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方法文章

用于小鼠软脑膜转移研究的微创大池注射模型

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DOI：

10.3791/68190

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2025年5月23日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, 2Life Sciences Institute, Zhejiang University, 3Zhejiang Key Laboratory of Molecular Cancer Biology, Life Sciences Institute, and Department of Orthopaedic Surgery, the Second Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University

本文内容

摘要

本方案描述了一种通过经皮穿刺途径将肿瘤细胞注入小鼠小脑延髓池以可靠诱导软脑膜转移的方法，该方法可减少创伤及颅外肿瘤负荷。

摘要

软脑膜转移（LM）是指癌细胞扩散至充满脑脊液（CSF）的软脑膜，是晚期实体瘤一种罕见但极具破坏性的并发症。LM 患者预后通常较差，生存期仅为数周至数月。建立能够准确模拟 LM 复杂性的体内模型，对于理解其细胞与病理机制以及评估潜在治疗方法至关重要。小鼠 LM 模型通常通过心内、颈动脉或小脑延髓池注射肿瘤细胞来构建。然而，心内或颈动脉注射常导致显著的颅外及脑实质内肿瘤负荷，干扰生物发光成像，并引发与 LM 无关的死亡。而传统的小脑延髓池注射则需要进行皮肤切开和肌肉分离等侵入性操作，创伤大且资源消耗高。本文介绍一种无需皮肤切口的微创小脑延髓池肿瘤细胞注射方法。该方法可减少颅外肿瘤形成，降低手术创伤，并缩短操作时间与术后护理需求，相较于其他手术方法更具优势。重要的是，通过双光子显微镜和组织学分析证实，该方法能稳定诱导 LM，且脑实质浸润极少。这一简化的技术为临床前研究提供了高效且可靠的 LM 研究模型。

引言

转移性疾病仍然是晚期癌症患者面临的最大挑战。软脑膜转移（LM）是指癌细胞扩散至软脑膜、蛛网膜以及蛛网膜下腔。随着生存期的延长和诊断技术的进步，实体瘤引起的软脑膜转移在肺癌（9%-25%）、乳腺癌（5%-20%）和黑色素瘤（6%-18%）中日益常见1,2。癌细胞可通过多种途径侵入软脑膜空间，包括：1）通过硬脑膜、骨骼和神经等周围结构直接侵袭；2）通过静脉系统进行血行播散；以及 3）通过动脉循环进入，癌细胞穿过有孔的血管进入脉络丛，随后进入充满脑脊液的脑室3,4,5。进入软脑膜空间的肿瘤细胞面临多重挑战，包括生长因子缺乏、代谢中间产物有限以及缺氧环境6。然而，由于缺乏合适的工具和技术，目前对肿瘤细胞如何沿这些路径迁移并克服不利条件以定植于软脑膜空间仍知之甚少。尽管在多模式治疗（包括放疗、全身治疗和鞘内注射治疗）方面已取得进展，LM患者的预后仍然较差，生存期通常仅为2至4个月3,7,8,9。因此，迫切需要更深入地理解软脑膜转移的生物学机制，以改进现有治疗手段并开发新型靶向疗法。实现这一目标的前提是建立能够模拟LM复杂特征的体内模型。

与肝脏、骨骼和脑部等器官的转移瘤不同，软脑膜转移（LM）通常在原发性肿瘤诊断后数年才发生10,11,12。类似地，在发生自发性转移的小鼠模型中，由于LM发病率较低，且小鼠通常因其他部位的转移而死亡，因此LM较为罕见。实验性小鼠LM模型可通过多种方法建立，包括心内注射、颈动脉注射，或直接注射至小脑延髓池或脑室。尽管心内注射肿瘤细胞被广泛应用9，但常导致显著的颅外肿瘤负荷，引起与LM无关的死亡。其他方法，例如通过颈动脉注射肿瘤细胞13,14，需要大量专业资源，并造成较大的手术切口，具有创伤性。此外，该方法主要导致脑实质内的转移，而非软脑膜转移，且在建立LM模型方面耗时较长、效率较低15。向小脑延髓池注射可将肿瘤细胞直接递送至软脑膜腔隙。已有若干研究采用此方法探讨LM的发生机制并评估新的治疗方法6,16,17。

在本研究中，我们介绍了一种便捷的经小脑延髓池注射方案，通过直接经皮穿刺，可快速且稳定地建立大量软脑膜转移（LM）小鼠模型。该方法绕过了血脑屏障，从而实现了肿瘤细胞在软脑膜腔内的高效异种移植。同时，该技术显著减少了手术创伤和操作时间，并能可靠地在小鼠中诱导出LM。我们通过双光子显微镜和组织学分析证实了LM的发生，且仅有极少的肿瘤细胞浸润至脑实质。因此，该模型真实地再现了LM复杂的微环境，为研究疾病相关的细胞与病理机制以及评估潜在治疗策略提供了有价值的工具。

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方案

本手稿中所有动物实验均经浙江大学实验动物福利与伦理审查委员会（ZJU20230155）审核并批准。C57BL/6J 和 NSG 小鼠购自浙江大学实验动物中心，并在该中心的特定病原体阴性条件下饲养。本实验使用小鼠肺癌细胞系 Lewis 肺癌（LLC1）和人肺癌细胞系 A549，两种细胞均标记了 GFP 和萤火虫荧光素酶。两种细胞系均由美国贝勒医学院 Xiang H. F. Zhang 博士惠赠18。本文以 LLC1 细胞为例进行说明，A549 细胞的注射步骤基本相同，唯一区别是将 6 × 104 个 A549 细胞注射至 NSG 小鼠体内。

1. 注射用癌细胞的制备

  1. 在含有10%胎牛血清（FBS）和0.1 mg/mL青霉素-链霉素的DMEM培养基中，于37 °C、5% CO2培养箱中培养1.0 × 106个LLC1细胞。当细胞融合度达到70%–90%时，加入2 mL 0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液消化1分钟。以300 × g离心3分钟，用预冷的PBS洗涤两次，然后重悬于1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中。
  2. 使用台盼蓝溶液和血细胞计数板评估活细胞浓度19。确保细胞活力高于90%，且大多数细胞为单细胞状态。将细胞浓度用预冷的PBS调整至2 × 106个细胞/mL。
  3. 将50 µL细胞悬液分装至不同的微量离心管中，以避免反复移液操作。
  4. 将细胞悬液置于冰上保存，待注射时使用。本方案中每只小鼠注射10 µL GFP-荧光素酶标记的LLC1细胞，相当于每只小鼠2 × 104个细胞。
    注意：根据所注射细胞系的转移动力学，可按需调整细胞数量。

2. 小鼠准备

注意：本研究使用6至8周龄的雄性C57BL/6J小鼠。

  1. 将所有手术器械和手套与手术巾一起进行高压灭菌。用75%乙醇对实验台面和非手术设备进行消毒，然后用防水手术巾覆盖工作区域。
  2. 准备一个清洁的动物饲养笼和用于术后恢复的加热垫。
  3. 通过皮下注射氯胺酮（80–100 mg/kg）和赛拉嗪（8–10 mg/kg）对小鼠进行麻醉。在继续操作前，使用夹趾试验检查麻醉深度。小鼠麻醉后，涂抹无菌眼膏以防止角膜损伤。
  4. 使用电动剃毛器剃除枕骨后部的毛发，随后涂抹脱毛膏，彻底清除该区域的残余毛发。
  5. 将小鼠俯卧位固定，使其颈部置于15 mL离心管上方。用胶带固定头部和下背部，并用食指触诊枕骨与第一颈椎（C1）之间的间隙（图1）。
  6. 用浸有75%乙醇的无菌棉签反复擦拭枕骨后部区域三次，随后使用聚维酮碘外科 scrub 进行消毒。用无菌手术巾覆盖动物的非无菌部位。

3. 小脑延髓池注射

注意：以下步骤需要采用无菌技术，包括使用个人防护装备和无菌手套。

  1. 轻轻吹打细胞悬液，用31G、8 mm的胰岛素注射器吸取10 µL用于注射。
  2. 用食指触诊小鼠枕骨与C1之间的区域，以确定穿刺点位于枕骨颅后部中线下缘的准确位置。如有必要，标记该位置。
  3. 将针头以45°–50°角通过已确定的穿刺点插入小脑延髓池，进针深度达4 mm。明显的突破感表明针头已成功进入小脑延髓池。
    1. 若难以定位穿刺点，可在耳平面对应位置做一3–5 mm的小切口，暴露后正中线。如需手术切口，应在手术前1小时皮下注射美洛昔康（5 mg/kg/天）和布托啡诺（0.1 mg/kg）。
  4. 缓慢推动注射器活塞注入细胞悬液，同时将手置于桌面上以保持注射器稳定。
  5. 接种后，保持注射器位置不动，持续10秒，以使颅内压平衡。随后拔出针头，并用无菌棉签按压穿刺部位1–2分钟。

4. 注射后护理

  1. 将动物转移至加热垫上的清洁笼盒中，并密切监测直至其完全恢复。
    1. 若进行了切口，需使用组织胶和夹子闭合伤口。术后给予额外镇痛药物2-3天，以控制疼痛并促进恢复。
  2. 手术后密切观察小鼠7天，每日检查动物的活动情况及注射部位周围外观。

5. 软脑膜肿瘤生长的评估

  1. 生物发光成像
    1. 麻醉小鼠，并通过眶后静脉注射 D-luciferin（150 µg/g）。将小鼠放入成像室，使其位于麻醉混合气体装置上指定的鼻罩中。在动物之间使用遮光挡板以尽量减少信号干扰。
    2. 立即使用IVIS系统对动物进行成像，曝光时间设置为0.5秒至2分钟之间6通过头部和脊髓区域弥散性的生物发光信号，确认肿瘤细胞在软脑膜腔内的成功接种。图2A).
    3. 每4天通过生物发光成像监测LM的进展，根据肿瘤生长动力学调整成像间隔。
  2. 组织学分析
    1. 当小鼠活动明显减少或体重减轻20%时，进行麻醉，切开皮肤和肋骨以暴露胸腔。将钝头插管小心插入左心室，并推进至升主动脉。通过插管缓慢灌注20 mL PBS。
    2. 使用剪刀去除头部，并沿中线切开头皮以暴露颅骨。切除周围的软组织。沿眶嵴剪开，然后将剪刀插入枕骨大孔，小心地沿颅骨内表面施加向上压力推进，以避免组织损伤。
    3. 去除颅骨，然后轻轻取出脑组织。将脑组织置于4%多聚甲醛中，4 °C固定24小时，随后在4 °C下依次转入15%蔗糖磷酸盐缓冲液（PBS）中平衡24小时，再转入30%蔗糖PBS溶液中继续孵育24小时。
    4. 将组织置于装有最佳切割温度（OCT）包埋剂的冷冻模具中，然后在干冰上保存30分钟20.
    5. 使用冷冻切片机将包埋在OCT中的脑组织切成10 µm厚的切片。将切片保存于-80 °C冰箱中，待后续实验使用。
    6. 进行苏木精/伊红（H&E）染色&E) 脑切片染色21脑边缘存在肿瘤细胞表明转移仅发生在软脑膜腔隙中图3 和 表1).
  3. 双光子显微镜
    1. 用LM麻醉小鼠。用镊子和剪刀去除覆盖颅骨背侧表面的头皮。使用手术刀片从颅骨表面去除薄层骨膜。
    2. 用研磨钻头将颅骨磨薄，直至透过变薄的颅骨可见软脑膜血管。使用组织粘合剂将三角形头件固定，以稳定小鼠头部的观察区域。22,23.
    3. 通过眶下静脉注射 0.025 mL 5% (w/v) TRITC-葡聚糖以标记血管22.
    4. 通过成像窗口进行双光子显微镜观察，并重建软脑膜下腔图4）。通过900 nm激发、450 nm发射的二次谐波荧光检测骨组织24通过分别以900 nm和1000 nm激发，采集507 nm和572 nm发射的荧光信号，观察GFP标记的肿瘤细胞和葡聚糖标记的血管。
  4. 立体荧光显微镜
    1. 取出小鼠脑组织并置于体视显微镜下，使用GFP特异性滤光片组观察GFP标记的细胞图5).

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结果

图1 展示了小鼠注射时的体位以及从侧面和正面观察的穿刺部位。 图2 显示代表性 体内 通过不同方法建立LM动物模型的生物发光成像结果。将GFP-荧光素酶标记的LLC1细胞通过不同途径注入动物体内，随后进行生物发光成像。如图所示 图2A小脑延髓池注射后10天，小鼠脑内出现生物发光信号，并沿脊髓分布，表明肿瘤细胞已在软脑膜空间成功植入。相比之下，颈动脉注射肿瘤细胞后21天，主要形成脑实质转移，软脑膜未见明显受累。图2B）。对于心内注射法，仰卧位生物发光成像显示大多数转移灶生长于颅外器官（左）；俯卧位成像进一步证实，三只小鼠均未出现软脑膜转移（右； 图 2C）。在小脑延髓池注射 6 x 10⁶ 个肿瘤细胞后 10 天，观察到相同的肿瘤细胞分布情况。4 (10 µLNSG小鼠体...

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讨论

软脑膜转移是一种侵袭性强且致命的疾病。一旦肿瘤细胞转移至充满脑脊液的空间，便会迅速扩散至整个中枢神经系统25。这些细胞定植并侵入脑、脊髓、颅神经及脊神经，最终导致快速的神经功能恶化并致死17。为了更好地理解其潜在的病理生理机制并评估潜在的治疗策略，建立一个能够有效模拟软脑膜转移过程中转移过程及其周围微环境的体内模型至关重要。

先前有报道称，通过将肿瘤细胞直接注射到小鼠小脑半球右侧，可在小鼠模型中诱导软脑膜转移15然而，这种方法在某些受试者中往往难以在额下区或远端脊髓产生转移。最近一项研究表明，将突变的小细胞肺癌细胞皮下植入后，经过较长的潜伏期，其衍生的肿瘤可能自发扩散至软脑膜腔隙14。随后的 体外 通过自发性软脑膜转移（LM）中肿瘤细胞的扩增，作者成功建立了一个细胞亚系，该细胞亚系经颈动脉内注射后可形成软脑膜转移，且对脑实质的浸润极少。尽管该方法能够模拟转移...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢张实验室成员在本研究过程中提供的宝贵讨论和帮助。W.Z. 受浙江省高校基本科研业务费（2023QZJH60）、国家自然科学基金优秀青年科学基金项目（588020-X42306/041）以及浙江大学生命科学研究院启动经费的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 ml 离心管BiosharpBS-15-M-S
15 ml 离心管LABSELECTCT-002-15A
31G × 8 mm 胰岛素注射器（0.3 ml）Promisemed/
研磨钻机GLOBALEBIOGEGZ-AM1
动物加热垫woggee/
冷冻模具SupinSP-AB-7 x 7 x 5
脱毛膏Nair1.00023E+11
D-荧光素Gold BiologyLUCK-1G
DMEM 培养基GibcoC11995500CP
胎牛血清Gibco10270-106
IVIS Spectrum 成像系统Caliper/
氯胺酮Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd.H20193336
最佳切割温度包埋剂Sakura4583-1
多聚甲醛SCR80096618
磷酸盐缓冲液ServicebioG4202-500ML
青霉素/链霉素/两性霉素 B 混合液Gibco15140122
剃毛器Hipidog2103CGMJ3373-GQ22N526
体视荧光显微镜Olympus/
直头镊子BeyotimeFS019需高压灭菌
手术剪BeyotimeFS001需高压灭菌
三角形小鼠固定头架Transcend vivoscopeTVS-FDM-027
TRITC-葡聚糖，分子量 70000MedChemExpressHY-158082C
胰蛋白酶/EDTA 溶液Gibco25200056
双光子激光扫描显微镜Olympus/
Vetbond 组织粘合剂3M1469SB
赛拉嗪SigmaX1126

参考文献

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