在此，我们介绍一种基因治疗策略，通过骨内注射将ABE包被的壳聚糖直接递送至骨髓。
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方法文章
使用壳聚糖纳米颗粒包裹的腺嘌呤碱基编辑器质粒进行骨内注射以增强基因递送与表达
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
将外源质粒递送至实验动物在生物医学研究中至关重要，包括基因功能研究、疾病机制阐明以及药物疗效评估。然而，现有方法的转染效率相对较低，且质粒介导的长期基因表达可能受到免疫系统的影响。为克服这些局限，我们开发并研究了一种新方法，利用壳聚糖包裹腺嘌呤碱基编辑器（ABE）质粒，并通过骨内注射将该复合物直接递送至小鼠骨髓。在本研究中，为靶向 CaMK II δ 基因，该基因与破骨细胞分化密切相关，我们利用壳聚糖包裹ABE CaMK II δ 质粒。我们通过骨内注射将质粒载体直接注入骨髓腔。结果显示，具有较高的 体内 在受体小鼠中，A1位点的编辑效率为14.27%，A2位点的编辑效率为10.69%。该新型策略不仅特别适用于由破骨细胞功能异常引起的疾病，而且在推动基因治疗领域发展方面具有重要意义。
引言
基因治疗已成为生物医学研究领域中一种颇具前景的方法1,2。该方法通过在实验动物体内导入外源质粒，调控特定基因的表达并研究其治疗效果，从而有望治疗多种疾病。然而，传统的递送方法存在一些问题，限制了其有效性和安全性3。这些问题包括转染效率低、生物损伤大以及基因表达效率不高等。因此，亟需建立一种新型的基因治疗递送方法，以克服上述局限性。
壳聚糖是一种天然多糖，具有良好的生物降解性和生物相容性4,5,6，可在动物体内易于降解，不会引起严重的生物毒性。由于其高药物包埋率7,8、增强的递送效率以及对动物损伤较小，壳聚糖已被广泛应用于药物递送领域。
ABE基因编辑技术能够直接将A-T碱基对转换为G-C，因而在遗传学和医学研究中具有广阔前景。与当前主流的基因编辑技术相比，ABE技术可实现精确的单碱基突变，从而减少对非靶标DNA序列....
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方案
本研究所描述的所有动物实验均经安徽大学动物健康委员会关于动物使用与护理的批准。在本研究中，ABE由田驰教授（上海科技大学，中国上海；图1D）慷慨提供。
1. ABE 质粒构建
- 设计gRNA序列TCCATGATGCACAGACAGGA，其中PAM序列为GAC。
- 根据公司提供的引物列表指南，将引物加入相应体积的ddH2O中，使其终浓度为100 µM。然后充分振荡混匀，确保分布均匀。对于退火反应，取10 µL储备引物溶液加入新的微量离心管中，再加入90 µL ddH2O，混匀，配制成10 µM的溶液。
- 在微量离心管中加入5 µL上游引物、5 µL下游引物和40 µL ddH2O。为促进退火反应，将该管浸入盛有沸水的容器中5分钟。确保水面不超过管口，以防进水污染引物。随后冷却至室温，完成退火反应。
- 在微量离心管中加入2 µg pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP（图1D）、1 µL ESP3I、4 µL缓冲液和33 µL ddH2O，并在37 °C恒温水浴中反应45分钟。
- 进行琼脂糖凝胶电泳。称取0.5 g琼脂糖，放入玻璃瓶中，加入50 m....
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结果
体外质粒通过骨内注射注入小鼠体内(图1A)。纳米颗粒的平均粒径约为202.9 nm，电位为2.77 mV，PDI为0.22（图1B）。图1C显示了通过电子显微镜观察到的纳米颗粒表面形态，呈球形。图1D显示了ABE载体的质粒图谱和gRNA载体的质粒图谱。
在荧光显微镜下观察质粒转导情况。 图 2A 显示正常骨髓细胞。小鼠经质粒转染7天后，于荧光显微镜下观察其骨髓细胞。与对照组相比，壳聚糖转染组的转染效率显著提高 (图2B)这表明壳聚糖作为包埋材料可提高转导质粒的效率 体外
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讨论
在生物医学研究中，将外源质粒递送至动物体内的挑战在于提高递送效率和基因表达水平，同时最大限度地减少对动物的伤害，以实现预期的治疗效果15,16。本文提出一种新型的经骨注射方法，通过壳聚糖介导将ABE质粒递送至受体小鼠的骨髓细胞中。该策略可提高质粒递送效率和基因表达水平。
首先，在本研究中，壳聚糖作为一种非病毒载体系统，被用于质粒递送。由于已有研究表明，传统方法的转染效率相对较低，而质粒的导入可能受到免疫系统的影响，从而干扰长期基因表达17,18。壳聚糖是一种天然多糖，以其优异的生物相容性、质粒包封能力以及低毒性而著称。使用壳聚糖作为递送载体有助于在外源质粒长期表达过程中避免潜在的免疫相关效应，同时提高质粒的转染效率19,20.......
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
本工作由安徽省自然科学基金（2208085MC74，2208085MC51）和中国安徽省教育厅科学研究基金（KJ2021A0055）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2 ml PCR管，平盖 | LABSELECT | PT-02-C | |
| 1 mL注射器 | Anhui Jiangnan medical equipment Co., LTD | / | |
| 1% 戊巴比妥钠 | / | / | |
| 1.5 ml 微量离心管 | LABSELECT | MCT-001-150 | |
| 10 × DNA上样缓冲液 | Vazyme | P022-01 | |
| 10X T4 DNA连接酶缓冲液 1 ml | TaKaRa Biotechnology(Dalian)Co.,LTD | 2011A | |
| 1250 μl 移液器吸头 102.1mm | LABSELECT | T-001-1250 | |
| 200 μl 移液器吸头 50.55mm | LABSELECT | T-001-200 | |
| 2x Phanta Max Buffera | Vazyme | P505-d1 | |
| 4 ? 离心机 | Thermo Fisher | 75002425 | |
| 50 ml 离心管 | LABSELECT | T-012-50 | |
| 6孔细胞培养板 | LABSELECT | 11110 | |
| 琼脂 | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| 氨苄青霉素（Amp） | Abiowell | / | |
| 壳聚糖 | Sangon Biotech | A600614-0500 | |
| 恒温培养摇床 | 上海智城分析仪器制造有限公司 | ZWY-200D | |
| Countess 自动细胞计数仪 | Thermo Fisher Scientific | Countess II/II FL | |
| Countess 细胞计数室载玻片及支架，一次性使用 | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| CutSmart 缓冲液 | New England Biolabs | B7204SVIAL | |
| DH5α | General Biosystems | CS01010 | |
| DMEM培养基 | gibco | C11995500BT | |
| dNTP混合物 | Vazyme | P505-d1 | |
| Esp3I酶 | NEBiolabs | R0734S | |
| 乙二胺四乙酸 | VETEC (sigma-aldrich) | V900106 | |
| 胎牛血清 | OriCell | FBSAD-01011-500 | |
| 流式细胞仪 | BD FACSCalibur | 342975 | |
| 流式管 | 碧云天生物技术 | FFC005-1bag | |
| 荧光显微镜 | Leica | 427019 | |
| 凝胶大提纯化试剂盒 | 天根 | DP210 | |
| 基因组DNA提取试剂盒 | 天根 | DP304 | |
| 冰醋酸 | 中国医药集团有限公司 | 10000218 | |
| GoldBand DL2,000 DNA Marker | YESEN | 10501ES60 | |
| 制冰机 | shanghaizhengqiao | BNS-30 | 实验室保留 |
| ImunoSep 缓冲液 | 普洛麦格生物科技有限公司 | 604050 | |
| Megafuge 8 小型台式离心机系列 | Thermo Fisher Scientific | 75004250 | |
| MEM培养基 | Life Technology | 11140050 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| NaOH | SIGAM | S5881-500G | |
| PBS缓冲液 | XiGene | XG3650 | |
| PCMV-SPRY-ABE8E 载体 | / | / | |
| PCR扩增仪 | Thermo Fisher | AKC96300441 | |
| 青霉素/链霉素 | Solarbio | P1400 | |
| 蛋白胨 | Sangon Biotech | A505247-0500 | |
| Phanta Max 超高保真DNA聚合酶 | Vazyme | P505-d1 | |
| 红细胞裂解液 | 碧云天 | C3702 | |
| 氯化钠 | 中国医药集团有限公司 | 10019318 | |
| 硫酸钠 | 阿拉丁 | S433911 | |
| T-001-10 10μl 移液器吸头 31.65mm | LABSELECT | T-001-10 | |
| T4 DNA连接酶 | TaKaRa Biotechnology(Dalian)Co.,LTD | 2011A | |
| Tris | BioFroxx | 1115KG001 | |
| 胰蛋白胨 | Sangon Biotech | A505250-0500 | |
| 涡旋混合器 | sigma | Z258423 | |
| 水浴锅 | 上海一恒 | DK-80 | |
| YeaRed 核酸凝胶染料 | YESEN | 10203ES76 | |
| 酵母提取物 | BBI | A610961-0500 | |
| Zetasizer Nano | Malvern Panalytical | Zetasizer Nano ZS | |
| β-巯基乙醇 | Sigma | 444203 |
参考文献
- Ikawa, Y., et al. Gene therapy of hemoglobinopathies: Progress and future challenges. Hum Mol Genet. 28 (R1), R24-R30 (2019).
- Ginn, S. L., Mandwie, M., Alexander, I. E., Edelstein, M., Abedi, M. R. Gene therapy clinical trials worldwide to 2023-an update. J Gene Med.
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