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方法文章

使用壳聚糖纳米颗粒包裹的腺嘌呤碱基编辑器质粒进行骨内注射以增强基因递送与表达

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⸱

DOI：

10.3791/68181

⸱

2025年5月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Anhui University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种基因治疗策略，通过骨内注射将ABE包被的壳聚糖直接递送至骨髓。

摘要

将外源质粒递送至实验动物在生物医学研究中至关重要，包括基因功能研究、疾病机制阐明以及药物疗效评估。然而，现有方法的转染效率相对较低，且质粒介导的长期基因表达可能受到免疫系统的影响。为克服这些局限，我们开发并研究了一种新方法，利用壳聚糖包裹腺嘌呤碱基编辑器（ABE）质粒，并通过骨内注射将该复合物直接递送至小鼠骨髓。在本研究中，为靶向 CaMK II δ 基因，该基因与破骨细胞分化密切相关，我们利用壳聚糖包裹ABE CaMK II δ 质粒。我们通过骨内注射将质粒载体直接注入骨髓腔。结果显示，具有较高的 体内 在受体小鼠中，A1位点的编辑效率为14.27%，A2位点的编辑效率为10.69%。该新型策略不仅特别适用于由破骨细胞功能异常引起的疾病，而且在推动基因治疗领域发展方面具有重要意义。

引言

基因治疗已成为生物医学研究领域中一种颇具前景的方法1,2。该方法通过在实验动物体内导入外源质粒，调控特定基因的表达并研究其治疗效果，从而有望治疗多种疾病。然而，传统的递送方法存在一些问题，限制了其有效性和安全性3。这些问题包括转染效率低、生物损伤大以及基因表达效率不高等。因此，亟需建立一种新型的基因治疗递送方法，以克服上述局限性。

壳聚糖是一种天然多糖，具有良好的生物降解性和生物相容性4,5,6，可在动物体内易于降解，不会引起严重的生物毒性。由于其高药物包埋率7,8、增强的递送效率以及对动物损伤较小，壳聚糖已被广泛应用于药物递送领域。

ABE基因编辑技术能够直接将A-T碱基对转换为G-C，因而在遗传学和医学研究中具有广阔前景。与当前主流的基因编辑技术相比，ABE技术可实现精确的单碱基突变，从而减少对非靶标DNA序列的编辑，降低脱靶效应9,10，并实现零DNA双链断裂11，显著降低了基因编辑的风险12。此外，ABE技术具有较高的生物相容性，更适用于疾病治疗研究。

尾静脉注射是一种常用于体内递送质粒的方法，尤其适用于基因治疗。本研究的目标基因为CaMK II δ，该基因与破骨细胞分化密切相关13,14。采用骨内注射替代尾静脉注射，可使修饰后的质粒直接进入骨髓中的破骨细胞。这种向骨髓的直接递送可提高基因表达的效率和稳定性，有利于治疗与破骨细胞功能障碍相关的疾病。

本文介绍一种新方法，即将ABE质粒包裹在壳聚糖中，随后通过骨内注射直接导入小鼠体内。通过该方法，我们希望为外源质粒进入生物体后的更有效基因治疗，特别是与破骨细胞功能障碍相关疾病的治疗，提供新的途径。

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方案

本研究所描述的所有动物实验均经安徽大学动物健康委员会关于动物使用与护理的批准。在本研究中，ABE由田驰教授（上海科技大学，中国上海；图1D）慷慨提供。

1. ABE 质粒构建

  1. 设计gRNA序列TCCATGATGCACAGACAGGA，其中PAM序列为GAC。
  2. 根据公司提供的引物列表指南，将引物加入相应体积的ddH2O中，使其终浓度为100 µM。然后充分振荡混匀，确保分布均匀。对于退火反应，取10 µL储备引物溶液加入新的微量离心管中，再加入90 µL ddH2O，混匀，配制成10 µM的溶液。
  3. 在微量离心管中加入5 µL上游引物、5 µL下游引物和40 µL ddH2O。为促进退火反应，将该管浸入盛有沸水的容器中5分钟。确保水面不超过管口，以防进水污染引物。随后冷却至室温，完成退火反应。
  4. 在微量离心管中加入2 µg pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP（图1D）、1 µL ESP3I、4 µL缓冲液和33 µL ddH2O，并在37 °C恒温水浴中反应45分钟。
  5. 进行琼脂糖凝胶电泳。称取0.5 g琼脂糖，放入玻璃瓶中，加入50 mL 1x TAE缓冲液，振荡溶解琼脂糖粉末。微波炉加热2分钟至完全融化。加入5 µL YeaRed核酸凝胶染料，充分混匀后倒入凝胶模具；待凝胶凝固后，开始加样。
    注：1xTAE的配制请使用表1中列出的试剂。
  6. 向电泳槽中加入1x TAE缓冲液，并放入已配制的琼脂糖凝胶块，确保凝胶完全浸没于TAE中。向步骤1.4的酶切产物中加入5 µL 1x上样缓冲液，混匀后上样至凝胶孔中。同时，加入6 µL DNA Marker。
  7. 以110 V恒定电压进行电泳，运行35分钟。电泳结束后，根据Marker确定样品条带位置，用洁净刀片切下相应凝胶条带用于凝胶回收。
  8. 按照凝胶大提纯化试剂盒说明书进行凝胶回收操作。将水浴设置为50 °C。根据试剂盒说明，向含有切下凝胶的离心管中加入相应体积的PN溶液。用移液枪头戳动凝胶以促进溶解，然后放入水浴中。每隔一段时间轻轻振荡管子，观察溶解过程，直至凝胶完全溶解。
  9. 从试剂盒中取出一个离心柱CA3。向其中加入500 µL试剂盒提供的BL溶液，2,000 x g离心1分钟，以平衡柱子。离心后弃去收集管底部废液，将吸附柱重新放回收集管中。
  10. 继续以2,000 x g离心1分钟。弃去离心管底部废液，加入600 µL PN溶液，2,000 x g离心30秒，再次弃去废液。重复此操作一次，并再次弃去废液。
  11. 离心结束后，将2 mL收集管更换为新的1.5 mL离心管。打开管盖，在通风处干燥30分钟，彻底去除乙醇。然后加入预热的40 µL ddH2O，离心后洗脱所需DNA。
    注：PN溶液需按说明书加入无水乙醇。使用预热的水可提高得率。
  12. 在微量离心管中加入步骤1.3的退火产物7 µL、步骤1.11的凝胶回收产物3 µL、T4 DNA连接酶1 µL、10x T4连接酶缓冲液2 µL和ddH2O 7 µL，于16 °C过夜孵育，获得连接产物。
  13. 在冰上将10 µL连接产物与70 µL DH5α混合30分钟。将水浴设置为42 °C。冰浴结束后，将离心管放入水浴中90秒，再放回冰上2分钟。
  14. 向离心管中加入600 µL LB液体培养基，在摇床上振荡培养30分钟。同时，在超净工作台内对LB固体培养基平板进行30分钟照射灭菌。培养结束后，将100 µL菌液均匀涂布于平板上。涂布完成后，将平板倒置于37 °C细菌培养箱中培养。
    注：DH5α通常保存于-80 °C。LB固体培养基的配制请使用表2中列出的试剂。LB液体培养基的配制请使用表3中列出的试剂。
  15. 挑选单菌落，在新鲜平板上扩大培养14小时。取一个50 mL离心管，加入50 mL LB液体培养基，按1:1000比例加入50 µL氨苄青霉素，混匀后分装至新离心管中，每管15 mL。
  16. 观察培养平板，选择生长良好、圆形白色的菌落，用10 µL移液器挑取并转移至LB培养基中。在摇床上培养12小时后，送样进行测序。
  17. 将测序结果与目标gRNA序列比对，筛选出序列匹配的菌株Camk II δ-sgRNA作为目标菌株，随后提取质粒。
  18. 按照质粒小提试剂盒说明书进行质粒提取。向吸附柱CP3中加入500 µL BL溶液，2,000 x g离心1分钟，弃去废液，将吸附柱放回收集管中。加入500 µL菌液，4,000 x g离心10分钟。
  19. 收集穿流液。再次离心，弃去上清液后，向含有菌体沉淀的离心管中加入250 µL P1溶液，转移至微量离心管中并涡旋混匀。加入250 µL P2溶液，轻柔颠倒6–8次。加入350 µL P3溶液，再次轻柔颠倒6–8次，此时可见白色絮状沉淀。
  20. 2,000 x g离心10分钟。将上清液转移至新的吸附柱CP3中，2,000 x g离心30秒，弃去废液。加入600 µL PW溶液，再次2,000 x g离心30秒，弃去废液。再次加入600 µL PW溶液，2,000 x g离心30秒，弃去废液。
  21. 将吸附柱放回收集管中，2,000 x g离心2分钟以去除残留的PW溶液。然后将吸附柱转移至洁净的微量离心管中，室温干燥30分钟，向吸附膜中央加入35 µL预热的ddH2O，所得产物于-20 °C保存，用于后续实验。
    注：PW溶液需按说明书加入无水乙醇。使用预热的水可提高得率。

2. 骨髓细胞提取

  1. 选取8-9周龄的KM小鼠（也可使用非KM品系的小鼠），雄性，体重约30 g。用左手固定小鼠，头部朝下，右手持注射器从腹部侧面注入150 µL 1%戊巴比妥钠溶液。通过夹趾反应确认麻醉效果。
    注意：请遵循所在机构关于麻醉方案的本地指导原则。
  2. 对小鼠实施颈椎脱臼处死，使用手术剪和镊子取出胫骨，并剥离周围多余的肌肉组织。将取出的胫骨浸泡于PBS中清洗，仅保留干净的骨骼。
  3. 用注射器吸取1 mL PBS，从胫骨一端冲洗骨髓细胞，直至骨骼呈白色。
  4. 收集细胞悬液，在4 °C条件下以800 × g离心5 min。弃去上清后，加入500 µL红细胞裂解液裂解红细胞。1 min后，加入1 mL分离缓冲液终止裂解反应。再次在4 °C条件下以800 × g离心5 min，弃去上清，将细胞置于冰上备用。
    注意：若红细胞已完全裂解，则细胞沉淀后无红色残留。若仍可见红色细胞，可再次进行裂解，但孵育时间不宜过长，以免损伤其他细胞。

3. 壳聚糖转染

  1. 壳聚糖制备：称取 4 mg 壳聚糖，溶于 20 mL 浓度为 0.2 mg/mL 的乙酸溶液中，用 10 M NaOH 调节 pH 至 5.5。取 500 µL 该溶液，分别加入各个微量离心管中。
  2. 向各管中分别加入 2 µg、3 µg、4 µg 和 5 µg 的 ABE 质粒，并将其溶于 500 µL 浓度为 30 mM 的 Na2SO4 溶液中。将 500 µL 壳聚糖溶液与 500 µL 质粒溶液混合。
  3. 将混合物置于 50–55 °C 水浴中孵育 15 分钟。充分混合两种溶液后，涡旋振荡 15–30 秒，静置 30 分钟。
  4. 壳聚糖表征：采用动态光散射法（DLS）分析壳聚糖的粒径和泽塔电位，壳聚糖浓度在 ddH2O 中保持为 0.1 mg/mL。每一样品检测 3 次。
  5. 将 0.1 mg/mL 的样品滴加至硅片上。取 20 µL 重悬样品加入 200 目铜网，室温孵育 10 分钟。用 2% 磷钨酸染色 3 分钟，滤纸吸去多余液体，透射电子显微镜下观察。
  6. 纳米颗粒包封效率：用 0.1 µm 滤膜过滤上清液，去除未沉淀的颗粒。收集质粒并用分光光度计在 260 nm 处测定浓度。ABE 质粒和 gRNA 质粒的包封效率分别为 84% ± 0.37% 和 85% ± 0.53%。
  7. 将 100 µL 载有质粒的壳聚糖溶液通过骨髓腔注射入小鼠体内（步骤 5）。注射 7 天后，分离骨髓细胞，并按步骤 2 所述裂解红细胞。
  8. 向 6 孔细胞培养板中加入 2 mL 含血清的 DMEM 培养基，再加入悬浮于 500 µL 含血清 DMEM 培养基中的骨髓细胞（约 1 × 106 个）。在荧光显微镜下检测荧光强度。CaMK II δ-sgRNA 质粒在 580 nm 激发光下呈现 TagRFP 红色荧光（图 2B）。
    注意：含血清的 DMEM 培养基使用 表 4 所列试剂配制。

4. 流式细胞术

  1. 制备不同剂量的ABE质粒：2 µg、3 µg、4 µg 和 5 µg，并按照步骤3所述递送至受体小鼠。7天后，按照步骤3所述从小鼠中分离骨髓细胞。
  2. 收集骨髓细胞，在4 °C条件下以800 × g 离心5分钟。弃去上清液，加入500 µL红细胞裂解液裂解红细胞。1分钟后，加入1 mL分离缓冲液终止反应，并使用细胞计数仪对细胞数量进行计数。
  3. 将1 × 106 个细胞转移至新的微量离心管中，在4 °C条件下以800 × g 离心5分钟。弃去上清液后，用500 µL PBS重悬细胞，并转移至流式管中。通过流式细胞术检测转染效率。按照步骤2所述制备流式细胞术对照组。
    注意：在FSC与SSC散点图中，FSC信号较低且位于左下角（小于400）的细胞碎片和死亡细胞被排除（图3）。由于质粒带有TagRFP红色荧光，因此可被分选出来。

5. 骨髓腔注射

  1. 选取8至9周龄、体重约30 g的KM雄性小鼠。通过腹腔注射150 µL 1%戊巴比妥钠进行麻醉（步骤2.1）。 麻醉后，在动物眼睛上涂抹无菌眼用润滑剂，以防止角膜干燥和溃疡。通过夹捏脚趾确认麻醉深度。
    注意：请遵循当地机构关于合适麻醉方案的指导原则。
  2. 将麻醉后的小鼠仰卧位固定于手术台上，并用胶带固定小鼠前肢。
  3. 用酒精棉片对小鼠后侧胫骨进行消毒。将待注射的无菌质粒溶液吸入带有26G针头的1 mL注射器中。排除气泡，准备注射。
  4. 触摸小鼠胫骨并用手指固定。确定注射针的位置，使针头从膝关节处的胫骨平台刺入胫骨干。将注射针旋转至与胫骨平行，刺入骨髓腔，并缓慢（约3秒）注入100–200 µL 液体，以尽量减少对小鼠的损伤。
  5. 注射完成后，缓慢拔出针头（约3秒），并立即使用酒精棉片按压止血并消毒穿刺部位。
  6. 将小鼠笼置于加热垫上或（小心地）置于加热灯下，使环境温度维持在约37 °C。等待小鼠从麻醉中恢复，并观察其恢复情况。

6. Sanger 测序

  1. 注射后第7天，按照步骤2所述方法收集小鼠骨髓细胞，并使用提取试剂盒分离基因组DNA。将细胞以2,000 × g 离心1分钟收集。弃去上清液，加入200 µL GA溶液，用涡旋振荡器振荡混匀。加入20 µL蛋白酶K和200 µL GB溶液，混匀后置于70 °C水浴中孵育10分钟。
  2. 孵育结束后，加入200 µL无水乙醇，振荡15秒，然后将混合液转移至配套的吸附柱中。以2,500 × g离心1分钟，弃去管底废液，加入500 µL GD溶液。再次离心并弃去废液，用PW溶液洗涤沉淀2次，最后将其干燥，并用40 µL纯水洗脱。
    注意：PW溶液应根据说明书加入无水乙醇。
  3. 采用PCR扩增目的基因 CaMKIIδ，上游引物序列为gctaaggtgataaatgtggcact，下游引物序列为ctagtgccgggccagattc。PCR反应体系配制如下：25 µL 2×缓冲液、1 µL dNTP混合物、2 µL上游引物、2 µL下游引物、1 µL DNA聚合酶、2 µL模板DNA以及17 µL ddH2O。运行以下PCR程序：95 °C预变性3分钟，随后进行95 °C变性15秒、53.7 °C退火30秒、72 °C延伸60秒，最后在12 °C保温。
  4. PCR完成后，制备1%琼脂糖凝胶，在110 V电压下电泳35分钟（步骤1.5，步骤1.6）。电泳结束后切下目标条带区域，送测Sanger测序（图4）。

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结果

体外质粒通过骨内注射注入小鼠体内(图1A)。纳米颗粒的平均粒径约为202.9 nm，电位为2.77 mV，PDI为0.22（图1B）。图1C显示了通过电子显微镜观察到的纳米颗粒表面形态，呈球形。图1D显示了ABE载体的质粒图谱和gRNA载体的质粒图谱。

在荧光显微镜下观察质粒转导情况。 图 2A 显示正常骨髓细胞。小鼠经质粒转染7天后，于荧光显微镜下观察其骨髓细胞。与对照组相比，壳聚糖转染组的转染效率显著提高 (图2B)这表明壳聚糖作为包埋材料可提高转导质粒的效率 体外

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讨论

在生物医学研究中，将外源质粒递送至动物体内的挑战在于提高递送效率和基因表达水平，同时最大限度地减少对动物的伤害，以实现预期的治疗效果15,16。本文提出一种新型的经骨注射方法，通过壳聚糖介导将ABE质粒递送至受体小鼠的骨髓细胞中。该策略可提高质粒递送效率和基因表达水平。

首先，在本研究中，壳聚糖作为一种非病毒载体系统，被用于质粒递送。由于已有研究表明，传统方法的转染效率相对较低，而质粒的导入可能受到免疫系统的影响，从而干扰长期基因表达17,18。壳聚糖是一种天然多糖，以其优异的生物相容性、质粒包封能力以及低毒性而著称。使用壳聚糖作为递送载体有助于在外源质粒长期表达过程中避免潜在的免疫相关效应，同时提高质粒的转染效率19,20...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本工作由安徽省自然科学基金（2208085MC74，2208085MC51）和中国安徽省教育厅科学研究基金（KJ2021A0055）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 ml PCR管，平盖LABSELECT PT-02-C
1 mL注射器Anhui Jiangnan medical equipment Co., LTD/
1% 戊巴比妥钠//
1.5 ml 微量离心管LABSELECTMCT-001-150
10 × DNA上样缓冲液VazymeP022-01
10X T4 DNA连接酶缓冲液 1 mlTaKaRa Biotechnology(Dalian)Co.,LTD2011A
1250 μl 移液器吸头 102.1mmLABSELECTT-001-1250
200 μl 移液器吸头 50.55mmLABSELECT T-001-200
2x Phanta Max BufferaVazymeP505-d1
4 ? 离心机Thermo Fisher75002425
50 ml 离心管LABSELECTT-012-50
6孔细胞培养板LABSELECT11110
琼脂Sangon BiotechA505255-0250
氨苄青霉素（Amp）Abiowell/
壳聚糖Sangon BiotechA600614-0500
恒温培养摇床上海智城分析仪器制造有限公司ZWY-200D
Countess 自动细胞计数仪Thermo Fisher ScientificCountess II/II FL
Countess 细胞计数室载玻片及支架，一次性使用Thermo Fisher ScientificC10228
CutSmart 缓冲液New England BiolabsB7204SVIAL
DH5αGeneral BiosystemsCS01010
DMEM培养基gibcoC11995500BT
dNTP混合物VazymeP505-d1
Esp3I酶NEBiolabsR0734S
乙二胺四乙酸VETEC (sigma-aldrich)V900106
胎牛血清OriCellFBSAD-01011-500
流式细胞仪BD FACSCalibur342975
流式管碧云天生物技术FFC005-1bag
荧光显微镜Leica427019
凝胶大提纯化试剂盒天根DP210
基因组DNA提取试剂盒天根DP304
冰醋酸中国医药集团有限公司10000218
GoldBand DL2,000 DNA MarkerYESEN10501ES60
制冰机shanghaizhengqiaoBNS-30实验室保留
ImunoSep 缓冲液普洛麦格生物科技有限公司604050
Megafuge 8 小型台式离心机系列Thermo Fisher Scientific75004250
MEM培养基Life Technology11140050
NanoDrop 2000 Thermo Fisher Scientific, USA
NaOHSIGAMS5881-500G
PBS缓冲液XiGeneXG3650
PCMV-SPRY-ABE8E 载体//
PCR扩增仪Thermo FisherAKC96300441
青霉素/链霉素 SolarbioP1400
蛋白胨Sangon BiotechA505247-0500
Phanta Max 超高保真DNA聚合酶VazymeP505-d1
红细胞裂解液碧云天C3702
氯化钠中国医药集团有限公司10019318
硫酸钠阿拉丁S433911
T-001-10 10μl 移液器吸头 31.65mmLABSELECT T-001-10
T4 DNA连接酶TaKaRa Biotechnology(Dalian)Co.,LTD2011A
TrisBioFroxx1115KG001
胰蛋白胨Sangon BiotechA505250-0500
涡旋混合器sigmaZ258423
水浴锅上海一恒DK-80
YeaRed 核酸凝胶染料YESEN10203ES76
酵母提取物BBIA610961-0500
Zetasizer NanoMalvern PanalyticalZetasizer Nano ZS
β-巯基乙醇 Sigma444203

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质粒转染骨髓细胞破骨细胞功能流式细胞术动态光散射基因编辑效率
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