方法文章

基于微流控技术的微管聚合力学研究方法的开发

1.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/68185

⸱

2025年5月30日

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 3Department of Biochemistry, Vanderbilt University

本文内容

摘要

本方案详细介绍了适用于研究微管聚合力学的微流控装置的设计与制备方法。通过结合微加工技术、自动流体控制和计算建模技术，构建了一个灵活的系统，特别适用于细胞骨架的力学特性探究。 体外.

摘要

在本方案中，我们描述了一种用于研究微管聚合物力学特性的微流控装置的设计与制备方法。该设计利用了基于聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane, PDMS）的微流控装置的固有优势，并引入了多项功能，以实现稳定且可定制的高通量实验方法。所开发的装置具备多重气泡捕获能力，可防止有害气泡的产生。此外，该装置可与自动化流体控制系统连接，减少人工干预，实现高通量分析。本研究采用商业仿真软件，以更深入地优化并理解该系统中的流体输运行为。最后，我们通过在装置的不同区域生长带有不同荧光标记的微管延伸结构，展示了在同一装置内同时进行多个实验的能力。总体而言，该微流控流动系统可用于探究微管聚合物的力学特性，并为更广泛的微管体外（in vitro）研究提供了实验设计上的改进。微细加工、自动化流控与计算建模方法的结合，构建了一个灵活的系统，非常适合用于体外（in vitro）研究细胞骨架的力学行为。

引言

微流控技术通过精心设计和制造流体通道，能够精确控制微量流体体积（通常小于一微升）1,2。微流控装置的小尺度引发了独特的工程现象。具体而言，雷诺数——表征流体流动中惯性力与粘性力之比的无量纲参数——在微流控中通常很小，一般为O(10)或更低，这凸显了粘性力在微流控装置中的主导作用。此外，佩克莱特数（Péclet number）用于比较对流输运与扩散输运，其数值表明在微流控中对流输运通常可忽略不计3,4,5。微流控中这种以扩散为主导的层流状态具有优势，因其可通过维持精确的流体浓度梯度，实现在单一装置上并行开展多个实验。

光刻技术仍是制造微流控器件的主要方法6,7,8。简而言之，该过程包括创建微流控设计的蚀刻模板“母版”（图1）。首先制备一种光敏基底，并使用微流控设计的光掩模选择性地将光刻胶区域暴露于紫外辐射下。随后通过蚀刻工艺处理基底，形成设计的浮雕结构。聚二甲基硅氧烷（PDMS）通常被浇铸并固化在母版上。固化后的PDMS复制了设计的负形结构，随后从母版上剥离，并键合到玻璃盖玻片上。整个制造过程通常需要1–2天，可实现快速的设计迭代以及多个器件的批量制备。有关软光刻及微加工工艺的详细综述可参见其他文献1,2,3,10,11,12,13。

光刻工艺示意图：紫外曝光、光刻胶显影、PDMS模具制备步骤。
图1：传统光刻工艺与微加工工艺的概述。（A）传统光刻工艺和（B）微加工工艺。根据应用需求及所需光刻胶特性，可选用负性或正性光刻胶，尽管两者均可获得相同的设计母版。所需的特征高度或光刻胶熔点等特性有助于确定合适的光刻胶类型。本图经Rogers（2022）14许可修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

微流控技术的应用已拓展至众多研究领域，其中对生物科学的影响尤为显著。由于其微小的尺度，微流控系统能够对有限且珍贵的资源（如细胞或蛋白质）进行精确操控。更为重要的是，微流控系统可调以模拟生理条件，例如基底刚度的改变、对样本施加力学力，甚至整合电流刺激。此外，微流控技术还具备并行操控多种试剂的能力，并可快速进行系统设计的原型构建与迭代优化。这些特性使得将整个实验室工作流程微型化并集成于单一装置成为可能，该装置通常被称为“芯片实验室”1,6,9,15,16,17,18,19。

微流控技术在细胞生物学中的一项应用是研究微管聚合物。微管是细胞骨架的重要组成部分，在细胞分裂和细胞内物质运输等过程中发挥着关键作用20,21。作为细胞骨架中最刚性的结构元件，微管的弹性模量与有机玻璃（Plexiglass）相当22,23。其优异的力学性能对于多种细胞功能至关重要，例如心肌细胞的收缩过程，在心脏的收缩期和舒张期中微管会周期性地弯曲和松弛24。此前，研究人员已采用微流控装置在体外（in vitro）研究微管及其高级结构的特性。事实上，微流控技术已被用于探究微管的聚合动力学、微管与微管之间的相互作用，以及微管相关蛋白对微管力学性能的影响25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41。

尽管微流控技术的引入为微管研究领域带来了许多令人振奋的发现，但这些装置在微管研究中的应用仍有改进空间。在本研究中，我们针对微流控装置中研究微管时仍存在的两个具体局限性进行了探讨：一是装置内可能产生气泡，通常由对微流控装置的手动操作引入；二是高通量分析方法的利用不足。首先，诸如插拔管路等手动操作可能将气泡引入通道中。流动池内形成气泡是灾难性的，因为气泡可导致蛋白质变性、剪切微管聚合物，并对细胞培养产生不利影响42,43。此外，装置中的尖锐拐角和斜角会导致表面润湿不均，从而增加夹带空气的可能性。目前已开发出多种技术以减少气泡的形成、存留及其影响；然而，气泡抑制方法的应用尚未普及42,43,44,45,46。此外，尽管微流控技术的主要优势之一是能够实现高通量实验，但该技术尚未被用于扩大微管研究的规模。微流控装置可被设计为在同一装置上并行测试多种实验条件。例如，可通过流体梯度引导不同的微管相关蛋白或药物流动，从而实现将其靶向递送至同一装置内分区微管的特定区域。

在此，我们通过迭代设计了一种微流控装置，以解决上述局限性。我们提供了该装置制备的逐步操作方案，从而使更广泛的科研人员能够在微管研究中应用微流控技术。该装置设计集成了气泡捕获结构，并采用自动流体控制系统，以减少人工干预，同时可在装置内形成溶液浓度梯度，实现高通量分析。总之，该微流控装置的设计将有助于推动对微管力学性质的更广泛研究与理解，并为整个微管研究领域的实验设计提供有价值的改进。

方案

注意：本方案中所述工作是在范德堡纳米科学与工程研究所（VINSE）核心百级洁净室中进行的。为防止器件因湿度/环境光照条件而受损，并避免颗粒污染，建议使用具备规范着装程序和紫外过滤照明的受控洁净室。操作硅片时，应始终保持其抛光面朝上。使用镊子操作硅片，尽量避免触碰硅片表面，以防划伤。运输过程中以及每天工作结束时，应将硅片置于培养皿中并盖上皿盖，除非另有指示。

1. 光刻（6 - 8 小时）

  1. 等离子清洗3英寸硅片，真空条件下处理5分钟（理想真空压力 < 5 × 10-5 托）下使用氧气（O₂）2）或洁净干燥空气（CDA）等离子体。
  2. 将硅片置于匀胶机上以进行光刻胶涂覆。
  3. 将约 1–2 mL SPR 220 7.0 光刻胶滴加至硅片中心。
    注意：操作光刻胶时须佩戴手套和护目镜，并根据制造商或现场特定的规程进行处置。
  4. 根据制造商提供的旋涂曲线，将光刻胶旋涂在硅片上至所需厚度。生成 ~13 µm 以1000 RPM转速旋转30秒以形成厚层。随后用丙酮清洗匀胶机上残留的光刻胶，并根据各实验场所特定的规程进行处理。
    注意：若旋涂后硅片上的光刻胶涂层不均匀，请重复步骤1.2–1.4。涂层不均匀可能源于硅片在旋涂仪上未居中、光刻胶用量不足和/或未将光刻胶滴加至硅片中心。
  5. 在尽可能少接触晶圆上光刻胶的情况下，将硅片转移至设定为 70 ˚C 的加热板上。
  6. 将硅片置于加热板上孵育，每3-5分钟升高温度10 °C，直至温度达到115 °C。
  7. 关闭加热板，使硅片冷却至温度低于65 ˚C。
    注意：加热和冷却步骤需缓慢进行，以防止光刻胶因厚度较大而产生热裂。若出现热裂，通常可通过重新加热硅片并减缓冷却速率来修复。
  8. 使用镊子将冷却的硅片转移至掩模对准仪中，并根据制造商或现场特定的操作规程，将硅片与相应的光掩模一同装入掩模对准仪。
    注意：光掩模由外部公司根据使用 AutoCAD 设计的特定方案制备。参见 补充文件 1 用于掩模设计的渲染。
  9. 将硅片按照制造商或特定场所的方案暴露于特定时间的紫外线（UV）辐射下（具体时间取决于UV灯的功率）。本应用所需的能量约为400 mJ/cm²。2，并通过公式计算曝光时间： 曝光时间方程；光学实验中能量与灯功率关系的示意图.
  10. 曝光后，将硅片从掩膜对准器中取出，并通过空气循环使光刻胶再水合4小时。确保培养皿的盖子保持打开状态以利于空气流通，但应将培养皿放置在不易暴露于颗粒物的区域。
    注意：在该复水时间内可暂停 4 小时，但建议于同一天内继续完成后续操作。
  11. 4小时再水化后，将暴露的晶片转移至设定为70 ˚C的加热板上。
  12. 将硅片置于加热板上孵育，每3-5分钟升高温度10 °C，直至温度达到115 °C。
  13. 将晶圆在 115 ˚C 下孵育 10 分钟。
  14. 通过将铝箔塑造成培养皿盖的形状，为暴露的晶圆制作一个绝缘“盖子”。
  15. 关闭加热板，并用铝箔盖住暴露的晶圆。让晶圆在室温下静置冷却过夜。
    注意：光刻胶的热裂解在曝光后孵育步骤中更为常见，因此建议缓慢冷却过夜。至此，第一天的制备步骤已完成。建议于次日继续进行下一节操作。

2. 发育（1 - 2 小时）

  1. 准备显影曝光后的晶圆时，取一个洁净的容器和合适的光刻胶显影液。此处使用MF-319显影液，并配以专用容器。
    警告：操作显影液时需佩戴手套和护目镜，将原装容器中的显影液转移至次级容器中，并按照制造商或现场特定规程进行废弃处理。
  2. 向容器中倒入足量显影液，以完全浸没曝光后的晶圆（实际体积根据容器大小而定）。
  3. 将曝光后的晶圆浸入显影液中，等待所有不需要的光刻胶完全溶解。轻轻摇晃或搅动容器，有助于显影过程，直至晶圆表面除器件图形外几乎无残留光刻胶可见。
    注意：根据所用显影液体积的不同，可能需要多次更换显影液，以彻底去除不需要的光刻胶。
  4. 从显影液中取出已完成显影的晶圆，并用去离子水（DI水）轻轻冲洗晶圆两面，持续30秒。
  5. 用氮气（N2）吹干显影后的晶圆。
  6. 将显影后的晶圆置于培养皿中，储存在干燥、阴凉的环境中，待后续使用。用铝箔包裹培养皿，防止光刻胶因暴露于环境光而降解。
    注意：建议在同一天内进入下一环节，但非强制要求。

3. 硅烷化处理（1 - 2 小时）

  1. 将硅片转移至干燥器中。
  2. 在干燥器内放置一个小的铝制容器（或用铝箔折叠成容器形状）。
  3. 用移液器吸取1滴（约50 µL）三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷，加入铝制容器中。
    注意：操作硅烷溶液时需佩戴手套和护目镜，并按照制造商或场所特定的规程进行废弃处理。
  4. 关闭干燥器并开启真空。
  5. 使硅片在干燥器内进行干燥/硅烷化处理1–2小时。
  6. 硅烷化处理完成后，关闭真空，取出硅烷化处理后的硅片。将处理后的硅片用铝箔包裹后置于培养皿中，存放于干燥、阴凉的环境中，待后续使用时取出。
    注意：硅片表面的硅烷化处理可能需要定期重复，尤其在使用较薄PDMS层的器件上需更频繁地重复处理。若在剥离PDMS时观察到PDMS粘附于硅片表面，则硅片可能需要重新进行硅烷化处理；此时应先完全清除硅片上的PDMS，然后重复本节操作。至此，微流控器件模具的制备步骤已完成。所制得的模具性质稳定，后续步骤可根据需要在适当时间进行。

4. PDMS 沉积（1 - 2 小时）

注意：如果前一次微加工后模具上残留有聚二甲基硅氧烷（PDMS），则必须在涂覆新的PDMS之前彻底清除残留的PDMS。

  1. 使用天平将PDMS及其配套固化剂按10:1的质量比称量至容器中。所需总质量取决于所需的PDMS厚度和培养皿尺寸。对于直径4英寸的培养皿，约20 g PDMS和约2 g固化剂可获得2–3 mm的厚度。
    注意：操作PDMS溶液时应佩戴手套和护目镜，并根据制造商或场所特定的规程进行处置。
  2. 使用塑料刮刀或其他合适工具在容器中将PDMS与固化剂混合5分钟。
  3. 将混合后的PDMS容器转移至真空干燥器中进行脱气。
  4. 关闭真空干燥器并开启真空泵，PDMS中将开始出现气泡。
  5. 持续脱气约30分钟。根据所用PDMS的量和容器形状，实际所需时间可能有所不同；一般以PDMS中几乎无气泡为终点判断标准。
  6. 脱气完成后，关闭真空泵并取出PDMS容器。
  7. 将混合并脱气后的PDMS倒入培养皿中的模具上。
  8. 将带有模具的培养皿密闭后于65 ˚C孵育过夜，使PDMS充分固化。
    备注：至此完成PDMS涂布的全部步骤。建议将PDMS在恒温培养箱中孵育过夜。固化后的PDMS稳定性良好，后续操作可根据需要在任意时间进行。

5. PDMS 装置组装（1 - 2 小时）

  1. 取出已固化PDMS的母模、一对镊子、一个带有手动冲头的标准1.5 mm活检打孔器以及手术刀片/剃须刀片。
    警告：请小心操作刀片，切勿朝向自己或他人切割。建议使用自回缩式或安全刀片。
  2. 围绕器件结构，在母模的PDMS层上切割出矩形PDMS片。确保每片PDMS在器件结构的四周留有一定余量，以便实现良好的键合接触，同时保证每片PDMS能够适配于单独的22 mm × 22 mm玻璃盖玻片上。
    注意：应避免触碰PDMS的底面（即带有结构的一面），始终使用镊子夹持PDMS边缘进行操作。此外，切勿将PDMS的结构面朝下放置于任何表面上。不使用时，应将PDMS结构面朝上存放于密闭容器中，直至需要使用。
  3. 使用洁净的1.5 mm打孔器在PDMS片上冲出进样口和出样口孔洞。打孔时应将PDMS置于一层备用的牺牲性PDMS层上进行，避免直接在硬质表面上打孔而损坏打孔器。
  4. 取一个22 mm × 22 mm玻璃盖玻片，并用浸有异丙醇（IPA）的擦拭布清洁。
  5. 将22 mm × 22 mm盖玻片置于CDA等离子体清洗机中，在真空条件下（压力 < 0.5 Torr）进行5分钟的等离子清洗，以去除盖玻片表面的任何碎屑或有机涂层。
  6. 用浸有异丙醇（IPA）的擦拭布擦拭22 mm × 22 mm玻璃盖玻片以及PDMS的结构面。
  7. 将PDMS（结构面朝上）和玻璃盖玻片（与之前清洗时相同的面朝上）一同放入等离子清洗机中，使用CDA等离子体在真空条件下（压力 < 0.5 Torr）同时进行30秒的等离子清洗。
  8. 从等离子清洗机中取出玻璃盖玻片和PDMS器件。将PDMS翻转，使结构面朝下，并将其放置在玻璃盖玻片上。观察键合情况，并根据需要轻轻按压PDMS以促进良好接触。
  9. 将键合后的盖玻片置于密闭培养皿中，在65 ˚C下孵育3分钟以促进键合。
    注意：等离子键合会改变玻璃盖玻片的疏水性，形成亲水表面。根据经验观察，盖玻片原始的疏水状态在室温下孵育约2天后会恢复。建议在等离子键合完成至少2天后再使用所制备的器件。至此，微加工步骤完成。器件无明确保质期，但不使用时应储存在阴凉干燥处。

6. 微流控流动通道制备（1 小时）

  1. 将组装好的微流控装置固定到洁净的定制载物台适配器中47。
  2. 取一支注射器、一个鲁尔锁紧接头及配套卡套，以及一段外径为1.5 mm的透明管路（长约15–20 cm）。通过接头将管路连接至注射器。
  3. 将另外三段管路连接至微流控装置的出口端（这些管路无需特定长度），并将管路的另一端导入下游的废液管中。
  4. 使用注射器，按照以下步骤引入溶液以预处理微流控装置。各溶液的顺序和体积如下：50 µL BRB80缓冲液、25 µL 抗罗丹明抗体溶液，孵育5分钟，50 µL BRB80，25 µL 聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物407（F127），孵育15分钟，再加入50 µL BRB80。示例见表1。
    1. 从试剂源中将溶液吸入管路。
      注意：不要将溶液完全吸入注射器内，溶液应仅保留在管路中。
    2. 轻压注射器推杆，直至管路末端出现一小滴液体，以防止连接管路时空气进入微流控装置。
    3. 将管路连接至微流控装置的入口。
    4. 缓慢推动注射器推杆，使大部分溶液流经管路，但不要完全排空。在管路中保留少量液体可避免意外将空气推入系统。在溶液转移过程中应观察管路和微流控通道，检查是否存在气泡。
      注意：若管路中出现气泡，应立即排查（例如在气泡进入微流控装置前拔下管路，待气泡通过后再重新连接）。
    5. 对后续每种试剂重复步骤6.4.1–6.4.4，直至所有试剂均流经装置。为防止试剂交叉污染，每种试剂均需使用新的进样管路。完成最终BRB80洗涤后，装置可在数分钟内保持稳定。在入口处滴加一滴BRB80溶液可防止装置干燥。
  5. 根据标准方案制备GMPCPP（鸟苷-5'-[(α,β)-亚甲基]三磷酸）稳定的微管“种子”（TTR标记比例约为25%）47,48。
  6. 通过混合以下试剂（根据储备液浓度调整用量）配制成2x工作浓度的成像缓冲液（“抗淬灭剂”），使其终浓度分别为：BRB80中添加40 mM葡萄糖、40 µg/mL葡萄糖氧化酶、16 µg/mL过氧化氢酶、0.5 mg/mL酪蛋白、50 mM氯化钾和10 mM二硫苏糖醇（DTT）。该成像缓冲液用于延长荧光稳定性。示例见表2。
  7. 将部分2x抗淬灭剂溶液用BRB80按1:1稀释，得到1x工作液。将该抗淬灭剂溶液恢复至室温（RT）；储备液应始终置于冰上保存。
步骤试剂体积稀释洗涤体积孵育时间
1BRB80N/A50 μLN/A
2抗罗丹明抗体1:50 in BRB80, mix well25 μL5 min
3BRB80N/A50 μLN/A
4Poloxamer 407 (F127)1% in BRB8025 μL15 min
5BRB80N/A50 μLN/A

表1：微流控装置通道的制备顺序。

体积试剂储存浓度终浓度
16 μLD-Glucose2 M80 mM
16 μLGlucose Oxidase2 mg/mL80 μg/mL
16 μLCatalase0.8 mg/mL32 μg/mL
14 μLCasein28 mg/mL0.16 mg/mL
8 μLDTT1 M20 mM
40 μLPotassium Chloride1 M100 mM
290 μLBRB801xN/A
400 μL终体积（2倍工作浓度）

表2：抗荧光淬灭成像溶液配方（2倍浓度）。

7. 微流控中微管种子的引入（10 - 15 分钟）

  1. 将微流控装置连接到显微镜上。
    注意：由于微管的稳定性具有温度依赖性，建议成像实验在 35 °C 下进行。
  2. 将一段新的 10–15 cm 长的管路连接到注射器上，并吸取所需浓度的 GMPCPP 稳定微管种子溶液至管路中。
    注意：对于本装置，约 10 nM 的 GMPCPP-微管种子为最佳浓度。
  3. 轻轻下压注射器活塞，直至管路末端出现一小滴液体。此操作可防止在连接管路时空气进入微流控装置。
  4. 将管路连接至微流控装置的进样口。
  5. 缓慢下压注射器活塞，使大部分（但非全部）溶液流经管路。在管路中保留少量液体可确保不会意外将空气推入装置中。
  6. 将进样管路从微流控装置和注射器上断开，并将一段新的管路连接至注射器。
  7. 用该管路吸取 BRB80 缓冲液。
  8. 重复步骤 7.3–7.6，以冲洗未结合的微管种子。
  9. 使用全内反射荧光（TIRF）显微镜观察微管种子在微流控表面的结合情况。单个视野中理想的种子数量取决于具体应用和视野大小，但通常在 80 µm × 80 µm 的视野中约有 10–20 个种子为最佳。根据需要重复步骤 7.2–7.9，直至达到理想的种子密度。
    注意：在监测微管种子密度时，应采用间歇性的短时间光照（100 ms），因为此时溶液中尚未加入抗荧光淬灭剂。
  10. 当达到合适的结合种子密度后，将一段新的进样管路连接至注射器。
  11. 吸取预热的 1× 抗荧光淬灭溶液至管路中，并重复步骤 7.3–7.6。
    注意：此时装置中已含有抗荧光淬灭剂，光稳定性显著提高，装置状态稳定。但仍建议尽量减少激光照射时间。

8. 从微管成核点生长微管延伸（15 - 30 分钟）

  1. 将荧光标记的微管蛋白、未标记的微管蛋白、2×抗荧光淬灭溶液、鸟苷-5'-三磷酸（GTP）和 BRB80 混合，配制成终浓度为 14 µM 微管蛋白（荧光标记比例为 7%）、抗荧光淬灭溶液工作浓度为 1×、GTP 浓度为 1 mM 的溶液。
    注意：若使用不同浓度或不同标记比例的微管蛋白，需调整各试剂的体积以达到所需的终浓度和标记比例。在加入前约 30 秒之前，将微管蛋白溶液保持在冰上；此后从冰上取出，用手温热至室温（RT）。这有助于微管延伸的聚合，因为该过程具有温度依赖性。实际上，微管聚合应在 35 °C 下进行，而其他所有实验步骤可在室温下操作。
  2. 将 10–15 cm 的新管路连接至注射器，并将微管蛋白溶液吸入管路中。
  3. 轻轻按压注射器推杆，使管路末端出现少量液滴。这可防止在连接管路时空气进入微流控装置。
  4. 将管路连接至微流控装置的入口。
  5. 缓慢按压注射器推杆，使大部分（但非全部）溶液流经管路。在管路中保留少量液体可确保不会意外将空气推入系统。随后将入口管路从微流控装置上拆下。
  6. 以所需频率成像 10–15 分钟，或直至微管延伸至足够弯曲的长度。通常每 5 秒在 488 nm 波长下、每 60 秒在 561 nm 波长下进行成像，直至微管延伸长度至少达到 5–10 µm（约 15 分钟）。
    注意：在此微管蛋白浓度下，微管可能在聚合与解聚状态之间随机切换；此现象属正常预期，但总体上微管延伸将呈现延长趋势49。

9. 微管延伸的稳定化（10-15 分钟）

  1. 将紫杉醇、2倍抗荧光淬灭溶液与BRB80混合，得到终浓度为 10 µM 紫杉醇和抗荧光淬灭剂，工作浓度为1倍。
    注意：将紫杉醇溶液置于冰上保存，直到使用前约30秒，此时将溶液从冰上取出，用手温加热至室温。此操作可防止微管突起发生温度依赖性的去聚合。
  2. 将一段 10–15 cm 的新管路连接至注射器，并吸取紫杉醇溶液至管路中。
  3. 轻轻按压注射器活塞，直至管路末端出现一小滴液体。此举可防止连接管路时有空气进入微流控装置。
  4. 将管路连接至微流控装置的入口。
  5. 按压注射器活塞，直至大部分溶液流经管路，但不要排尽。在管路中保留少量液体，可防止空气意外进入管路。
  6. 重复步骤 9.2–9.5 两次，操作需快速连续进行。本步骤中可使用同一段管路。
    注意：Taxol 促进 从头合成 微管可在溶液中由微管蛋白自发成核，这些微管可能附着到微流控通道表面，干扰后续的成像或弯曲观察。因此，应快速并多次地使紫杉醇溶液流经装置，以尽快清除装置中残留的游离微管蛋白。
  7. 验证从种子生长的微管是否仍然存在于装置中并保持稳定。

10. 弯曲稳定的微管延伸（10 - 15 分钟）

注意：现在可以使用流体控制器弯曲稳定的微管延伸结构。此处采用一个受控的正压置换系统（Elveflow OB1 MK3+），将溶液从密闭的源瓶经由流量计导入微流控芯片。根据所用流体控制器设置的具体情况，可对以下步骤进行相应调整。

  1. 根据制造商或特定场所的规程设置流量控制器及相关设备，使用管路将源瓶连接至流量计入口，再将流量计出口连接至微流控装置的入口，但暂不将管路连接至微流控装置。
  2. 将约 200 µL 的 10 µM 紫杉醇溶液注入可连接至流量控制器系统的源瓶中。该系统采用鲁尔锁（Luer-lock）连接以形成气密密封。
  3. 开启流量控制系统，并对管路进行预冲洗以排除其中的空气。此步骤可防止在连接管路至微流控装置时引入空气。
  4. 当液体经流量计流经管路并在管路末端出现少量液滴后，关闭流量控制系统。
  5. 将管路连接至微流控装置的入口。应选择与用于引入微管蛋白种子并生长微管延伸结构的入口相互垂直的入口，以实现正交方向的弯曲。
  6. 通过在设定的流速或压力下启动和停止流动，使延伸结构发生弯曲。本实验方案通常采用 30 mbar 压力、周期为 5 s 的振荡流。在此期间进行成像，通常在 488 nm 波长下每 0.1 s 采集一次图像，在 561 nm 波长下每 10 s 采集一次图像。
    注意：至此已完成基本的微管弯曲实验。所有设备和试剂应根据制造商或特定场所的规程进行清洗或处理。

结果

微流控装置设计原理
本研究中微流控装置的设计基于若干关键特性（图2），在传统简易流动池设计的基础上进行了构建与改进。值得注意的是，该微流控装置的内部体积约为 ~160 nL，显著小于传统流动池的约 ~10 µL 体积47，从而能够更精确地控制可能较为珍贵的试剂（如纯化蛋白组分）的使用。由于微流控流速控制器包含两条调节通道，因此本装置的设计假设在任意时刻仅有两个进/出口端口具有压力控制。如有需要，也可实现更多受压力控制的通道。

用于芯片实验室系统中流体隔离的带气泡捕获结构的微流控装置示意图。
图 2：微流控装置设计示意图。 周边的矩形标记用于辅助观察通道边缘。 请点击此处查看此图的放大版本。

中央的矩形装置腔室作为主要成像区域，用于固定微管成核点，并使微管从这些成核点上发生聚合延伸。腔室两侧与流体通道相交，沿x轴方向的直线通道作为进样口和出样口，以实现反应溶液的快速更换。微管进样通道也用于将微管成核点引入腔室，通过层流作用使成核点沿流动方向结合到玻璃表面。在垂直方向（y轴），流体通道向腔室一侧分支为多个更细的通道，类似于此前的一些设计25,28,36,39。这种分支结构特别适用于研究微管的力学特性。从垂直于微管成核点取向的方向向中央腔室注入溶液，可在接近垂直的角度施加由流动引起的弯曲力。此外，多个细小流体通道组成的分支结构有助于在中央腔室较大区域内实现更均匀的力分布，而这是简单的单通道流体结构所无法实现的。因此，尽管分支结构看似更为复杂，但它能够降低确定作用于微管上受力大小的整体复杂性（图3）。该设计还具有多条对称轴，便于操作，并可从多个方向评估弯曲行为（例如，顶部与底部对比）。

流体动力学模拟示意图；颜色梯度和速度矢量显示流动模式。
图3：引入分支结构可产生较大范围的相似流动区域。 两种装置设计在稳态流动下的模拟结果：一种无分支通道（A），另一种具有分支通道（B）。箭头表示局部流动方向，其长度与流速大小成正比。表面颜色表示中心线处的流速。右侧图像显示了装置的局部放大区域，在该区域中微管（未显示）沿x轴取向将受到从顶部入口流入、底部出口流出的流体所产生的弯曲力作用。引入分支通道可增大受到相似速度场作用的相对面积，同时不增加所需试剂体积。本图经Rogers（2022）14许可修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

值得注意的是，该装置还在入口和出口流道中设置了一系列气泡捕获结构，以防止气泡进入中央成像室。具体而言，我们在流道路径中设计了微柱阵列，利用表面张力阻止气泡通过（图2）46。此外，为了防止空气卷入，我们将装置内部的边缘设计为平滑曲线，而非倾斜角度。综上所述，这些设计特征降低了气泡产生的可能性，提高了装置的稳定性。

微流控器件的制备
确定用于制备器件母版的合适参数需要进行一些优化。如先前观察到的，该光刻胶对光刻步骤中的关键操作参数（如环境光照以及加热和冷却速率）非常敏感50。例如，若母版在加热后冷却过快，则光刻胶中可能产生热裂纹。这是不可取的，因为裂纹会破坏通道的完整性。虽然可通过将光刻胶重新加热至接近其相变温度（约115 °C）来消除裂纹，但我们发现，让母版在热板上自然冷却至室温是防止开裂最可靠的方法。此外，过强的环境光可能导致光刻胶意外曝光，从而削弱其结构，使得器件特征结构本身（在显影后应保留在晶圆上）在显影过程中发生部分剥离。因此，我们建议在曝光后烘烤及室温下过夜冷却的次日再进行显影步骤。此外，当器件母版不使用时，建议将其储存在避光环境中或用铝箔包裹，以防止随时间推移发生降解。一旦确定了这些参数，光刻工艺便具有高度的可重复性（图4）。

制作好模具后，将液态PDMS浇注在模具表面，使其固化，从而形成模具结构的负模。我们发现，将PDMS浇注至2-3 mm厚度时，便于后续对器件的操作；相比之下，若采用旋涂法获得同等厚度，则 µm 在该范围内，PDMS 容易撕裂或发生自粘，导致操作困难。此外，较厚的 PDMS 层更便于插入导管，因为导管可稳固地置于进样/出样端口，无需使用密封剂或夹具。

最后，尽管这些生物应用的传统流动池实验通常使用经Piranha溶液（过氧化氢和硫酸）预清洗并硅烷化处理的玻璃盖玻片，但我们发现经过长时间等离子清洗和异丙醇（IPA）洗涤处理的盖玻片已能满足我们的实验需求47。其他应用，例如单分子成像，可能需要更复杂的盖玻片处理方法。

OB1 系统中的微流控装置、显微镜设置、实验分析的试剂流控。
图 4：光刻工艺。（A）具有理想设计图案的掩膜版（由镀铬玻璃蚀刻制成）。（B）由于热应力导致硅晶圆上的光刻胶出现轻微裂纹（箭头标示出部分裂纹）。这些裂纹通常贯穿整个晶圆。（C）显影后的模具母版。（D）显微镜下的微流控装置。各个组件以绿色标注。请点击此处查看该图的高清版本。

微管的生长、稳定与弯曲
GMPCPP诱导生长的微管种子可作为微管延伸的成核位点，其自身在室温下数小时内均能保持稳定，不易发生去聚合。这些微管种子通过抗罗丹明抗体固定于微流控通道中的玻璃盖玻片上47。随后，在可溶性微管蛋白（荧光标记但未偶联罗丹明）和GTP存在条件下，诱导动态微管延伸的聚合。通过这种方式，微管种子的成核位点被固定在玻璃盖玻片上，而延伸部分则未被固定。在15分钟的延伸生长期间，微管延伸部分发生随机的聚合与去聚合行为，这是其固有的动态不稳定性所致49。生长阶段结束后，使用10 µM紫杉醇进行洗脱，以清除溶液中残留的微管蛋白，并稳定已形成的微管延伸结构。此稳定步骤至关重要，否则在微管蛋白耗尽后，微管延伸部分将发生去聚合。除了结合并稳定微管聚合物外，已有研究表明紫杉醇还会影响微管聚合物的力学性质，并可能诱导原本呈线性结构的微管延伸部分产生弯曲51,52,53,54。本文展示的结果反映了这些现象；然而，微管延伸部分的卷曲是不理想的，因其在弯曲过程中会导致晶格受力不均。因此，仅选取在稳定后仍保持相对笔直的微管用于弯曲分析。另一种方法是，在初始生长阶段之后，采用含有微管蛋白和GMPCPP（而非初始使用的GTP）的溶液进行第二轮生长，从而在微管晶格的生长末端形成稳定的“帽”结构，防止去聚合55。

随后，通过压力控制系统将缓冲溶液流入，使微管发生弯曲，以保持上游压力恒定（图5，补充视频1）。通过这种方式，我们可以近似估算微管所经历的局部流动情况。液体从顶部流入，并从底部装置端口流出，从而使流动方向与微管的接种方向垂直。

在流动条件下可视化GMPCPP种子中微管的顺序生长；显微镜延时成像。
图 5：微流控装置可用于弯曲已稳定的微管。经紫杉醇稳定后处于静息状态的微管在脉冲流作用下发生弯曲。上游恒定压力为 30 mbar，驱动液体流动（箭头表示流动方向）。请点击此处查看该图的放大版本。

微流控装置中流体剖面的测定
微流控通道中的中心线流速可通过 COMSOL 软件进行计算模拟（模拟软件，图 6A）。然而，微管在表面附近约 100 nm 范围内附着于玻璃盖玻片，以用于全内反射荧光显微镜（TIRF）观察。因此，微管所经历的流速与二维模拟所预测的流速并不相同。为了估算微管所经历的局部流场，我们采用了一维不可压缩流体流动的通用纳维-斯托克斯方程：

流体动力学方程 \(v_y(z) = v_c(1-(z/h)^2)\)，用于说明速度分布。

其中，z 为装置内微管的高度，h 为装置的总高度，vc 为装置内的中心线流速。根据系统定义，z 轴原点位于装置中心（图 6B）。采用该定义及 13 µm 的通道高度，微管的高度近似为 z = -6.4 µm。求解该方程可得到微管所经历的局部流体流速的估计值：

速度计算 \(v_y(6.4) = 92 \mu m/s\)，用于物理分析的方程。

微通道流速场的流体动力学示意图，包含方向箭头和颜色梯度。
图6：定义流体从顶部入口进入、底部出口流出（端口未示出）的流动系统分析模型。（A）中心线速度场的缩放模拟结果，如图3B所示。星号表示B图中关注区域。（B）装置的横截面示意图。充分发展流的流动方向为y方向，在z = 0处的中心线速度为vc，壁面处满足无滑移边界条件。注意：本图中的箭头相对于A图中实际速度场未按比例绘制。本图经Rogers（2022）14许可修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

除了模拟之外，还可以使用基于体积流量而非恒定压力的流量控制器来调节流体速度。此外，通过加入荧光微球并监测其移动速度，可直接测定每个装置内的局部流速，从而消除样品间的差异性。

计算模拟与浓度梯度演示
最后，我们结合计算模拟与实验，验证了利用该装置进行高通量实验的可行性。计算结果表明，得益于装置的对称性，微管可在多个方向上发生弯曲，同时装置能够维持精确的浓度梯度，从而实现在同一装置内同时研究多种实验条件（图7A）。初步实验（方法未明确列入本出版物）通过在溶液中使用荧光染料，验证了实验结果与计算预测的一致性（图7B）。此外，我们通过同时生长带有不同荧光标记的微管延伸结构，成功展示了不同蛋白质在装置不同区域内的分区行为（图8）。据我们所知，这是首次将高通量微流控技术应用于微管研究。该装置的这一特性可用于减少实验所需时间和试剂用量，同时提高实验的稳健性。例如，可在单个装置内同时研究不同蛋白质或同一蛋白质在不同浓度下对微管力学与动态行为的影响。

微流控装置扩散、浓度梯度示意图及荧光显微镜图像。
图7：浓度梯度形成。（A）两种溶液在相同入口压力（50 mbar）和浓度（15 µM）下进入装置时的梯度模拟。每种溶液的入口端口以彩色箭头标示（一种溶液从顶部端口进入，另一种溶液从右侧端口进入），其余两个端口作为出口。热图显示了顶部溶液的浓度分布。在 t = 5 s 时达到稳态。（B）通过在顶部端口使用荧光染料溶液、右侧端口使用缓冲液，实验生成类似的梯度。图像由多个视野（80 µm × 80 µm）拼接而成的栅格层构成，以完整呈现整个装置区域。本图经 Rogers（2022）许可修改自原文14。 请点击此处查看该图的放大版本。

用 A647 和 A488 标记的微管蛋白聚合荧光显微图像，显示流动方向。
图 8：微流控装置中蛋白浓度梯度的展示。将 AlexaFluor647 标记的微管蛋白（品红色）从入口 1 注入，同时以相同浓度和流速将 AlexaFluor488 标记的微管蛋白（绿色）从入口 2 注入。通过每 90 秒交替开启和关闭流体，使微管蛋白在稳定的 GMPCPP 种子（红色）上发生聚合，同时抑制混合。（A）通过拼接多个视野（80×80 µm）生成的大范围光栅图像，以完整呈现装置全长。字母表示后续各图中单个视野的相对位置。比例尺在 X 和 Y 方向均为 50 µm。（B）靠近装置入口 1 的视野，此处的微管延伸主要由 A647 标记的微管蛋白构成。（C）位于装置中部附近的视野，此处的微管延伸由两种标记的微管蛋白混合组成，符合预期。（D）靠近装置底部的视野，此处的微管延伸主要由 A488 标记的微管蛋白构成。请点击此处查看该图的放大版本。

显微镜上微流控实验装置的流程图见补充图1。

补充图1：显微镜下微流控实验装置的流程图。 请点击此处下载该文件。

补充视频 1. 微流控装置可用于弯曲稳定的微管。经紫杉醇稳定后的微管在静息状态下于脉动流中发生弯曲。上游恒定压力为 30 mbar，驱动液体流动。视频播放速率为 10 fps。请点击此处下载该文件。

补充文件1：微流控掩模设计的CAD文件。 请点击此处下载该文件。

讨论

本实验方案的主要目标是设计并制备一种适用于微管力学研究的微流控装置 体外该设计旨在利用基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控装置的固有优势，同时整合多种特性，以实现稳定且可定制的高通量实验。

这一目标已成功实现，形成了可作为未来用户使用该系统基础的制备方案和通用指南。设备中冗余气泡捕获结构的引入降低了因存在气泡而导致蛋白质变性的可能性。尽管目前在实验过程中仍需对管路进行部分插拔操作，但这些气泡捕获结构显著减少了实验失败的概率。未来对微流控系统的进一步改进有望进一步减少实验过程中所需的手动管路操作。此外，将微流控装置与自动流体控制软件集成，可在显著定制化实验条件的同时，降低人为操作误差的可能性。我们通过制备该装置，并在其中利用自动、控制器调控的流体实现微管蛋白突起的生长、稳定与弯曲，验证了装置的成功运行。进一步地，通过在同一装置内建立不同荧光标记微管蛋白溶液的浓度梯度，我们证明了可在单个装置中同时运行多种实验条件。结合计算建模与分析技术，本系统能够探测并确定微管的生物力学特性，例如弯曲刚度52,56,57,58,59。

未来的潜在改进将有助于实现更稳健的系统及相关的实验分析。首先，光刻胶的沉积、曝光和烘烤是表现出一定变异性的关键参数。由于表面等离子体共振（SPR）光刻胶的特征尺寸相对较高，需要非常缓慢地升温和降温，以防止热裂，否则可能损坏器件。尽管曾尝试制备更薄的器件，但我们发现操作这些更小特征尺寸时存在困难。在使用SPR光刻胶复制此类厚度器件时，细致入微的关注和耐心至关重要。根据不同条件下的可获得性，也可选用其他类型的光刻胶来解决这一问题。

综上所述，本文所述的微流控装置与实验方案可支持多种实验设置，相较于以往的流动池检测方法，具有更可靠的高通量测试能力47此外，可通过使用流量控制器来自动生成精确的流速分布或浓度梯度，从而降低人工操作带来的实验变异性。该实验装置未来的潜在应用包括研究微管相关蛋白对微管弯曲刚度、动态行为、晶格损伤与修复的影响，以及微管与肌动蛋白丝之间的生物力学相互作用。54,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70微加工技术、自动流体控制以及计算建模与分析技术的整合，构建了一个适用于研究细胞骨架的多功能系统 体外.

披露

作者声明无利益冲突。作者披露在文本修改和校对过程中使用了 OpenAI 的 ChatGPT-4o。

致谢

我们感谢范德堡纳米科学与工程研究所（VINSE）提供的支持和资源，本研究的部分工作在此完成。本研究部分由美国国立卫生研究院普通医学科学研究所（NIH NIGMS）向 M. Zanic 提供的资助（R35 GM1192552）以及美国国家科学基金会（NSF）ID 2018661 资助项目支持。M. Rogers 获得了 NIH T32 GM08320 资助项目和 VINSE 先导基金资助项目的支持。L. Richardson 受美国国家科学基金会研究生研究基金（NSF GRFP）资助（资助号：1937963）。作者还感谢 Alice Leach 博士、David Schaffer、Christina McGahan 博士以及整个 Zanic 实验室成员提供的帮助与支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.6 mL 微量离心管（透明）任意品牌推荐使用低吸附型
1.5 mL 微量离心管（透明）任意品牌推荐使用低吸附型
1.5 mm 标准活检打孔器Integra LifeSciences33-31A-P/25
100x/1.49 数值孔径 TIRF 物镜Nikon
22 × 22 mm 玻璃盖玻片ThorLabsCG15CH
3" 单面抛光硅片University Wafer447
4" 培养皿任意品牌
450 µL 开顶超透明薄壁管Beckman Coulter, Inc.345843在实验方案中称为“airfuge 管”
488 nm、561 nm 和 640 nm 固态激光器Nikon
A-95 固定角转子Beckman Coulter, Inc.347595
丙酮任意品牌
Airfuge 气动超速离心机Beckman Coulter, Inc.347854在实验方案中称为“airfuge”
Alexa Fluor 488 微量蛋白质标记试剂盒Thermo Fisher ScientificA30006
铝箔任意品牌
Andor iXon Ultra EM-CCDNikon
Andor NEO sCMOSNikon
AutoCADAutodesk可使用通用版本
牛脑未标记微管蛋白（纯化）N/A可自行制备，也可购买
酪蛋白MilliporeSigmaC7078
过氧化氢酶MilliporeSigmaC9322
洁净干燥空气（CDA，加压气体）任意品牌
压缩空气供应装置任意品牌连接至微流控流速控制器
COMSOL Multiphysics 软件COMSOL, Inc.
定制黄铜载物台适配器N/A自行制备，用于将 22 mm × 22 mm 盖玻片安装至显微镜
去离子水任意品牌
干燥器任意品牌
D-葡萄糖MilliporeSigmaG7528
二硫苏糖醇（DTT）MilliporeSigmaD0632
EGTAMilliporeSigma324626
Elveflow Smart Interface（ESI）软件Elveflow
无法兰 PFA 接头，ETFE ¼”-28 转 1/16” 外径卡套 Darwin MicrofluidicsCIL-XP-245X用于通过加压储液架将微管源瓶的管路连接至流速传感器
Fluiwell 4 通道 2 mL 低压储液架Fluigent14002001用于连接流控系统与微管，也称为“加压储液架”
通风橱任意品牌
葡萄糖氧化酶MilliporeSigmaG6125
GMPCPPJena BioscienceNU-405L
鸟苷三磷酸（GTP）MilliporeSigmaG8877
加热板任意品牌
HS-625 高速发射滤光轮Finger Lakes Instrumentation
ImageJ 软件N/A开放获取
培养箱任意品牌
异丙醇任意品牌
Karl Suss MA-6 掩模对准器SUSS MicroTec
氯化镁MilliporeSigma1.05833
MATLAB 软件MathWorks
MEGAPOSIT SPR 220 7.0 光刻胶Dow, Inc.
微流控接头 6-40 转 1/4"-28 适配器套件Darwin MicrofluidicsLVF-KFI-08用于通过加压储液架（Fluiwell 架）将微管源瓶的管路连接至流速传感器
微流控接头 雌性鲁尔锁紧适配器套件Darwin MicrofluidicsLVF-KFI-04用于将注射器连接至管路
微流控流速控制器ElveflowOB1 MK3+
微流控流速传感器ElveflowMFS3该流速传感器量程为 0–80 μL 
MICROPOSIT MF-319 显影液Dow, Inc.
显微镜NikonEclipse Ti
NIS-Elements 软件Nikon
氮气（加压气体）任意品牌
物镜加热器Tokai Hit
一体式手指拧紧 10-32 锥形接头，用于 1/16" 外径管路 Darwin MicrofluidicsCIL-F-120X用于将注射器连接至管路
紫杉醇（Taxol）Tocris Bioscience1097
光刻掩模N/A由外部单位根据我们的设计制作
PIPESThermo Fisher Scientific172615000
等离子清洗仪Harrick PlasmaPDC-32G
等离子流量计系统Harrick PlasmaPDC-FMG与等离子清洗仪集成，用于控制加压气体的流量
塑料洗耳球移液管任意品牌
Pluronic F-127MilliporeSigmaP2443在实验方案中称为“泊洛沙姆 407”
氯化钾Research Products InternationalP41000
Saint Gobain Performance Plastics Tube Tygon .020 内径管Thermo Fisher Scientific50-206-8921在实验方案中称为“1.5 mm 管”和“管”
手术刀任意品牌
旋涂仪Cost Effective Equipment, LLC.200x该型号可能已停产
标准移液器及吸头套装任意品牌
标准塑料注射器任意品牌我们使用了 10 mL 鲁尔滑动式注射器
Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒Dow, Inc.在实验方案中称为“PDMS”和“固化剂”
T339 带唇密封和平头螺帽的微管Medline Industried, LP.T339在实验方案中称为“源瓶”。我们使用了 0.5 mL 和 1.5 mL 两种规格
TAMRA, SE；5-(和-6)-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯InvitrogenC1171在实验方案中称为“TTR”
三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷MilliporeSigma448931
Trion Phantom RIE ICP Trion Technology, Inc.该等离子清洗仪仅在实验方案的步骤 1.1 中使用。也可使用其他等离子清洗仪（如用于 PDMS 键合的设备）替代；但我们更偏好该系统所能达到的更低真空度，以清洁硅片
TRITC 多克隆抗体Thermo Fisher ScientificA6397在实验方案中称为“抗罗丹明抗体”
镊子任意品牌
真空泵任意品牌

参考文献

  1. Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442, 368-373 (2006).
  2. Whitesides, G. M., Stroock, A. D. Flexible methods for microfluidics. Phys Today. 54 (6), 42(2001).
  3. Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: Fluid physics at the nanoliter scale. Rev Mod Phys. 77, 977(2005).
  4. Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. Physics and applications of microfluidics in biology. Annu Rev Biomed Eng. 4, 261-286 (2002).
  5. Ng, J. M. K., Stroock, A. D., Whitesides, G. M. Components for integrated poly(dimethylsiloxane) microfluidic systems. Electrophoresis. 23 (20), 3461-3473 (2010).
  6. Dellaquila, A. Five Short Stories on The History of Microfluidics. , https://www.elveflow.com/microfluidic-reviews/general-microfluidics/history-of-microfluidics/ (2025).
  7. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).
  8. Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: Microfluidics in drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 5 (3), 210-218 (2006).
  9. Neužil, P., Giselbrecht, S., Länge, K., Huang, T. J., Manz, A. Revisiting lab-on-a-chip technology for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 11 (8), 620-632 (2012).
  10. Manz, A., Graber, N., Widmer, H. M. Miniaturized total chemical analysis systems: a novel concept for chemical sensing. Sens Actuators B: Chem. 1 (1-6), 244-248 (1990).
  11. Harrison, D. J., et al. Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip. Science. 261 (5123), 895-897 (1993).
  12. Knight, J. Microfluidics: Honey, I shrunk the lab. Nature. 418 (6897), 474-475 (2002).
  13. Photolithographic fabrication techniques for transistors which are an integral part of a printed circuit. Nall, J. R., Lathrop, J. W. 1957 International Electron Devices Meeting, Washington, DC, USA, , (1957).
  14. Rogers, M. The design and fabrication of a two-layer microfluidic device for studying microtubules in vitro [Master's Thesis]. , Vanderbilt University. Nashville, TN. (2022).
  15. Lee, J. B., Choi, K. H., Yoo, K. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6 (1), 1-18 (2015).
  16. Kim, P., et al. Soft lithography for microfluidics: A Review. Biochip J. 2 (1), 1-11 (2008).
  17. Venkatesan, S. u, Jerald, J., Asokan, P., Prabakaran, R. A Comprehensive Review on Microfluidics Technology and its Applications. Recent Advances in Mechanical Engineering. , Springer. Singapore. 235-245 (2020).
  18. Minteer, S. Microfluidic Techniques: Reviews and Protocols. , Humana Press. New Jersey. (2006).
  19. Mitra, S. K., Chakraborty, S. Microfluidics and Nanofluidics Handbook: Fabrication, Implementation, and Applications. , Taylor and Francis Group. Florida. (2016).
  20. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , Garland Science. New York. (2014).
  21. Howard, J. Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , Springer. Heidelberg. (2001).
  22. Hawkins, T., Mirigian, M., Selcuk Yasar, M., Ross, J. L. Mechanics of microtubules. J Biomech. 43 (1), 23-30 (2010).
  23. Gardel, M. L., Kasza, K. E., Brangwynne, C. P., Liu, J., Weitz, D. A. Chapter 19: Mechanical Response of Cytoskeletal Networks. Methods Cell Biol. 89, 487-519 (2008).
  24. Caporizzo, M. A., Prosser, B. L. The microtubule cytoskeleton in cardiac mechanics and heart failure. Nat Rev Cardiol. 19 (6), 364-378 (2022).
  25. Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nat Mater. 14 (11), 1156-1163 (2015).
  26. Chu, S. H., et al. A microfluidic device for in situ fixation and super-resolved mechanosensation studies of primary cilia. Biomicrofluidics. 13 (1), 014105(2019).
  27. Geisterfer, Z. M., Zhu, D. Y., Mitchison, T. J., Oakey, J., Gatlin, J. C. Microtubule growth rates are sensitive to global and local changes in microtubule plus-end density. Curr Biol. 30 (15), 3016-3023 (2020).
  28. Schaedel, L., et al. Lattice defects induce microtubule self-renewal. Nat Phys. 15 (8), 830-838 (2019).
  29. Aher, A., et al. CLASP mediates microtubule repair by restricting lattice damage and regulating tubulin incorporation. Curr Biol. 30 (11), 2175-2183 (2020).
  30. Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability. ELife. 5, e13470(2016).
  31. Fourniol, F. J., et al. Micropattern-guided assembly of overlapping pairs of dynamic microtubules. Methods Enzymol. 540, 339-360 (2014).
  32. Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. J Vis Exp. (114), e54278(2016).
  33. Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout. Mol Biol Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).
  34. VanDelinder, V., Brener, S., Bachand, G. D. Mechanisms underlying the active self-assembly of microtubule rings and spools. Biomacromolecules. 17 (3), 1048-1056 (2016).
  35. Roth, S., Gârlea, I. C., Vleugel, M., Mulder, B. M., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in cell-like confinement. bioRxiv. , (2019).
  36. Xu, Z., et al. Microtubules acquire resistance from mechanical breakage through intralumenal acetylation. Science. 356 (6335), 328-332 (2017).
  37. Fanalista, F., et al. Shape and size control of artificial cells for bottom-up biology. ACS Nano. 13 (5), 5439-5450 (2019).
  38. Velve-Casquillas, G., Costa, J., Carlier-Grynkorn, F., Mayeux, A., Tran, P. T. A fast microfluidic temperature control device for studying microtubule dynamics in fission yeast. Methods Cell Biol. 97, 185-201 (2010).
  39. Portran, D., Schaedel, L., Xu, Z., Théry, M., Nachury, M. V. Tubulin acetylation protects long-lived microtubules against mechanical ageing. Nat Cell Biol. 19 (4), 391-398 (2017).
  40. Huang, Y. M., Uppalapati, M., Hancock, W. O., Jackson, T. N. Microtubule transport, concentration and alignment in enclosed microfluidic channels. Biomed Microdevices. 9 (2), 175-184 (2007).
  41. Uppalapati, M., Huang, Y., Shastry, S., Jackson, T. N., Hancock, W. O. Microtubule Motors in Microfluidics. Methods in Bioengineering: Microfabrication and Microfluidics. , Artech House Publishers. Boston, MA. (2009).
  42. Sung, J. H., Shuler, M. L. Prevention of air bubble formation in a microfluidic perfusion cell culture system using a microscale bubble trap. Biomed Microdevices. 11 (4), 731-738 (2009).
  43. Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (RID) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360(2019).
  44. Nakayama, T., et al. Circumventing air bubbles in microfluidic systems and quantitative continuous-flow PCR applications. Anal Bioanal Chem. 386 (5), 1327-1333 (2006).
  45. Park, S., Cho, H., Kim, J., Han, K. -H. Lateral degassing method for disposable film-chip microfluidic devices. Membranes. 11 (5), 316(2021).
  46. Pereiro, I., Fomitcheva Khartchenko, A., Petrini, L., Kaigala, G. V. Nip the bubble in the bud: A guide to avoid gas nucleation in microfluidics. Lab Chip. 19 (14), 2296-2314 (2019).
  47. Gell, C., et al. Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy. Methods in Cell Biol. 95, 221-245 (2010).
  48. Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: Information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP. Mol Biol Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
  49. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  50. Bartlett, N. W., Wood, R. J. Comparative analysis of fabrication methods for achieving rounded microchannels in PDMS. J Micromech Microeng. 26 (11), 115013(2016).
  51. Yang, C. P. H., Horwitz, S. B. Taxol®: The first microtubule stabilizing agent. Int J Mol Sci. 18 (8), 1733(2017).
  52. Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. J Cell Biol. 120 (4), 923-934 (1993).
  53. VanBuren, V., Cassimeris, L., Odde, D. J. Mechanochemical model of microtubule structure and self-assembly kinetics. Biophys J. 89 (5), 2911-2926 (2005).
  54. Dye, R. B., Fink, S. P., Williams, R. C. Taxol-induced flexibility of microtubules and its reversal by MAP-2 and Tau. J Biol Chem. 268 (10), 6847-6850 (1993).
  55. Drechsel, D. N., Kirschnert, M. W. The minimum GTP cap required to stabilize microtubules. Curr Biol. 4 (12), 1053-1061 (1994).
  56. Wisanpitayakorn, P., Mickolajczyk, K. J., Hancock, W. O., Vidali, L., Tüzel, E. Measurement of the persistence length of cytoskeletal filaments using curvature distributions. Biophys J. 121 (10), 1813-1822 (2022).
  57. Mickey, B., Howard, J. Rigidity of microtubules is increased by stabilizing agents. J Cell Biol. 130 (4), 909-917 (1995).
  58. Brangwynne, C. P., et al. Bending dynamics of fluctuating biopolymers probed by automated high-resolution filament tracking. Biophys J. 93 (1), 346-359 (2007).
  59. Venier, P., Maggs, A. C., Carlier, M. F., Pantaloni, D. Analysis of microtubule rigidity using hydrodynamic flow and thermal fluctuations. J Biol Chem. 269 (18), 13353-13360 (1994).
  60. Felgner, H., Frank, R., Schliwa, M. Flexural rigidity of microtubules measured with the use of optical tweezers. J Cell Sci. 109 (Pt 2), 509-516 (1996).
  61. Felgner, H., et al. Domains of neuronal microtubule-associated proteins and flexural rigidity of microtubules. J Cell Biol. 138 (5), 1067-1075 (1997).
  62. Nishida, K., et al. Effects of three microtubule-associated proteins (MAP2, MAP4, and Tau) on microtubules' physical properties and neurite morphology. Sci Rep. 13, 8870(2023).
  63. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).
  64. Brouhard, G. J., Rice, L. M. Microtubule dynamics: An interplay of biochemistry and mechanics. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (7), 451-463 (2018).
  65. Lawrence, E. J., Chatterjee, S., Zanic, M. More is different: Reconstituting complexity in microtubule regulation. J Biol Chem. 299 (12), 105398(2023).
  66. Howard, J., Hyman, A. A. Dynamics and mechanics of the microtubule plus end. Nature. 422 (6933), 753-758 (2003).
  67. Mehidi, A., Aumeier, C. Regulation of the microtubule network; the shaft matters. Curr Opin Syst Biol. 34, 100457(2023).
  68. Verhey, K. J., Ohi, R. Causes, costs and consequences of kinesin motors communicating through the microtubule lattice. J Cell Sci. 136 (5), jcs260735(2023).
  69. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (1), 38-54 (2019).
  70. Théry, M., Blanchoin, L. Microtubule self-repair. Curr Opin Cell Biol. 68, 144-154 (2021).

重印与许可

标签

PDMS
基于微流控技术的微管聚合力学研究方法的开发
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。