小鼠糖尿病肾损伤发病机制中全肾、髓质及皮质肾小管的比较蛋白质组学分析

摘要

本文介绍了一种针对全肾、分离的皮质小管以及髓质蛋白质组进行蛋白质组学分析的详细方案。该研究还比较了糖尿病小鼠模型与非糖尿病小鼠的区域蛋白质组差异。

摘要

明确肾脏疾病中事件发生的顺序是肾病学临床实践的核心。组织蛋白质组学分析是理解肾脏病理生理学基本生理和分子过程的重要方法。本文所介绍的方法和方案将有助于对与疾病后遗症相关的各个特定区域进行肾脏的分子解剖。为了确定疾病对具有独特功能的特定肾脏区域和结构的影响，本方案的目标是联合展示简化的 小鼠肾脏分区技术以及肾皮质小管分离技术，并结合简化的无标记定量蛋白质组学工作流程。整合这些方法将有助于识别整个肾脏、髓质区室以及皮质小管结构中异常的分子模式，最终实现病理条件下单细胞蛋白质组学的目标。在几乎任何疾病模型中应用这些方法，都将有助于阐明与肾功能障碍相关的病理机制。

引言

慢性肾脏病（CKD）是现代医学中的一个重大问题，仅在美国，其医疗支出就超过860亿美元¹。在全球范围内，随着糖尿病及其相关肾脏合并症的流行，CKD的发病率正在上升。接近14%的美国人口患有CKD （USRDS 2024年度报告）。此外，糖尿病肾病是CKD的一种形式，也是终末期肾病（ESRD）的主要原因，约60%的ESRD患者患有糖尿病^1,2,3。糖尿病会影响肾脏功能单位——肾单位的所有结构和细胞类型。如图1所示，肾单位的不同部分位于肾脏的皮质和髓质区域。肾脏的大部分由肾小管组成。肾小管功能障碍和结构病变在糖尿病肾病（DN）的发生发展中起着重要作用，这些改变与肾功能下降速率密切相关^4,5,6,7,8。在糖尿病早期，由于各段肾小管对葡萄糖增加以及伴随的钠离子摄取和膜转运蛋白需求上升作出反应，肾小管会发生肥大。随着....

方案

OVE26 和 FVB 小鼠的相关研究已获得路易斯维尔大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）指南的批准。转基因雌性 OVE26（糖尿病型；品系编号：005564）和 FVB（非糖尿病型；背景品系；品系编号：001800）小鼠购自杰克逊实验室（缅因州巴港）。动物饲养于 12 小时光照/12 小时黑暗循环、25 °C 环境中，并可自由获取水和食物。所有研究均使用 2 月龄小鼠进行。

1. 动物模型

1. 肾脏分离
   1. 通过腹腔注射给予小鼠80 mg/kg氯胺酮和12 mg/kg赛拉嗪以进行麻醉。
   2. 使用小型手术剪在腹部正中做切口，用棉签轻轻将小鼠的肠管移至一侧，以暴露下腔静脉。
   3. 在右肾上方的下腔静脉处做一个小切口。
   4. 通过左心室向小鼠灌注 20 mL 冷磷酸盐缓冲盐水（PBS：pH 7.4；210 mg/L KH₂PO₄，9 g/L NaCl，726 mg/L Na₂HPO_4·7H₂O）使用蠕动泵，以10 mL/min的流速进行。
      注意：如果在后续分析中肾脏中血液蛋白和细胞的残留并非关键因素，则此步骤并非必需。
   5. 使用小型手术剪取肾脏。去除肾脏外部多余的脂肪组织。称量肾脏重量，并将其置于冰上预冷的磷酸....

结果

总体而言，每种样本类型的总蛋白质鉴定数量分别为：1）全肾（1438）、2）髓质（2145）和皮质小管（1859）。经 MetaboAnalyst 6.0 数据处理、数据过滤和缺失值填补后，最终用于分析的各肾区室蛋白质鉴定数量为：全肾（455）、髓质（997）和皮质小管（896）。 图4 展示了OVE26糖尿病小鼠肾脏中的全蛋白质组变化。非标记定量（LFQ）分析可实现深度的蛋白质组覆盖，但与报告离子标记法（TMT、iTRAQ等）相比，会引入更高的数据集变异性。为克服LFQ变异性的一种策略是增加每种条件下分析的样本数量。本研究中，我们采用PEAKS搜索算法中的基于强度的定量方法，肽段和蛋白质鉴定水平的错误发现率（FDR）控制在1%以内，从而在每种条件下配对两只动物并包含技术重复的比较中，生成可靠的数据集。 图 4A 展示以log2倍数变化（log2FC）对未校正的p值（p-value）作图 < 0.05）。通常，在旨在验证稳健候选蛋白以进行正交后续实验时，p 值需针对多重比较进行校正。此处，为了展示目的，我们在火山图.......

讨论

本技术方案中介绍的方法旨在阐述肾脏不同区域的比较蛋白质组学分析。我们采用方法分离了糖尿病（OVE26）和对照（FVB）小鼠的肾髓质和皮质小管，并进行了1维液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）及生物信息学分析，以揭示肾脏各部分以及全肾蛋白质组的基本差异。

分离肾脏结构需要仔细将皮质从髓质中解剖出来。首先对肾脏进行横向切片，可获得较薄的组织切片 切片将有助于更可靠地分离皮质。采用筛分法制备皮质小管时，肾小球可能通过70 µm筛网被滤除。每次洗涤步骤后，必须在显微镜下检查小管的纯度，以确保富集效果并避免小管组织的损失。在初始筛分步骤中避免过度挤压消化后的皮质，可减少最终小管制备物中的污染。

悬浮捕获方法在溶解和蛋白质提取步骤中具有较高的灵活性，且不会在质谱洗脱步骤中产生离子干扰。第2.10步中的关键因素是胰蛋白酶与肽浓度的比例（对于大多数应用，1:20 或 1:10 的比例较为理想）。有效的蛋白质酶解同时尽量减少非特异性切割，将获得更一致的结果。如果需要进行磷酸化肽的富集，在第2.4.1步烷基化后的酸化步骤可使用甲酸或三.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1A型胶原酶	Millipore Signal	C9891
Exploris 480 Orbitrap	Thermofisher	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/BRE725539	MS
Falcon 细胞筛，100 µm	VWR	21008-950
Falcon 细胞筛，70 µm	VWR	21008-952
Gibco PBS pH 7.4	Thermo	1001023
Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液	VWR	PI78440
碘乙酰胺	Sigma Aldrich	I1149
MetaboAnalyst 6.0	MetaboAnalyst 6.0	https://www.metaboanalyst.ca/	代谢组学数据分析平台
NanoDrop 2000	Thermofisher	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-2000
Oasis HLB 柱	Waters	186002034
PEAKS 12.0	Bioinformatics Solutions Inc		LC-MS/MS 数据分析软件
1.5 mL 微量离心管研磨杵	Fisher Scientific	NC0782485
悬浮液捕获装置（S-trap）	Protifi	C02-micro-10
TCEP	ThermoFisher Scientific	20490
TEABC	Sigma Aldrich	T7408
胰蛋白酶，质谱级	ThermoFisher Scientific	90057
超声波清洗器	Cole-Parmer	Model 0884900