需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

小鼠糖尿病肾损伤发病机制中全肾、髓质及皮质肾小管的比较蛋白质组学分析

1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/68177

⸱

2025年5月2日

 ,  ,  , 
1Division of Nephrology and Hypertension and Proteomics Technology Center, Department of Medicine, University of Louisville School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种针对全肾、分离的皮质小管以及髓质蛋白质组进行蛋白质组学分析的详细方案。该研究还比较了糖尿病小鼠模型与非糖尿病小鼠的区域蛋白质组差异。

摘要

明确肾脏疾病中事件发生的顺序是肾病学临床实践的核心。组织蛋白质组学分析是理解肾脏病理生理学基本生理和分子过程的重要方法。本文所介绍的方法和方案将有助于对与疾病后遗症相关的各个特定区域进行肾脏的分子解剖。为了确定疾病对具有独特功能的特定肾脏区域和结构的影响，本方案的目标是联合展示简化的 小鼠肾脏分区技术以及肾皮质小管分离技术，并结合简化的无标记定量蛋白质组学工作流程。整合这些方法将有助于识别整个肾脏、髓质区室以及皮质小管结构中异常的分子模式，最终实现病理条件下单细胞蛋白质组学的目标。在几乎任何疾病模型中应用这些方法，都将有助于阐明与肾功能障碍相关的病理机制。

引言

慢性肾脏病（CKD）是现代医学中的一个重大问题，仅在美国，其医疗支出就超过860亿美元1。在全球范围内，随着糖尿病及其相关肾脏合并症的流行，CKD的发病率正在上升。接近14%的美国人口患有CKD （USRDS 2024年度报告）。此外，糖尿病肾病是CKD的一种形式，也是终末期肾病（ESRD）的主要原因，约60%的ESRD患者患有糖尿病1,2,3。糖尿病会影响肾脏功能单位——肾单位的所有结构和细胞类型。如图1所示，肾单位的不同部分位于肾脏的皮质和髓质区域。肾脏的大部分由肾小管组成。肾小管功能障碍和结构病变在糖尿病肾病（DN）的发生发展中起着重要作用，这些改变与肾功能下降速率密切相关4,5,6,7,8。在糖尿病早期，由于各段肾小管对葡萄糖增加以及伴随的钠离子摄取和膜转运蛋白需求上升作出反应，肾小管会发生肥大。随着糖尿病后期微血管损伤加重，肾小管出现萎缩和扩张，同时伴有间质纤维化和扩张9。本实验室先前的研究发现，糖尿病小鼠肾脏皮质小管中蛋白质组发生改变，并存在大量应激反应蛋白10,11。髓质在调节尿液浓缩方面具有重要作用，肾病期间的功能障碍与氧化应激相关；由于代谢活动耗氧量增加、膜转运蛋白活性升高以及微血管损伤，糖尿病会导致该区域肾脏氧张力降低12,13,14。

深入理解糖尿病肾病（DN）发生与进展的详细机制是一项持续进行的工作，需要采用新颖且综合的方法，包括疾病建模、信号通路的分子谱分析、细胞蛋白质动态的适应性变化，以及对慢性病变条件下受损肾细胞和组织成分进行精确定义。蛋白质组学、代谢组学和转录组学为从分析层面探究肾脏疾病的分子机制提供了可能。“组学”（Omics）是一个相对较新的领域，利用系统生物学方法以获得对生物系统的全局性认识。近几十年来，蛋白质组学已成为肾脏病学中一种强大的组学研究工具。生物标志物研究在过去20年中迅速扩展，相关出版物数量的增长即为明证，但要将这些研究成果充分应用于临床，仍需大量工作15。由于肾皮质和髓质中存在多种截然不同的肾小管细胞群体及其相应的功能角色，对整个肾脏进行蛋白质组分析可能会掩盖这些不同区域中特定结构所发生的独特变化。因此，本研究的目标是展示肾皮质与髓质的分离，以及皮质中肾小管与肾小球的分离，并随后提供从分离结构中制备蛋白质提取物的详细方案，用于先进的质谱分析和生物信息学分析。糖尿病肾病的小鼠模型在阐明疾病进展机制方面具有重要作用。在本研究中，我们采用了OVE26转基因小鼠模型，该模型会早发I型糖尿病，并表现出人类早期和晚期DN的特征，包括：1）肾小球滤过率早期升高随后下降；2）肾脏肥大；3）肾小球基底膜增厚和系膜区扩张；4）严重蛋白尿；以及5）肾小管间质纤维化9,16,17。选择2月龄小鼠旨在揭示在明显结构损伤出现之前，肾小管区室中的蛋白质组变化。如先前报道及图2所示，2月龄OVE26小鼠已出现肾小球系膜基质扩张（图2，绿色箭头）和严重蛋白尿17，但在年轻糖尿病小鼠中，近端小管尚未出现明显的组织学改变（图2，黄色箭头）。本文提出一种联合定量蛋白质组学方法，用于对全肾、髓质及皮质肾小管进行表征，以阐明并展示糖尿病状态下各区室间蛋白质组的差异。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

OVE26 和 FVB 小鼠的相关研究已获得路易斯维尔大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）指南的批准。转基因雌性 OVE26（糖尿病型；品系编号：005564）和 FVB（非糖尿病型；背景品系；品系编号：001800）小鼠购自杰克逊实验室（缅因州巴港）。动物饲养于 12 小时光照/12 小时黑暗循环、25 °C 环境中，并可自由获取水和食物。所有研究均使用 2 月龄小鼠进行。

1. 动物模型

  1. 肾脏分离
    1. 通过腹腔注射给予小鼠80 mg/kg氯胺酮和12 mg/kg赛拉嗪以进行麻醉。
    2. 使用小型手术剪在腹部正中做切口，用棉签轻轻将小鼠的肠管移至一侧，以暴露下腔静脉。
    3. 在右肾上方的下腔静脉处做一个小切口。
    4. 通过左心室向小鼠灌注 20 mL 冷磷酸盐缓冲盐水（PBS：pH 7.4；210 mg/L KH2PO4，9 g/L NaCl，726 mg/L Na2HPO4·7H2O）使用蠕动泵，以10 mL/min的流速进行。
      注意：如果在后续分析中肾脏中血液蛋白和细胞的残留并非关键因素，则此步骤并非必需。
    5. 使用小型手术剪取肾脏。去除肾脏外部多余的脂肪组织。称量肾脏重量，并将其置于冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中。
    6. 去除肾包膜。
    7. 将肾脏置于置于冰上的玻璃板或培养皿中。使用剃刀片对肾脏进行数次横向切割（图3以获得肾脏上极与下极之间3-4个切片。
    8. 保留1-2个中间切片及两端极部（用圆圈标出的肾脏切片） 图3每个肾脏留出一部分作为 "整个肾脏" 样品。取部分样品放入1.5 mL离心管中，加入预冷的匀浆缓冲液（10%甘油，50 mM HEPES，100 mM KCl，2 mM EDTA，0.1% NP40，10 mM NaF，0.25 mM NaVO₃），充分混匀。3，1x HALTS蛋白酶抑制剂），用量约为每毫克组织样本10 µL（根据获取的肾脏重量估算肾片质量）。将离心管置于冰上。
    9. 对于其余的中段横切片，将切片平放，然后使用刀片或手术刀小心地从每片切片上削去皮层（最外层1 mm）图3，示意图工作流程）。在进行皮质小管分离方案时（下文步骤1.3），需将皮质区域与髓质区域分开。
    10. 将解剖得到的延髓组织部分放入1.5 mL离心管中，加入冰上预冷的匀浆缓冲液（同步骤1.1.8），并将离心管置于冰上。
    11. 将未用于匀浆的所有剩余完整肾脏和肾髓质组织在液氮中速冻，并于 -80 °C 保存。
  2. 或者，将分离出的整个肾脏和髓质组分冷冻，并按照步骤1.1.11所述进行保存。后续从储存中取出，按步骤1.1.8加入匀浆缓冲液。
  3. 皮质小管分离
    1. 在玻璃板或培养皿上用剃刀将分离的皮层组织切碎成1-3 mm大小的组织块，制成糊状。
    2. 在37 °C的摇动水浴中，用1 mL I型胶原酶A（1 mg/mL）消化切碎的皮层组织30分钟。
    3. 将一个100 µm细胞筛置于冰上的50 mL锥形管顶部。
    4. 将消化后的皮质悬液置于100 µm细胞筛网上，使用10 mL注射器的推杆轻轻压过筛网。用1 mL PBS洗涤筛网顶部，再用1 mL PBS洗涤筛网底部。
    5. 将滤液通过50 mL管中的额外100 µm滤网过滤，然后用1 mL PBS冲洗滤网顶部。
    6. 将滤液通过置于冰上、装有50 mL锥形管的70 µm细胞滤筛。小管将穿过该滤筛进入滤液（肾小球则保留在70 µm滤筛上）。用1 mL PBS冲洗滤筛。
    7. 将最终滤液在120 × g离心 g 4 °C 下离心 2 分钟。弃去管状沉淀中的多余 PBS。
    8. 在显微镜下使用10倍物镜观察皮质小管沉淀物的纯度。如果该组分中超过10%含有肾小球，则用1 mL PBS重新悬浮滤液，并通过一个新的70 µm细胞筛网过滤，无需对筛网进行额外清洗。
    9. 将富集的肾小管组分分装至1.5 mL离心管中，于2000 × g 4 °C下离心2分钟。弃去上清液。
    10. 将匀浆缓冲液加入肾小管沉淀物中，操作同步骤1.1.8和1.1.10中所述的全肾和髓质处理方法。
  4. 组织匀浆/蛋白质提取
    1. 使用专用于1.5 mL离心管的塑料研磨棒，在1.5 mL微量离心管中对每种样品类型进行匀浆。如果匀浆后的悬浮液过于黏稠，可按需添加额外的匀浆缓冲液。
    2. 将匀浆后的悬液置于冰上静置15分钟，随后在水浴超声仪中进行5分钟超声处理（仪器仅具备开关功能，无调节设置），水浴温度保持在25 °C。超声后将样品置于冰上静置10分钟。
    3. 短暂涡旋振荡（1000–1500 RPM）匀浆液，然后用移液器吹打20次，冰上静置15分钟。
    4. 在以13,000 × g离心前，将样品反复吹打数次 g 4 °C 下孵育 20 分钟。
    5. 将澄清的蛋白质提取物转移至洁净的离心管中。
    6. 分装30 µL澄清提取物用于蛋白质定量及质谱分析样品制备。其余样品储存于-80 °C。

2. 悬浮捕获微型离心柱消化方案

  1. 蛋白质经蛋白酶解消化为胰蛋白酶片段用于蛋白质组学分析
  2. 将约40–50 µg样品（浓度约2 µg/µL）用裂解缓冲液（含10% w/v 十二烷基硫酸钠[SDS]、100 mM 三乙基碳酸氢铵（TEA-BC）pH 8.5 和 40 mM 三(2-羧乙基)膦[TCEP]）稀释至终体积46 µL。
  3. 蛋白质的还原与烷基化
    1. 65 °C 下孵育 30 分钟（TCEP 的终浓度为 20 mM）。
    2. 加入4 µL 0.5 M碘乙酰胺（溶于液相色谱-质谱联用级水中），避光室温孵育30分钟（碘乙酰胺终浓度为40 mM）。
  4. 加入5 µL质量分数为12%的磷酸水溶液（通过将141 µL的85%磷酸稀释于859 µL的液相色谱-质谱级水中配制12%溶液）。
    1. 磷酸的替代品，若进行磷酸化肽富集，可使用三氟乙酸或甲酸18.
  5. 加入350 µL悬浮液捕获结合缓冲液（100 mM TEA-BC，含90% v/v甲醇/10% v/v水，pH 7.55）。
  6. 将样品加入悬浮液捕获柱中。在4,000 × g 在室温下，使用固定角转子以30秒离心使每个体积通过层析柱。
  7. 用 400 µL 悬浮捕获结合缓冲液洗涤 4 次。4,000 x g 离心 g 在室温下，使用固定角转子离心30秒，使每次洗涤液通过层析柱。
    注意：为帮助去除SDS，每次洗涤后将柱子在离心转子中旋转180°。
  8. 在 4,000 离心 g 室温下离心1分钟，以彻底去除结合缓冲液（防止消化过程中液体滴落）。
  9. 将悬浮捕获柱转移至新的收集管中。
  10. 加入2.5–5 µg胰蛋白酶至125 µL的50 mM TEA-BC（pH 8.5）溶液中，溶剂为液相色谱-质谱级水（胰蛋白酶，质谱级）。胰蛋白酶与样品的最终比例为1:20至1:10。
  11. 在47 °C孵育2小时（切勿拧紧管盖；建议使用转速设为0 RPM的温控混匀仪）。用针头在管盖上刺一个小孔，可防止悬滴捕集装置上腔压力积聚（压力升高会导致胰蛋白酶溶液滴入柱中）。
  12. 加入80 µL用LC-MS级水配制的50 mM TEA-BC（pH 8.5）。在4,000 g 在室温下，使用固定角转子以1分钟离心，使每个消化液通过柱子。
  13. 加入80 µL体积分数为0.2%的甲酸水溶液（LC-MS级水）。在4,000 ×g条件下离心 g 在室温下以固定角度转子离心1分钟，收集步骤2.11中的消化液。
  14. 加入80 µL的LC-MS级水中的50% v/v乙腈。使用固定角转子，在室温下以4,000 g离心1分钟，收集步骤2.11中的消化液。
  15. 将悬浮捕获物洗脱液于 -80 °C 保存。
  16. 在真空浓缩仪中干燥样品。
  17. 将干燥的样品在 -80 °C 下保存。

3. 使用亲水-亲脂平衡（HLB）柱进行纯化

  1. 配制溶液 A（2% v/v 乙腈/0.1% v/v 甲酸）和溶液 B（80% v/v 乙腈/0.1% v/v 甲酸）。
  2. 将样品溶解于 500 µL 溶液 A 中。
  3. 将色谱柱置于真空装置中，并以约 1–2 mL/min 的气体压力进行处理。
  4. 向 HLB 色谱柱中加入 500 µL 溶液 B，并以 1–2 mL/min 速度抽真空；重复两次。
  5. 向 HLB 色谱柱中加入 750 µL 溶液 A，并以 1–2 mL/min 速度抽真空；重复两次。
  6. 在 HLB 色谱柱下方放置一支洁净的 2 mL 微量离心管，将样品用 500 µL 溶液 A 溶解后上样，并施加与前述相同的气体压力；将穿流液再次通过色谱柱。
  7. 将 HLB 色谱柱置于废液管上方，加入 500 µL 溶液 A，并按上述方式抽真空；重复两次。
  8. 将色谱柱置于一支洁净的 2 mL 微量离心管上方，加入 500 µL 溶液 B，并按上述方式抽真空；重复两次。
  9. 将洗脱液在 -80 °C 冻结，然后在真空浓缩仪中干燥。将干燥后的残留物于 -80 °C 保存。
  10. 在进行质谱分析前，将残留物溶解于 20 µL 的 2% v/v 乙腈/0.1% v/v 甲酸中。使用分光光度计在 205 nm 吸光度处估算肽浓度。

4. 质谱分析

  1. 一维反相液相色谱（LC）-质谱/质谱分析
    1. 将等量的肽段（约 600 ng）上样至一维纳米液相色谱系统，并在反相C18柱上进行分离。
    2. 在1.8 kV喷雾电压下，将肽段直接洗脱进入质谱仪，离子传输管温度保持在250 °C。
    3. 采用数据依赖性采集模式，选择前20个最强离子进行MS/MS分析，其中最强烈的MS/MS碎片离子将被暂时排除出分析队列，以提高低丰度离子的鉴定深度。

5. 数据分析与生物信息学

  1. 数据处理流程
    1. 在 PEAKS 12.0（LC-MS/MS 数据分析软件）中完成谱图指认及肽段和蛋白质鉴定后，将蛋白质列表提交至 MetaboAnalyst 6.0（代谢组学数据分析平台），采用单因素统计分析方法进行分析（https://www.metaboanalyst.ca/）。
    2. 使用 LC-MS/MS 数据分析软件，以严格的假发现率（FDR）标准（1% 蛋白质和 肽段）在小鼠已审阅的 FASTA 数据库中进行谱图搜索与筛选。
      注：其他可选的常用搜索程序包括 Maxquant、Proteome Discoverer 等。
    3. 指定半胱氨酸的羧氨甲基化为固定修饰，甲硫氨酸的氧化为可变修饰。
    4. 将列表转换为逗号分隔值（CSV）格式，并为每一列和每一行分配组别/样本标签。该格式在代谢组学数据分析平台中具有良好的兼容性。
    5. 对缺失值采用“1/5 最小值法”进行填补。
    6. 使用四分位距（IQR）对数据进行过滤，排除高变异值，截断阈值设为 40% 方差。
    7. 将数值归一化至中位强度，进行 log10 转换，并进行均值中心化以实现数据缩放。可采用其他归一化方法，但需注意结果可能有所不同。
    8. 以非配对方式执行 T 检验，p 值截断标准为 < 0.05，并在此阶段进行多重检验校正。
      注：本研究出于数据展示目的，未对代表性数据集进行此项校正。
    9. 绘制火山图，设定阈值为 1.5 倍变化（FC）且 p < 0.05。
    10. 生成热图，并对样本组进行偏最小二乘判别分析（PLSDA）以及统计学分析（投影重要性变量 [VIP] 分析）。
    11. 后续研究的潜在候选蛋白应满足以下任一条件：变化倍数超过 1.5 倍且 p 值 < 0.05，或 VIP 值 > 1.0，如 PLSDA 分析所示。
    12. 生成维恩图，以展示 OVE26 小鼠全肾、肾小管和肾髓质蛋白质组之间的差异。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

总体而言，每种样本类型的总蛋白质鉴定数量分别为：1）全肾（1438）、2）髓质（2145）和皮质小管（1859）。经 MetaboAnalyst 6.0 数据处理、数据过滤和缺失值填补后，最终用于分析的各肾区室蛋白质鉴定数量为：全肾（455）、髓质（997）和皮质小管（896）。 图4 展示了OVE26糖尿病小鼠肾脏中的全蛋白质组变化。非标记定量（LFQ）分析可实现深度的蛋白质组覆盖，但与报告离子标记法（TMT、iTRAQ等）相比，会引入更高的数据集变异性。为克服LFQ变异性的一种策略是增加每种条件下分析的样本数量。本研究中，我们采用PEAKS搜索算法中的基于强度的定量方法，肽段和蛋白质鉴定水平的错误发现率（FDR）控制在1%以内，从而在每种条件下配对两只动物并包含技术重复的比较中，生成可靠的数据集。 图 4A 展示以log2倍数变化（log2FC）对未校正的p值（p-value）作图 < 0.05）。通常，在旨在验证稳健候选蛋白以进行正交后续实验时，p 值需针对多重比较进行校正。此处，为了展示目的，我们在火山图...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本技术方案中介绍的方法旨在阐述肾脏不同区域的比较蛋白质组学分析。我们采用方法分离了糖尿病（OVE26）和对照（FVB）小鼠的肾髓质和皮质小管，并进行了1维液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）及生物信息学分析，以揭示肾脏各部分以及全肾蛋白质组的基本差异。

分离肾脏结构需要仔细将皮质从髓质中解剖出来。首先对肾脏进行横向切片，可获得较薄的组织切片 切片将有助于更可靠地分离皮质。采用筛分法制备皮质小管时，肾小球可能通过70 µm筛网被滤除。每次洗涤步骤后，必须在显微镜下检查小管的纯度，以确保富集效果并避免小管组织的损失。在初始筛分步骤中避免过度挤压消化后的皮质，可减少最终小管制备物中的污染。

悬浮捕获方法在溶解和蛋白质提取步骤中具有较高的灵活性，且不会在质谱洗脱步骤中产生离子干扰。第2.10步中的关键因素是胰蛋白酶与肽浓度的比例（对于大多数应用，1:20 或 1:10 的比例较为理想）。有效的蛋白质酶解同时尽量减少非特异性切割，将获得更一致的结果。如果需要进行磷酸化肽的富集，在第2.4.1步烷基化后的酸化步骤可使用甲酸或三...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

致谢

本项目的工作部分得到了MTB（NIH K01DK080951）和TDC（NephCure-儿科肾脏病研究联盟NKI-2023-04）以及路易斯维尔大学肾脏疾病计划和蛋白质组学技术中心（TDC、MTB）的资金支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1A型胶原酶 Millipore SignalC9891
Exploris 480 Orbitrap Thermofisherhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/BRE725539MS
Falcon 细胞筛，100 µmVWR21008-950
Falcon 细胞筛，70 µmVWR21008-952
Gibco PBS pH 7.4 Thermo1001023
Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液VWRPI78440
碘乙酰胺Sigma AldrichI1149
MetaboAnalyst 6.0 MetaboAnalyst 6.0 https://www.metaboanalyst.ca/代谢组学数据分析平台
NanoDrop 2000 Thermofisherhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-2000
Oasis HLB 柱 Waters186002034
PEAKS 12.0Bioinformatics Solutions IncLC-MS/MS 数据分析软件
1.5 mL 微量离心管研磨杵Fisher ScientificNC0782485
悬浮液捕获装置（S-trap）ProtifiC02-micro-10
TCEPThermoFisher Scientific20490
TEABCSigma AldrichT7408
胰蛋白酶，质谱级ThermoFisher Scientific90057
超声波清洗器Cole-Parmer  Model 0884900

参考文献

  1. Ding, X., et al. Epidemiological patterns of chronic kidney disease attributed to type 2 diabetes from 1990-2019. Front Endocrinol. 15, 1383777(2024).
  2. Liu, W., et al. Global trends in the burden of chronic kidney disease attributable to type 2 diabetes: an age-period-cohort analysis. Diabetes Obes Metab. 26 (2), 602-610 (2024).
  3. Xie, D., et al. Global burden and influencing factors of chronic kidney disease due to type 2 diabetes in adults aged 20-59 years, 1990-2019. Sci Rep. 13 (1), 20234(2023).
  4. Giunti, S., Barit, D., Cooper, M. E. Mechanisms of diabetic nephropathy: role of hypertension. Hypertension. 48 (4), 519-526 (2006).
  5. Thomas, M. C., Burns, W. C., Cooper, M. E. Tubular changes in early diabetic nephropathy. Adv Chronic Kidney Dis. 12 (2), 177-186 (2005).
  6. Thomas, M. C., et al. Diabetic kidney disease. Nat Rev Dis Primers. 1, 15018(2015).
  7. Nath, K. A. Tubulointerstitial changes as a major determinant in the progression of renal damage. Am J Kidney Dis. 20 (1), 1-17 (1992).
  8. Bonventre, J. V. Can we target tubular damage to prevent renal function decline in diabetes. Semin Nephrol. 32 (5), 452-462 (2012).
  9. Powell, D. W., et al. Renal tubulointerstitial fibrosis in OVE26 type 1 diabetic mice. Nephron Exp Nephrol. 111 (1), e11-e19 (2008).
  10. Cummins, T. D., et al. Quantitative mass spectrometry of diabetic kidney tubules identifies GRAP as a novel regulator of TGF-beta signaling. Biochim Biophys Acta. (4), 653-661 (2010).
  11. Barati, M. T., et al. Differential expression of endoplasmic reticulumstress-response proteins in different renal tubule subtypes of OVE26 diabetic mice. Cell Stress Chaperones. 21 (1), 155-166 (2016).
  12. Zheleznova, N. N., et al. Mitochondrial proteomic analysis reveals deficiencies in oxygen utilization in medullary thick ascending limb of Henle in the Dahl salt-sensitive rat. Physiol Genomics. 44 (17), 829-842 (2012).
  13. Nordquist, L., Palm, F. Diabetes-induced alterations in renal medullary microcirculation and metabolism. Curr Diabetes Rev. 3 (1), 53-65 (2007).
  14. dos Santos, E. A., Li, L. -P., Ji, L., Prasad, P. V. Early changes with diabetes in renal medullary hemodynamics as evaluated by fiberoptic probes and BOLD magnetic resonance imaging. Invest Radiol. 42 (3), 157-162 (2007).
  15. Cummins, T. D., et al. Quantitative Mass Spectrometry Normalization in UrineBiomarker Analysis in Nephrotic Syndrome. Glomerular Dis. (3), 121-131 (2022).
  16. Carlson, E. C., Audette, J. L., Klevay, L. M., Nguyen, H., Epstein, P. N. Ultrastructural and functional analyses of nephropathy in calmodulin-induced diabetic transgenic mice. Anat Rec. 247 (1), 9-19 (1997).
  17. Zheng, S., et al. Development of late-stage diabetic nephropathy in OVE26 diabetic mice. Diabetes. 53 (12), 3248-3257 (2004).
  18. Wang, F., Veth, T., Kuipers, M., Altelaar, M., Stecker, K. E. Optimized suspension trapping method for phosphoproteomics sample preparation. Anal Chem. 95 (25), 9471-9479 (2023).
  19. Mather, A., Pollock, C. Glucose handling by the kidney. Kidney Int Suppl. 120, S1-S6 (2011).
  20. Ross, B. D., Espinal, J., Silva, P. Glucose metabolism in renal tubular function. Kidney Int. 29 (1), 54-67 (1986).
  21. Roger, F., Martin, P. Y., Rousselot, M., Favre, H., Féraille, E. Cell shrinkage triggers the activation of mitogen-activated protein kinases by hypertonicity in the rat kidney medullary thick ascending limb of the Henle's loop: requirement of p38 kinase for the regulatory volume increase response. J Biol Chem. 274 (48), 34103-34110 (1999).
  22. Yang, J., Lane, P. H., Pollock, J. S., Carmines, P. K. PKC-dependent superoxide production by the renal medullary thick ascending limb from diabetic rats. Am J Physiol Renal Physiol. 297 (5), F1220-F1228 (2009).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

肾脏蛋白质组学糖尿病肾损伤皮质肾小管分离髓质蛋白质组学质谱分析无标记定量蛋白质组学小鼠肾脏分区单细胞蛋白质组学蛋白质鉴定火山图分析
小鼠糖尿病肾损伤发病机制中全肾、髓质及皮质肾小管的比较蛋白质组学分析
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。