本文介绍了用于玻璃化冷冻小鼠和绵羊植入前胚胎的蒙得维的亚刮铲法，该方法采用自制的刮铲和自制的溶液。胚胎在两种浓度递增的冷冻保护剂溶液中快速平衡后，被加载到刮铲上，浸入液氮中，最后用0.5 mL麦管密封。
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摘要
摘要
本研究介绍了一种高效且经济的小鼠和绵羊胚胎玻璃化冷冻保存方法，称为乌拉圭蒙得维的亚刮铲法（Spatula Montevideo, MVD）。该方案采用自制刮铲作为携带装置，刮铲由加样枪凝胶加载尖头制成。胚胎在两种自制的、浓度递增的冷冻保护剂溶液中快速平衡后，被加载至刮铲上，随后直接浸入液氮中。一个刮铲可装载约30–40枚处于着床前阶段的小鼠胚胎，并用一支0.5 mL麦管进行密封。与常用于储存玻璃化胚胎的冻存管相比，使用刮铲可优化液氮杜瓦瓶内的储存空间。此外，复苏过程仅需一种自制的、浓度递减的蔗糖溶液即可使胚胎复水并恢复其形态。本实验室已成功应用乌拉圭蒙得维的亚刮铲法保存小鼠和绵羊着床前胚胎超过10年。该方法在小鼠胚胎中表现出平均84%的回收率（回收胚胎数/玻璃化胚胎数）和97%的存活率（存活胚胎数/回收胚胎数）。与慢速冷冻相比，小鼠胚胎的玻璃化冷冻效果更佳，但在生殖结局（妊娠率、分娩率和出生率）方面未观察到显著差异。在绵羊胚胎中，乌拉圭蒙得维的亚刮铲法所达到的存活率和胚胎发育率与商用装置相当；尽管商用装置的妊娠率较高，但新生羔羊的存活率在不同装置间无显著差异。乌拉圭蒙得维的亚刮铲法是一种简便的冷冻保存技术，可用于储存多余胚胎、备份基因修饰小鼠品系和绵羊模型，并促进全球研究人员之间的胚胎交换。
引言
由于基于核酸内切酶的技术（尤其是CRISPR/Cas9）的发展，转基因动物（GM）的制备效率已显著提高。全球许多实验室已构建出多种转基因小鼠和大鼠品系，这些品系应进行冷冻保存，以防止遗传漂变并维持原始表型的完整性1。此外，存档保存可避免持续繁育，而持续繁育往往导致动物数量过度增长。一些实验室将转基因小鼠品系以冷冻胚胎或精子的形式送往国际保种库，从而促进这些模型的共享，同时避免活体动物的运输。这使得相关品系能够被便捷获取，而无需重复构建相同的转基因动物模型2。基于上述原因，胚胎和精子的冷冻保存在任何转基因动物设施中均至关重要。通常，优先选择胚胎冷冻保存来储存转基因品系，因为胚胎含有完整的二倍体基因组及其修饰，并可通过胚胎移植轻松恢复。
玻璃化冷冻是一种非平衡过程，其特征是进入细胞的水分与在细胞周围形成胞外冰晶的水分之间存在不平衡。该方法可防止胞内冰晶的形成，从而区别于慢速冷冻法（SLF）3（见图1）。高浓度的冷冻保护剂与液氮（LN2）直接接触，可实现超快速冷却（约40 °C/s），在数秒内使样品达到玻璃化状态。此外，与慢速冷冻相比，玻璃化冷冻速度更快、操作更简便且成本更低4。该方法对液氮（LN2）的需求量极少，通常使用可商业购买或自制的简单设备即可完成5（见图1）。
此外，解冻过程通常快速且可重复。操作应迅速进行，以避免冷冻保护剂的毒性，并维持玻璃化状态3。在冷冻胚胎时，许多实验室会考虑载体装置的便捷性、可靠性、耐用性、承载容量以及成本。
我们倾向于使用蒙得维的亚匙形器（MVD）装置，采用最小体积匙形器玻璃化法对绵羊和小鼠胚胎进行常规冷冻保存6最初，我们采用了慢速冷冻法7 但迅速过渡到玻璃化冷冻。为液氮中创建一种更简单且更节省空间的装置2 杜瓦瓶，我们对Tsang和Chow（2009）设计的自制刮铲进行了改进8，插入冻存管中，以制备 spatula MVD，并用 0.5 mL 吸管密封（参见 材料列表）。刮刀带有凝胶加样器吸头（参见 材料表），其中通过精细镊子轻轻熔化尖端形成约1 mm²的平台，制成用于装载胚胎的花瓣状平板。该平台可在一小滴玻璃化溶液中容纳多达40个鼠胚。识别插杆（见 材料清单）插入凝胶加样器吸头的开口端。
本方法旨在以一种简单、快速且低成本的方式对胚胎进行玻璃化冷冻，同时节省液氮罐中的空间。该系统已成功应用多年，获得了极高的胚胎存活率（约97%）和良好的生殖结果，尤其适用于小鼠胚胎。由于Spatula MVD在实验室中自行制备，与 commercial devices 相比成本较低9。此外，与使用 cryotubes 相比，该方法还能节省液氮罐中的空间8,10。
图1：胚胎冷冻保存两种主要技术的比较。本图经Crispo等1许可修改。在BioRender.com上制作。 请点击此处查看此图的放大版本。
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方案
用于获取小鼠胚胎的动物饲养和操作均依据国家法律 18.611 及国际动物护理指南11进行。实验方案（许可编号 #007-18）已获得乌拉圭巴斯德研究所动物护理与使用委员会的适时批准（已提供书面同意）。绵羊卵母细胞/胚胎的实验方案已获 IRAUy 基金会机构动物护理委员会批准（方案编号 #001-2017），符合 ARRIVE 指南12，并依照国际动物护理指南11实施。
1. 玻璃化冷冻（图2）
- 刮刀MVD制备
- 剪短凝胶加样器吸头（参见 材料列表通过切除前10 mm和尖端锥形部分。
注意：这将形成一个更短、更直的尖端，便于最终使用 0.5 mL 秸秆进行封口（参见 材料表). - 用钟表匠5号镊子夹住凝胶加样器吸头末端（参见 材料表）距离尖端约1.0 cm处。将尖端轻轻放入本生灯火焰中（参见 材料表）并保持8-10秒，形成一个约1 mm的花瓣状平台2.
- 从火焰中取出，用镊子夹紧保持5秒。
- 使用体视显微镜（参见 材料表），检查花瓣状平台（约 1 mm2）形成，远端边缘被封闭。
注意：平台远端必须封闭，以防止淋巴结（LN）流失2 玻璃化过程中的渗透。确保平台干净且无塑料丝。如果平台过小或带有丝状物，则剪去尖端并重复该步骤。 - 重复步骤 1.1.1–1.1.4，以制备所需数量的刮铲（1 把刮铲 = 最多 40 个 小鼠胚胎）。
- 使用紫外线（UV）或环氧乙烷对刮勺进行灭菌，并将其存放于无菌试管或盒子中。
- 在玻璃化冷冻当天，取出载片，从平台的另一端进行操作。插入鉴定棒（参见 材料表将每个刮勺置于体视显微镜载物台上。使用永久性记号笔或耐液氮标签在棒上标记。
注意：操作 spatula 时应始终避免触碰平台。完整装置（spatula + 0.5 mL 吸管 + 鉴别杆）的总长度不得超过烧杯长度的 1 cm。
- 剪短凝胶加样器吸头（参见 材料列表通过切除前10 mm和尖端锥形部分。
- 玻璃化冷冻溶液的制备
- 制备FS溶液：溶解1.5 g密度梯度介质（参见 材料表）和 0.85 克蔗糖（见 材料表) 加入 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS；参见 材料表）。在沸水浴中加热至完全溶解，然后使用以下方法进行灭菌： 0.22 µm 过滤器（参见 材料表).
注意：该溶液可在 4 °C 长达6个月。 - 配制玻璃化前处理液（PV）：在玻璃化处理当天，将10%乙二醇（见 材料表），10% 二甲基亚砜（参见 材料表），以及80% M2培养基（参见 材料列表）。总体积为 100 µL 需要5个药铲。
- 制备玻璃化冷冻液（V）：在进行玻璃化冷冻当天，将15%乙二醇、15%二甲基亚砜、10% M2培养基和60% FS溶液混合。总体积为 100 µL 5 把药匙所需。
- 制备FS溶液：溶解1.5 g密度梯度介质（参见 材料表）和 0.85 克蔗糖（见 材料表) 加入 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS；参见 材料表）。在沸水浴中加热至完全溶解，然后使用以下方法进行灭菌： 0.22 µm 过滤器（参见 材料表).
- 胚胎脱水与玻璃化冷冻过程
- 制备LN2：加入液氮2 放入合适的容器中（例如，10 cm × 30 cm × 20 cm 的带保温层聚苯乙烯容器），并放入与将要使用的刮铲数量相当的 0.5 mL 冷冻细管。
注意：为便于在液氮中操作时观察刮铲平台2建议使用底部带绝缘层的彩色聚苯乙烯容器，以产生对比效果。
注意：佩戴适当的眼部护具和手套（参见 材料表处理液氮时2. - 准备溶液：在直径100 mm的塑料培养皿中（见 材料清单），加入以下试剂： 100 µL M2 的 20 µL PV溶液的量，以及 20 µL 每把 spatula 使用 V 溶液
- 玻璃化冷冻胚胎：将待玻璃化冷冻的胚胎置于M2液滴中。每次处理30–40枚胚胎，先在PV溶液液滴中孵育30秒，再转移至V溶液液滴中，在室温（RT）下继续孵育30秒。
- 使用拉制的玻璃毛细管（参见 材料表）连接吸液管组件（参见 材料清单）。用至少预填充毛细管 1 µL 在放置胚胎之前，先加入相应溶液。
注意：胚胎在液滴中的位置高度可能不同，因此需调节体视显微镜的微米尺以定位胚胎。当剩余10秒时，从每滴中取出胚胎。所有胚胎操作均须在体视显微镜下进行。 - 加载胚胎：用最少的V溶液吸取胚胎（例如，约 0.1 µL并将它们迅速放置到刮铲平台上。
- 液氮浸泡2：加入胚胎后，立即将刮铲平台浸入液氮中2 5 秒（用手握住刮勺的杆部）。然后，在保持刮勺处于液氮中的同时2 蒸气，用长不锈钢镊子以0.5 mL吸管密封（参见 材料表).
注意：移除 LN2 在密封前从麦管中取出刮铲，以防止复温时膨胀。确保刮铲与麦管对齐，避免胚胎液滴接触麦管壁。为方便操作，已密封的刮铲可保留在液氮中2 容器，直至所有刮勺均装有胚胎，期间以液氮补充2 必要时。 - 重复步骤：对每组胚胎重复步骤 1.3.3 至 1.3.7，每次使用新鲜的一对 PV 和 V 液滴。
- 储存：将刮刀转移至烧杯中（参见 材料表）然后转移到一个LN2 储存杜瓦瓶（参见 材料清单).
- 制备LN2：加入液氮2 放入合适的容器中（例如，10 cm × 30 cm × 20 cm 的带保温层聚苯乙烯容器），并放入与将要使用的刮铲数量相当的 0.5 mL 冷冻细管。
图 2：使用 Spatula MVD 进行玻璃化冷冻过程的示意图。 详见正文。由 BioRender 制作。Meikle, M. (2025) https://BioRender.com/x96y902。 请点击此处查看此图的放大版本。
2. 加热（图3）
- 溶液制备
- 通过将0.85 g蔗糖溶解于2.5 mL M2培养基中，配制1 M蔗糖溶液。使用0.22 µm滤器对溶液进行灭菌。
注意：该溶液可提前配制并在4 °C下保存最多1周。 - 通过用适当体积的M2培养基稀释1 M蔗糖溶液，配制0.5 M和0.25 M蔗糖溶液。
- 在加热板（参见材料表）上将蔗糖溶液保持在37 °C，直至开始升温操作。
- 通过将0.85 g蔗糖溶解于2.5 mL M2培养基中，配制1 M蔗糖溶液。使用0.22 µm滤器对溶液进行灭菌。
- 升温板的准备
- 在直径100 mm的塑料培养皿上，为每把待升温的 spatula 准备以下液滴：一个500 µL的0.5 M蔗糖液滴、一个50 µL的0.5 M蔗糖液滴和一个50 µL的0.25 M蔗糖液滴。另准备三个M2培养基液滴（每个100 µL）用于洗涤。
- 升温过程
注意：升温过程在室温（RT）下进行，例如体视显微镜台面上的20–22 °C环境。- 从液氮罐中取出密封的 spatula，将其放入盛有液氮（LN2）的适当容器中。参见图3。
- 将升温板置于体视显微镜上。每次操作一把 spatula，用不锈钢镊子夹住 spatula 底部，戴手套的手取出识别杆，然后取出麦管。迅速将承载胚胎的平台浸入500 µL的0.5 M蔗糖液滴中。
- 确保所有胚胎均已落入液滴中；如有必要，可轻轻移动 spatula 以帮助胚胎释放。将胚胎吸入拉制的玻璃毛细管中，转移至50 µL的0.5 M蔗糖溶液液滴中，并孵育2分钟。
- 将胚胎转移至50 µL的0.25 M蔗糖溶液液滴中，继续孵育2分钟。
注意：在将胚胎放入每种溶液前，应先用即将使用的溶液预填充毛细管。 - 最后，将胚胎在三个不同的M2培养基液滴中各洗涤一次，以去除蔗糖。
- 将胚胎置于适合各自物种的条件下孵育至少1小时后再使用。
图 3：刮刀式MVD复温过程示意图。详见正文。 使用BioRender创建。Meikle, M. (2025) https://BioRender.com/k91k191。 请点击此处查看此图的高清版本。
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结果
我们最初采用基于丙二醇溶液、细管和程序降温设备的传统慢速冷冻方法7然而，在考虑到玻璃化冷冻法可能是一种更简便且更具成本效益的选择后，我们开展了一项研究，比较传统慢速冷冻法（SLF）与斯帕图拉蒙特维多法（Spatula MVD）在8细胞期胚胎中的应用效果 体内 获能及2-细胞 体外 小鼠胚胎13 (表1 和 表2）。结果以 "复苏率" 指解冻后从装置中回收的胚胎数占冷冻保存胚胎总数的比例。 "存活率" 指从装置中回收的胚胎中具有活力的胚胎数量。若卵裂球完整（2细胞胚胎中有2个卵裂球，8细胞胚胎中至少有4个卵裂球），则认为胚胎具有活力。14这些术语用于评估该装置及整个流程是否适用于胚胎冷冻保存。
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讨论
Spatula MVD 是一种易于组装、低成本、最小体积的玻璃化冷冻装置，具有较高的胚胎承载能力以及优化的液氮杜瓦瓶占用空间。该方法已被证明简单、快速且可靠。我们平均不仅实现了较高的玻璃化冷冻胚胎回收率和存活率（约90%），而且在小鼠胚胎移植中也获得了良好的生殖结果（约80%的妊娠率和约30%的出生率），与其他最小体积玻璃化冷冻方法相当18,19,20。
spatula MVD 玻璃化冷冻方法的关键步骤包括：（i）刮匙制备。该技术需要较高的操作经验。使用镊子加热凝胶加样枪头末端所形成的平台应约为 1 mm2，且末端必须封闭。若枪头末端未封闭，在复温过程中将刮匙浸入蔗糖液滴时，由于温度差异可能产生气泡。气泡会干扰胚胎的寻找与回收。（ii）胚胎在玻璃化冷冻液中的孵育。由于密度较高，胚胎在液滴中会处于不同高度，因此需要快速吸出全部胚胎。若胚胎在室温下长时间停留于这些溶液中，可能发...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢 Alejo Menchaca 对 Spatula MVD 技术开发所做出的贡献。GS 获得了乌拉圭共和国大学理学院生物技术研究生项目（https://webmasterbiotecnol.wixsite.com/biotec1）的资助（资助编号：GS 2437 347）。GS、MNM 和 MC 获得了南方共同市场结构趋同基金（FOCEM - Fondo para la Convergencia Estructural del Mercosur，https://focem.mercosur.int/es/）的资助（资助编号：COF 03/11）。GS 和 MC 为乌拉圭国家研究者体系（Sistema Nacional de Investigadores）和国家研究与创新局（Agencia Nacional de Investigación e Innovación, Uruguay，https://www.anii.org.uy/）的在研学者。上述资助方（生物技术研究生项目 - 理学院 - 乌拉圭共和国大学；南方共同市场结构趋同基金；乌拉圭国家研究者体系，国家研究与创新局）在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 µm 滤膜 | Sartorius | 16534 | Minisart 注射器滤器 0.2 µL |
| 0.5 mL 吸管 | Minitube | 13408/0044 | 法国型中号细管 |
| 抽吸管组件 | Sigma | A5177 | |
| 本生灯 | Indulab | 7000134 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma | D2650 | |
| 乙二醇 | Sigma | 102466 | |
| Ficoll PM70 | Sigma | F2878 | 密度梯度介质 |
| 凝胶加样枪头 | Eppendorf | 10411193 | |
| 玻璃毛细管 | Marienfeld | 2900000 | 微量血细胞比容毛细管 |
| 液氮2操作手套 | Tempshield | CE0338 | 低温防护手套 |
| 杯状容器 | Minitube | 16913/1133 | |
| 液氮2操作护目镜 | 3M | 40661-00000-10 | 防雾、防刮涂层 |
| 加热板 | Labec | LA-SH-II-5B | 数字型号 |
| 标识棒 | IMV technologies | 6326 | 非无菌 LG48 mm |
| 隔热泡沫塑料容器 | |||
| 液氮2储存杜瓦瓶 | Taylor-Wharton | XT21-AI | Cryoscience |
| 长不锈钢镊子 | Fine Science Tools | 11000-25 | |
| M2 | Sigma | M7167 | |
| PBS | 自制 | 磷酸盐缓冲液。通常配制1 L 5x浓缩缓冲液，使用时稀释至1x。配方：40 g 氯化钠，1 g 氯化钾，7.2 g 无水磷酸氢二钠，1.2 g 磷酸二氢钾。加入蒸馏水并经高压灭菌处理。 | |
| 塑料培养皿 | Falcon | 351029 | 未经组织培养处理的细菌培养皿 |
| 体视显微镜 | Olympus | SZ2-LGB | |
| 蔗糖 | Sigma | S1888 | |
| 钟表匠#5镊子’s #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 |
参考文献
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重印与许可
