方法文章

使用骨内注射壳聚糖纳米颗粒包封的腺嘌呤碱基编辑器质粒增强基因递送和表达

DOI：

10.3791/68181

⸱

2025年5月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Anhui University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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在这里，我们提出了一种基因治疗方法，该方法通过骨内注射将 ABE 包被的壳聚糖直接输送到骨髓。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

将外源质粒递送到实验动物体内在生物医学研究中至关重要，包括基因功能的研究、疾病机制的阐明和药物疗效的评估。但是，目前方法的转染效率相对较低，引入用于长期基因表达的质粒可能会受到免疫系统的影响。为了解决这些限制，我们开发并研究了一种利用壳聚糖包埋腺嘌呤碱基编辑器 （ABE） 质粒，然后通过骨内注射将复合物直接递送到小鼠骨髓的新方法。在这项研究中，为了靶向与破骨细胞分化密切相关的 CaMK II δ 基因，我们利用壳聚糖封装 ABE CaMK II δ 质粒。我们通过骨内注射将质粒货物直接注射到骨髓腔中。结果显示，受体小鼠 A1 位点的 体内 编辑效率高达 14.27%，A2 位点的编辑效率高达 10.69%。这种新策略不仅适用于破骨细胞功能异常引起的疾病，而且在推进基因治疗领域具有巨大潜力。

引言

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基因治疗已成为生物医学研究领域的一种有前途的方法 1,2。它通过在实验动物中引入外源质粒来调节特定基因的表达并研究其治疗效果，从而提供了治疗各种疾病的潜力。然而，传统的给药方法遇到了一些问题，限制了其有效性和安全性3。问题包括转染效率低、生物损伤高和基因表达效率低。因此，有必要建立一种可以克服这些限制的新型基因治疗递送方法。

壳聚糖是一种天然多糖，具有良好的生物降解性和生物相容性 4,5,6，使其在动物体内易于降解，而不会引起严重的生物毒性。由于其高药物包埋率 7,8、提高递送效率和减少对动物的伤害，它已被广泛用于药物递送。

ABE 基因编辑技术允许将 A-T 直接碱基对转化为 G-C，在遗传和医学研究中前景广阔。与目前主流的基因编辑技术相比，AB....

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方案

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所有描述的动物实验均已获得安徽大学动物卫生委员会关于动物使用和护理的批准。在这项研究中，ABE 由天驰教授（上海科技大学，中国上海; 图 1D）。

1. ABE 质粒构建

  1. 使用序列 TCCATGATGCACAGACAGGA 设计 gRNA，其中 PAM 由 GAC 表示。
  2. 根据公司的引物列表指南，将引物添加到相应体积的 ddH2O 中，以达到 100 μM 的浓度。然后，充分摇晃和混合以确保均匀分布。对于退火反应，通过将 10 μL 储备引物溶液添加到新的微量离心管中，制备 10 μM 溶液、90 μL ddH2O，并充分混合。
  3. 在微量离心管中加入 5 μL 上游引物、5 μL 下游引物和 40 μL ddH2O。为了促进退火反应，将试管浸入装满沸水的容器中 5 分钟。确保水位未达到管口，以防止水进入并污染底漆。冷却至室温以完成退火反应。
  4. 将 2 μg pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP（图 1D）、1 μL ESP3I、4 μL 缓冲液和 33 μL ddH2O 加入微量离心管中，....

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结果

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通过骨内注射将体外质粒注射到小鼠体内 （图 1A）。纳米颗粒的平均粒径约为 202.9 nm，电位为 2.77 mV，PDI 为 0.22（图 1B）。图 1C 显示了通过电子显微镜观察到的球形纳米颗粒的表面形状。图 1D 显示了 ABE 载体的质粒图谱和 gRNA 载体的质粒图谱。

在荧光显微镜下观察质粒转导。 图 2A 显示了正常的骨髓细胞。质粒转移到小鼠体内 7 天后，在荧光显微镜下观察小鼠的骨髓细胞。与对照组相比，壳聚糖转染组的转染效率显著提高 （图 2B）。这表明壳聚.......

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讨论

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对于生物医学研究，向动物递送外源质粒的挑战包括提高递送和基因表达的效率，同时最大限度地减少对动物的伤害以达到所需的治疗效果15,16。我们提出了一种将壳聚糖介导的 ABE 质粒骨内注射到受体小鼠骨髓细胞中的新方法。该策略提高了质粒递送效率和基因表达。

首先，在这项研究中，壳聚糖作为非病毒载体系统被用作质粒递送的方法。由于已经证明常规方法的转染效率相对较低，因此引入用于长期基因表达的质粒可能会受到免疫系统的影响17,18。壳聚糖是一种天然多糖，以其优异的生物相容性、质粒包封能力和低毒性而闻名。使用壳聚糖作为递送载体有助于防止外源质粒长期表达过程中潜在的免疫相关作用，同时还可以提高质粒转移效率 19,20,21。

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披露

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作者声明没有利益冲突。

致谢

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这项工作由安徽省自然科学基金 （2208085MC74， 2208085MC51） 和中国安徽省教育厅科学研究基金 （KJ2021A0055） 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 ml PCR 管，平盖实验室选择 PT-02-C
1 mL 注射器安徽江南医疗器械有限公司/
1% 戊巴比妥钠//
1.5 ml 微量离心管实验室选择MCT-001-150型
10 次;DNA 上样缓冲液瓦济姆第 022-01 页
10X T4 DNA 连接酶缓冲液 1 ml塔卡拉生物科技（大连）有限公司2011年A
1250 亩;l 移液器吸头 102.1mm实验室选择电话-001-1250
200亩;l 移液器吸头 50.55mm实验室选择 型号：T-001-200
2x Phanta Max 缓冲区a瓦济姆P505-d1型
4 ?离心机赛默飞世尔75002425
50 毫升离心管实验室选择型号：T-012-50
6 孔细胞培养板实验室选择11110
琼脂山工生物A505255-0250
放大 器阿比奥韦尔/
脱乙酰壳多糖山工生物A600614-0500
恒温培养摇床上海志诚分析仪器制造有限公司ZWY-200D
Countess 自动细胞计数仪赛默飞世尔科技伯爵夫人二世/二世佛罗里达
Countess 细胞计数室载玻片和支架，一次性赛默飞世尔科技C10228
CutSmart 缓冲液新英格兰生物实验室B7204SVIAL
DH5&α;通用生物系统CS01010
DMEM的吉布科C11995500BT
dNTP 混合瓦济姆P505-d1型
Esp3I酶NEBiolabs 公司R0734S型
乙二胺四乙酸VETEC（西格玛-奥尔德里奇）V900106
胎牛血清欧瑞赛尔FBSAD-01011-500
流式细胞仪BD FACS卡利伯342975
流量管碧昂泰克生物技术FFC005-1袋
荧光显微镜徕卡427019
Gel Maxi 纯化试剂盒天根DP210型
基因组 DNA 提取试剂盒天根DP304
冰醋酸中国医药集团公司10000218
GoldBand DL2,000 DNA 标记叶森10501ES60型
制冰机上海郑桥BNS-30型实验室预约
ImunoSep 缓冲液精密生物医药有限公司604050
Megafuge 8 小型台式离心机系列赛默飞世尔科技75004250
MEM的生命科技11140050
纳米滴 2000 Thermo Fisher Scientific，美国
钠西加姆S5881-500G
公共广播公司西基因XG3650型
PCMV-SPRY-ABE8E 载体//
PCR扩增装置赛默飞世尔AKC96300441
青霉素/链霉素 索拉生物第1400页
蛋白胨山工生物A505247-0500
Phanta Max 超保真 DNA 聚合酶瓦济姆P505-d1型
红细胞裂解物碧奥泰姆C3702型
氯化钠中国医药集团公司10019318
硫酸钠阿拉丁S433911
T-001-10 10亩;l 移液器吸头 31.65mm实验室选择 型号：T-001-10
T4 DNA 连接酶塔卡拉生物科技（大连）有限公司2011年A
特里斯生物弗罗克斯1115公斤001
胰蛋白胨山工生物A505250-0500
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&β;-巯基乙醇 西格马444203

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ikawa, Y., et al. Gene therapy of hemoglobinopathies: Progress and future challenges. Hum Mol Genet. 28 (R1), R24-R30 (2019).
  2. Ginn, S. L., Mandwie, M., Alexander, I. E., Edelstein, M., Abedi, M. R. Gene therapy clinical trials worldwide to 2023-an update. J Gene Med.

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