH1187， arIs92[egl-17::cfp]），实验早期可见单个细胞，随后在L3幼虫期发生两轮明显的细胞分裂。C使用L2-A装置培养从晚期L2幼虫阶段至早期成虫阶段的动物。可见上皮连接标记物（AH5786， hmr-1(cp21[hmr-1::gfp + LoxP])），突出显示正在发育的外阴组织形成明显的环状结构，以及与子宫锚细胞（AC）标记物的合并图像（AH5786， qyIs50[Pcdh-3>mCherry::moeABD，unc-119(+) 在L3幼虫阶段末期侵入阴门组织，连接各组织。所有实验均（A-C），视野（FOV）最初设置为仅显示动物的一部分。随着实验的进行，动物将逐渐占据更多的通道区域，其形态特征会因动物生长而沿通道轴向发生位移。DL1幼虫阶段单个纵缝细胞开始分裂的时间（n = 12）。插图突出显示沿身体前后轴的纵缝细胞身份（H1-V6）。E显示随时间推移动物性腺的生长情况 图4B （n = 19）。F) 显示了7个动物在阴门形态发生过程中达到4个不同发育时间点（t1-t4）所需的时间，表明所有成像个体的发育转换具有一致性。比例尺为（A，B）50 µm 和（C25 µm。参见 补充视频1，补充视频2 和 补充视频 3 适用于全日制课程。箱线图显示中位数（红线）、上下四分位数以及表示分布极值的须线（不包括离群值）。该图改编自 Berger 等人。¹⁸. 请点击此处以查看此图的放大版本。

补充视频 1：单个 C. elegans 幼虫从过夜饥饿状态发育至早期 L2 阶段的过程。 图像显示的是最大强度投影的落射荧光图像（投影总高度为 1.5 µm），其余未作处理。图中可见在指定阶段内发生的所有表皮细胞分裂与融合事件（上方）。使用 DLG-1::GFP（上皮连接）标记物，以每 15 分钟一次的频率对特征进行标记，持续共 25 小时。该视频引自 Berger 等人¹⁸。请点击此处下载该视频。

补充视频2：单个幼虫从晚期L1阶段发育至早期L4阶段，表达EGL-17::CFP标记（命运为1°的阴道前体细胞（VPC））。在早期L2阶段（约400分钟），EGL-17::CFP荧光在P6.p细胞中出现，并持续增强。在L3阶段，P6.p经历连续两轮细胞分裂，形成阴道发育的1细胞、2细胞和4细胞阶段。图像以每30分钟间隔拍摄，共持续34小时。该视频引自Berger等人的研究¹⁸。请点击此处下载该视频。

补充视频3：背侧视图：从L3期到L4/成虫过渡期发育中外阴的Z轴投影。腹侧视图：同一外阴随时间变化的X轴投影。两个视图均显示了VPCs的初始分裂，随后发生内陷、环状结构的形成与扩大，最后在外翻过程中塌陷。表荧光图像经过裁剪、去卷积、配准和投影处理后显示。结构轮廓通过HMR-1::GFP标记物（表皮和VPCs）以及mCherry::moeABD标记物（标记锚定细胞AC）呈现。本视频引自Berger等人的研究¹⁸。请点击此处下载该视频。

L1 装置的 CAD 文件。请点击此处下载该文件。

补充文件2：L1-4装置的CAD文件。请点击此处下载该文件。

L2-A 装置的 CAD 文件（补充文件 3）。请点击此处下载该文件。

L3-A 装置的补充文件 4：CAD 文件。请点击此处下载该文件。

L4-A 设备的 CAD 文件（补充文件 5）。请点击此处下载该文件。

补充文件 6：食物分配结构的 CAD 文件。请点击此处下载该文件。

补充文件 7：阀层的 CAD 文件。请点击此处下载该文件。

讨论

本文介绍了一种独特的微流控长期成像平台的操作方法，该平台适用于对多种发育过程进行高分辨率成像与追踪 秀丽隐杆线虫 在整个四个幼虫阶段直至早期成虫阶段¹⁸随时间推移追踪发育过程的能力 体内，使用此成像方法及其他方法，已在多个研究领域中变得不可或缺 秀丽隐杆线虫 研究，并使得过去无法解决的问题得以解答^23,24,29.

与使用琼脂垫的传统成像方法以及先前发表的基于微流控的长期成像策略相比，该方法在整个实验过程中保持了线虫的身份和方向性，从而能够随时间追踪复杂的发育过程。无论发育阶段如何，动物均被限制在41个平行捕获通道之一中，每个通道连接到芯片上的食物供应，并由一个大型液压阀覆盖。所有被捕获的线虫通过液压阀的膨胀实现固定，在仅需成像时将线虫压在盖玻片上。由于捕获通道阵列间距紧密，单个视野内可同时观察多个动物，从而实现高通量成像。该长期成像装置适用于大多数显微镜系统，仅需极少的额外硬件（低于1000美元），且无需对现有设备进行任何改装。装置的操作设计得有意简化，所有用户均可通过遵循上述方案及结果描述快速掌握其使用方法。

简而言之，可在芯片上对动物进行成像，覆盖长达2.5个幼虫阶段图1C）。动物首先进行同步化处理，随后直接上样到芯片上（L1装置），或接种至NGM平板并培养至所需发育阶段（L1-L4和L2-A装置）。芯片上的动物通过高浓度细菌悬浮液喂食，并利用成像软件控制的芯片内液压阀进行固定。图1B）。使用注射器将动物引入捕获通道，小心调整动物方向，使其头部朝向食物供应端，最终将动物困在捕获通道的末端（图1A 和 图2）。必须小心操作，确保注射器、钝针和管路中无空气残留，因为气泡会轻易干扰动物的位置。这些装置可与大多数成像模式兼容^18,19,24，由于PDMS材料具有高度透明、无荧光特性，并且与一层薄盖玻片密封结合（图4, 补充视频1，补充视频2 和 补充视频 3然而，在选择成像条件时必须谨慎，因为长时间曝光和高强度激发会显著影响动物的存活率，并导致荧光漂白。

除了本文介绍的成像方法版本外，该实验方案还可进行多种修改，其中一些修改已可实现。最直接的修改是替换标准细菌菌株，例如使用表达RNA干扰（RNAi）的细菌¹⁸或具有不同营养成分的细菌³²。通过调整Optiprep的含量以补偿菌体密度的差异，可轻松实现菌株更换。类似地，可在细菌食物中添加多种化合物，例如生长素（auxin）、营养物质或小分子药物化合物，并直接在活体（in vivo）中观察其效应，而无需对实验方案进行任何修改。特别地，已开发出一种培养基交换装置，用于实现生长素诱导的蛋白质降解，或适用于需要定时或可逆暴露的任何其他应用；该装置通过在原有设计中增加一个食物入口实现，无需改变装置的几何结构或操作方式。新增的入口允许在两种不同条件之间进行简单切换（例如有生长素与无生长素），其连接方式与本文中单食物源的连接方式相同，相应的变化可被直接观察。此外，还开发了其他装置变体，其中每个单元拥有独立的液压阀，而非多个单元共用一个阀门，从而可在同一装置内独立地对多种条件进行成像，减少因长时间阀门操作和图像采集可能带来的不利影响。最后，除了Berger等人最初描述的装置变体¹⁸之外，还开发了两种新的装置变体：L3-A和L4-A（本文首次介绍），可实现从中L3期或中L4期直至成虫期的连续成像。这些修改的目的是将实验起始时间推迟至更晚的幼虫阶段，以便在无需关注早期发育阶段的研究应用中，能够加载体型更大的动物进行实验。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3/2 电磁阀	Distrelec	154-22-898 和 154-22-899	上述替代品。连接压力调节器与芯片上阀门的电磁阀。
Arduino	Distrelec	301-01-956	可选微控制器，取决于所选控制器和接口。
Bacto-胰蛋白胨	Thermo Fisher Scientific	211705	用于LB培养基的制备。
Bacto-酵母提取物	Thermo Fisher Scientific	212750	用于LB培养基的制备。
23G平头针头	Gonano Dosiertechnik	GGA723050	连接1/16"管路与注射器的平头针头。
30G平头针头	Gonano Dosiertechnik	IG-TE730050	连接1/32"管路与注射器的平头针头。
C. elegans 构建体 1	NA	NA	AH5786 LGI: hmr-1(cp21[hmr-1::gfp + LoxP]) Marston, D.J. 等. MRCK-1 drives apical constriction in C. elegans by linking developmental patterning to force generation. Curr. Biol. 26 (16), 2079-2089. 2016.
C. elegans 构建体 2	NA	NA	AH1187 LGII: arIs92[egl-17::cfp] Yoo, A.S., Bais, C., Greenwald, I. Crosstalk between the EGFR and LIN-12/Notch pathways in C. elegans vulval development. Science. 303 (5658), 663-666. 2004.
C. elegans 构建体 3	NA	NA	AH5786 LGV: qyIs50[Pcdh-3>mCherry::moeABD, unc-119(+)] Ziel, J.W., Hagedorn, E.J., Audhya, A., Sherwood, D.R. UNC-6 (netrin) orients the invasive membrane of the anchor cell in C. elegans. Nat. Cell Biol., 11 (2), 183-189. 2009.
C. elegans 构建体 4	NA	NA	ML2615 LGX: dlg-1(mc103[dlg-1::gfp]) Vuong-Brender, T.T.K., Suman, S.K., Labouesse, M. The apical ECM preserves embryonic integrity and distributes mechanical stress during morphogenesis. Development. 144 (23), 4336-4349. 2017.
电缆	Distrelec	143-46-644	若选择Distrelec的电磁阀则需要。连接电磁阀与MOSFET的电缆。
三甲基氯硅烷	Sigma Aldrich	386529-25ML	用于晶圆钝化的硅烷。
胆固醇	Sigma Aldrich	C8667	用于 S-基础缓冲液的制备。
续流二极管	Distrelec	110-52-628	保护微控制器的续流二极管。
空心钢针	Gonano Dosiertechnik	GGA7R23050	23G空心钢针，用于连接1/16"管路与装置。
LB培养基	NA	NA	按标准配方自制。10 g Bacto-胰蛋白胨，5 g Bacto-酵母提取物，5 g NaCl，加水至1升，用1 M NaOH调节pH至7.0。
长期成像装置 L1	NA	NA	适用于L1至早期/中期L2幼虫的长期成像装置。自制，可应要求提供。也可提供培养基交换型变体。
长期成像装置 L1-4	NA	NA	适用于中期L1至中期L4幼虫的长期成像装置。自制，可应要求提供。也可提供培养基交换型变体。
长期成像装置 L2-A	NA	NA	适用于中期L2至成虫期（外翻）的长期成像装置。自制，可应要求提供。也可提供培养基交换型变体。
长期成像装置 L3-A	NA	NA	适用于中期L3至成虫期（外翻）的长期成像装置。自制，可应要求提供。也可提供培养基交换型变体。
长期成像装置 L4-A	NA	NA	适用于中期L4至成虫期（外翻）的长期成像装置。自制，可应要求提供。也可提供培养基交换型变体。
M9缓冲液	NA	NA	按标准配方自制。
MOSFET	Distrelec	303-41-391	金属氧化物半导体场效应晶体管，用于切换电磁阀所需的24V直流电。
NGM平板	NA	NA	按标准配方自制。
尼龙鲁尔接头	Fisher Scientific	11776048	将外径6 mm管路连接至23G平头针头的适配器。
Optiprep	Sigma Aldrich	D1556	密度匹配液体。
PDMS	Ameba	Elastosil RT601A/B	PDMS弹性体试剂盒。
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P2443	非离子型表面活性剂。
磷酸二氢钾	Sigma Aldrich	1.37039	用于 S-基础缓冲液的制备。
磷酸氢二钾	Sigma Aldrich	1.05099	用于 S-基础缓冲液的制备。
24V直流电源	Distrelec	301-63-304	24V直流电源。选择适合所用电磁阀的电源。
精密压力调节器	Distrelec	154-23-578	上述替代品。压力调节器。
G1/8压力表	Distrelec	154-23-643	连接至压力调节器的压力表。
聚氨酯管 外径6 mm	Distrelec	154-23-866	连接压力源与调节器，以及调节器与电磁阀的管路。
G1/8转6 mm快插接头	Distrelec	301-69-330	上述替代品。两个快插接头连接至压力调节器并接6 mm管路。
M5转6 mm快插接头	Distrelec	301-69-459	两个快插接头连接至电磁阀和6 mm管路。
S-基础缓冲液	NA	NA	按标准配方自制。5.85 g NaCl，1 g K2HPO4，6 g KH2PO4，1 ml 胆固醇（5 mg/ml 乙醇溶液），加水至1升。通过高压灭菌进行灭菌。
氯化钠	Sigma Aldrich	S9625	用于LB培养基和S-基础缓冲液的制备。
氢氧化钠（5M）	Sigma Aldrich	567530	用于C. elegans漂白的氢氧化钠（配制5M浓度溶液）
次氯酸钠（5%）	Sigma Aldrich	1.05614	用于C. elegans漂白的次氯酸钠（配制5%浓度溶液）
10 µm筛网	pluriSelect	43-10010-40	细菌食物制备的替代品，尤其适用于较小装置。
5 µm筛网	pluriSelect	43-10005-40	用于过滤过夜饥饿后的L1幼虫以及完成食物制备后的细菌。
SU-8	Gersteltec	GM1050	适用于1-10 µm高度的SU-8。
SU-8	Gersteltec	GM1060	适用于5-30 µm高度的SU-8。
SU-9	Gersteltec	GM1070	适用于15-200 µm高度的SU-8。
1 mL注射器	Fisher Scientific	11338763	1 mL注射器。若使用不同类型，请确保注射器筒体和推杆足够坚固，不会被注射泵压变形。
注射泵	WPI	Al1000-220	注射泵（https://www.wpiinc.com/var-2300-aladdin-single-syringe-pump.html）。
15 mL离心管	Fisher Scientific	50-809-220	用于线虫漂白和细菌制备的离心管。
2 mL离心管	Fisher Scientific	NC1186931	用于线虫制备和细菌制备的离心管。
50 mL离心管	Fisher Scientific	50-465-232	用于细菌制备和培养的离心管。
SMD镊子	Brütsch Rüegg Werkzeuge	448980	用于将1/32"管路插入装置的镊子。
Tygon管 1/16"	Fisher Scientific	642002	柔性的1/16"外径管路，用于连接大多数组件与装置。
Tygon管 1/32"	Fisher Scientific	641900	柔性的1/32"外径管路，用于连接细菌供应源与装置。
UV KUB-3	Kloe	NA	掩模对准仪和紫外曝光系统。
晶圆	Siegert Wafer	4P0/>1/525±25/SSP/TTV<10	硅晶圆。
废液容器	NA	NA	使用2 mL离心管或冻存管及空心钢针自制。