本方案描述了一种通过经皮穿刺途径将肿瘤细胞注入小鼠小脑延髓池以可靠诱导软脑膜转移的方法，该方法可减少创伤及颅外肿瘤负荷。
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本文内容
摘要
摘要
软脑膜转移（LM）是指癌细胞扩散至充满脑脊液（CSF）的软脑膜，是晚期实体瘤一种罕见但极具破坏性的并发症。LM 患者预后通常较差，生存期仅为数周至数月。建立能够准确模拟 LM 复杂性的体内模型，对于理解其细胞与病理机制以及评估潜在治疗方法至关重要。小鼠 LM 模型通常通过心内、颈动脉或小脑延髓池注射肿瘤细胞来构建。然而，心内或颈动脉注射常导致显著的颅外及脑实质内肿瘤负荷，干扰生物发光成像，并引发与 LM 无关的死亡。而传统的小脑延髓池注射则需要进行皮肤切开和肌肉分离等侵入性操作，创伤大且资源消耗高。本文介绍一种无需皮肤切口的微创小脑延髓池肿瘤细胞注射方法。该方法可减少颅外肿瘤形成，降低手术创伤，并缩短操作时间与术后护理需求，相较于其他手术方法更具优势。重要的是，通过双光子显微镜和组织学分析证实，该方法能稳定诱导 LM，且脑实质浸润极少。这一简化的技术为临床前研究提供了高效且可靠的 LM 研究模型。
引言
转移性疾病仍然是晚期癌症患者面临的最大挑战。软脑膜转移（LM）是指癌细胞扩散至软脑膜、蛛网膜以及蛛网膜下腔。随着生存期的延长和诊断技术的进步，实体瘤引起的软脑膜转移在肺癌（9%-25%）、乳腺癌（5%-20%）和黑色素瘤（6%-18%）中日益常见1,2。癌细胞可通过多种途径侵入软脑膜空间，包括：1）通过硬脑膜、骨骼和神经等周围结构直接侵袭；2）通过静脉系统进行血行播散；以及 3）通过动脉循环进入，癌细胞穿过有孔的血管进入脉络丛，随后进入充满脑脊液的脑室3,4,5。进入软脑膜空间的肿瘤细胞面临多重挑战，包括生长因子缺乏、代谢中间产物有限以及缺氧环境6。然而，由于缺乏合适的工具和技术，目前对肿瘤细胞如何沿这些路径迁移并克服不利条件以定植于软脑膜空间仍知之甚少。尽管在多模式治疗（包括放疗、全身治疗和鞘内注射治疗）方面已取得进展，LM患者的预后仍然较差，生存期通常仅为2至4个月3,7,8,
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方案
本手稿中所有动物实验均经浙江大学实验动物福利与伦理审查委员会（ZJU20230155）审核并批准。C57BL/6J 和 NSG 小鼠购自浙江大学实验动物中心，并在该中心的特定病原体阴性条件下饲养。本实验使用小鼠肺癌细胞系 Lewis 肺癌（LLC1）和人肺癌细胞系 A549，两种细胞均标记了 GFP 和萤火虫荧光素酶。两种细胞系均由美国贝勒医学院 Xiang H. F. Zhang 博士惠赠18。本文以 LLC1 细胞为例进行说明，A549 细胞的注射步骤基本相同，唯一区别是将 6 × 104 个 A549 细胞注射至 NSG 小鼠体内。
1. 注射用癌细胞的制备
- 在含有10%胎牛血清（FBS）和0.1 mg/mL青霉素-链霉素的DMEM培养基中，于37 °C、5% CO2培养箱中培养1.0 × 106个LLC1细胞。当细胞融合度达到70%–90%时，加入2 mL 0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液消化1分钟。以300 × g离心3分钟，用预冷的PBS洗涤两次，然后重悬于1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中。
- 使用台盼蓝溶液和血细胞计数板评估活细胞浓度19。确保细胞活力高于90%，且大多数细胞为单细胞状态。将细胞浓度用预冷的PB....
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结果
图1 展示了小鼠注射时的体位以及从侧面和正面观察的穿刺部位。 图2 显示代表性 体内 通过不同方法建立LM动物模型的生物发光成像结果。将GFP-荧光素酶标记的LLC1细胞通过不同途径注入动物体内，随后进行生物发光成像。如图所示 图2A小脑延髓池注射后10天，小鼠脑内出现生物发光信号，并沿脊髓分布，表明肿瘤细胞已在软脑膜空间成功植入。相比之下，颈动脉注射肿瘤细胞后21天，主要形成脑实质转移，软脑膜未见明显受累。图2B）。对于心内注射法，仰卧位生物发光成像显示大多数转移灶生长于颅外器官（左）；俯卧位成像进一步证实，三只小鼠均未出现软脑膜转移（右； 图 2C）。在小脑延髓池注射 6 x 10⁶ 个肿瘤细胞后 10 天，观察到相同的肿瘤细胞分布情况。4 (10 µLNSG小鼠体.......
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讨论
软脑膜转移是一种侵袭性强且致命的疾病。一旦肿瘤细胞转移至充满脑脊液的空间，便会迅速扩散至整个中枢神经系统25。这些细胞定植并侵入脑、脊髓、颅神经及脊神经，最终导致快速的神经功能恶化并致死17。为了更好地理解其潜在的病理生理机制并评估潜在的治疗策略，建立一个能够有效模拟软脑膜转移过程中转移过程及其周围微环境的体内模型至关重要。
先前有报道称，通过将肿瘤细胞直接注射到小鼠小脑半球右侧，可在小鼠模型中诱导软脑膜转移15然而，这种方法在某些受试者中往往难以在额下区或远端脊髓产生转移。最近一项研究表明，将突变的小细胞肺癌细胞皮下植入后，经过较长的潜伏期，其衍生的肿瘤可能自发扩散至软脑膜腔隙14。随后的 体外 通过自发性软脑膜转移（LM）中肿瘤细胞的扩增，作者成功建立了一个细胞亚系，该细胞亚系经颈动脉内注射后可形成软脑膜转移，且对脑实质的浸润极少。尽管该方法能够模拟转移.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢张实验室成员在本研究过程中提供的宝贵讨论和帮助。W.Z. 受浙江省高校基本科研业务费（2023QZJH60）、国家自然科学基金优秀青年科学基金项目（588020-X42306/041）以及浙江大学生命科学研究院启动经费的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 ml 离心管 | Biosharp | BS-15-M-S | |
| 15 ml 离心管 | LABSELECT | CT-002-15A | |
| 31G × 8 mm 胰岛素注射器（0.3 ml） | Promisemed | / | |
| 研磨钻机 | GLOBALEBIO | GEGZ-AM1 | |
| 动物加热垫 | woggee | / | |
| 冷冻模具 | Supin | SP-AB-7 x 7 x 5 | |
| 脱毛膏 | Nair | 1.00023E+11 | |
| D-荧光素 | Gold Biology | LUCK-1G | |
| DMEM 培养基 | Gibco | C11995500CP | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270-106 | |
| IVIS Spectrum 成像系统 | Caliper | / | |
| 氯胺酮 | Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. | H20193336 | |
| 最佳切割温度包埋剂 | Sakura | 4583-1 | |
| 多聚甲醛 | SCR | 80096618 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Servicebio | G4202-500ML | |
| 青霉素/链霉素/两性霉素 B 混合液 | Gibco | 15140122 | |
| 剃毛器 | Hipidog | 2103CGMJ3373-GQ22N526 | |
| 体视荧光显微镜 | Olympus | / | |
| 直头镊子 | Beyotime | FS019 | 需高压灭菌 |
| 手术剪 | Beyotime | FS001 | 需高压灭菌 |
| 三角形小鼠固定头架 | Transcend vivoscope | TVS-FDM-027 | |
| TRITC-葡聚糖，分子量 70000 | MedChemExpress | HY-158082C | |
| 胰蛋白酶/EDTA 溶液 | Gibco | 25200056 | |
| 双光子激光扫描显微镜 | Olympus | / | |
| Vetbond 组织粘合剂 | 3M | 1469SB | |
| 赛拉嗪 | Sigma | X1126 |
参考文献
- Wilcox, J. A., et al. Leptomeningeal metastases from solid tumors: A Society for Neuro-Oncology and American Society of Clinical Oncology consensus review on clinical management and future directions. Neuro Oncol. 26 (10), 1781-1804 (2024).
- Wasserstrom, W. R., Glass, J. P., Posner, J. B.
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