用于研究啮齿类动物对抗性追逐行为的实时交互系统

摘要

在这里，我们提出了一种协议来检测和量化小鼠模型中的捕食性追逐行为。该平台为研究小鼠捕食性追逐行为的动力学和神经机制提供了一种新的研究范式，并将为研究追逐行为提供一个标准化的平台。

摘要

掠食性追逐行为涉及一系列重要的生理过程，例如运动、学习和决策，这些过程对动物成功捕捉猎物至关重要。然而，在实验室中研究捕食性追逐行为的方法和系统很少，尤其是在小鼠中，这是一种常用的哺乳动物模型。限制这项研究的主要因素是活体猎物（例如蟋蟀）的不可控性和协调实验标准的挑战。本研究的目标是开发一个交互式平台来检测和量化机器人诱饵上小鼠的捕食性追逐行为。该平台利用计算机视觉实时监控鼠标和机器人饵料的相对位置，对机器人饵料的运动模式进行编程，交互式二维滑块磁控机器人饵料的运动，实现闭环系统。机器人诱饵能够实时躲避接近的饥饿老鼠，并且可以调整其逃跑速度和方向，以模拟不同情况下的捕食性追逐过程。经过短暂的无监督训练（不到两周），小鼠能够以相对较高的效率（小于 15 秒）执行捕食任务。通过记录机器人诱饵和小鼠的速度和轨迹等运动参数，我们能够量化不同条件下的追踪过程。总之，该方法为捕食行为的研究提供了新的范式，可用于进一步研究捕食性追逐行为的动力学和神经机制。

引言

捕食者对猎物的追逐不仅生动地展示了生存斗争，也是物种进化的关键驱动力，维持自然界的生态平衡和能量流动 ^1,2。对于捕食者来说，追逐猎物的活动是一项复杂的工作，涉及各种生理过程。这些过程包括驱使捕食者狩猎的动机状态³，允许它检测和追踪猎物的感知能力 ^4,5,6，^决定狩猎过程的决策能力⁷，实现身体追逐的运动功能 ^8,9 以及随着时间的推移改进狩猎策略的学习机制 ^10，11.因此，掠夺性追求作为一种重要而复杂的行为模型，近年来受到了广泛关注。

作为实验室中广泛使用的哺乳动物模型，老鼠在其自然栖息地和实验室研究中都被记录为捕食蟋蟀¹²。然而，活猎物在量化掠食性追逐行为方面的多样性和不可控性限制了实验的可重复性以及不同实验室之间比较的交换¹³。首先，实验室之间的蟋蟀品系可能不同，导致猎物特征的差异，这可能会影响追逐行为。其次，个体蟋蟀具有独特的特征，可能会影响捕食性互动的结果¹⁴。例如，每只蟋蟀的逃跑速度可能不同，从而导致追逐动态的变化。此外，一些蟋蟀的警告距离可能很短，这可能会导致缺乏追逐过程，因为捕食者可能没有机会进行追逐。最后，一些蟋蟀在受到压力时可能会表现出防御性、攻击性行为，这使得实验数据的解释变得复杂¹⁵。很难确定捕食者行为的变化是由于猎物的防御策略还是捕食者行为模式所固有的。猎物防御和捕食者策略之间的模糊界限为捕食性追捕的研究增加了另一层复杂性。

认识到这些局限性，研究人员已将人工猎物作为控制和标准化实验条件的一种手段^16,17。包括老鼠在内的七种啮齿动物物种已被证明对人工猎物表现出明显的捕食行为¹³。因此，可控的机器人诱饵在捕食性追逐行为的研究中可能是可行的。通过设计不同的人工猎物，研究人员可以对实验条件施加一定程度的控制，这是活体猎物无法实现的^18,19。此外，先前的少数研究使用人工控制的机器鱼或猎物来研究鱼类的成群行为和捕食 15,17,19。这些研究强调了机器人系统在为实验研究提供一致、可重复和可纵的刺激方面的价值，但尽管取得了这些进步，但啮齿动物行为领域，尤其是小鼠行为领域，缺乏一个专门的平台来检测和量化使用机器人诱饵的捕食性追逐行为。

基于上述原因，我们设计了一个开源的实时交互平台来研究小鼠的捕食性追逐行为。平台中的机器人诱饵可以实时逃离老鼠，而且机器人诱饵具有高度可控性，因此我们可以设置不同的逃生方向或速度来模拟不同的捕食场景。使用计算机上的 Python 程序生成机器人猎物的运动参数，并与 STM32 微控制器相结合，驱动伺服电机并控制机器人诱饵的运动。模块化硬件系统可以实时适应特定的实验室环境，软件系统可以根据实验需要调整系统的难度以及指标，以更好地服务于研究目的。轻量级系统可显着减少计算机处理时间，这对于系统的有效性和提高其可移植性至关重要。该平台支持以下技术特点：灵活可控的人工猎物，便于重复和建模;在自然环境中最大限度地模拟狩猎过程;实时交互和低系统延迟;硬件和软件的可扩展性以及可扩展性;成本效益和易用性。使用这个平台，我们成功地训练了小鼠在各种条件下执行捕食任务，并且能够量化捕食性追逐过程中的轨迹、速度和相对距离等参数。该平台提供了一种建立掠夺性追求范式的快速方法，以进一步研究掠夺性追求背后的神经机制。

方案

成年 C57BL/6J 小鼠 （雄性，6-8 周龄） 由陆军医科大学实验动物中心提供。所有实验程序均按照机构动物福利指南进行，并得到陆军医科大学动物护理和使用委员会的批准（编号。AMUWEC20210251）。将小鼠饲养在温度受控的条件下 （22-25°C），进行 12 小时的反向光照/黑暗循环 （光照 20：00-8：00） 并自由获取食物和水。

1. 实时交互平台的硬件准备

1. 将网络摄像头安装在整个平台上方的横杆上，以实时监控鼠标和机器人诱饵在下面竞技场中的位置，并将图像传输到计算机（图 1A）。
2. 设计一个大型圆形舞台（直径 800 毫米，高度 300 毫米），由底部的方形亚克力板和作为边界的亚克力管组成。将均匀分布的四个图标（正方形、三角形、圆形和十字形）放置在竞技场的内墙上，作为视觉提示（图 1B）。
   注意：亚克力管的内壁和方形亚克力板的表面需要用不透明的贴纸覆盖。
3. 使用圆形钕磁铁（直径 40 毫米，高 10 毫米，蟋蟀长约 2-4 厘米 ^4,22）和食物颗粒（5 × 0.2 毫克）作为机器人诱饵。在磁体表面贴上蓝色贴纸，以便识别和定位。
4. 在竞技场下方安装一个二维滑块（有效行程为 1000 毫米）。在其载体上安装另一个钕磁铁作为拉动磁铁，以磁性和远程方式拉动机器人诱饵。
5. 由STM32板和开关电路控制的伺服电机驱动拉拔器磁铁。使用速度方向模式驱动伺服电机（每 16,000 个脉冲 75 mm），STM32 板输出端口的 PWM 波频率编码速度，高电平或低电平（3.3 V 或 0 V）编码正向或反向（图 1C）。
   注：开关电路如 补充图 1 所示，它仅显示了一个滑块的移动和以相同方式控制另一个滑块所需的速度和方向信号连接图。两个滑动控制电路中的地线可以连接在一起。

2. 实时交互平台软件设计

1. 使用主程序检测鼠标和机器人诱饵的相对位置，并将机器人诱饵的运动信号传输到 STM32 微控制器（图 1D）。
2. 当计算机从网络摄像头接收到图像时，在 Python 环境中处理帧。
3. 使用 OpenCV²⁰ 模块 （cv2.cvtColor） 将 RGB 颜色模型中的每个帧转换为 HSV 颜色模型。
   注意：由于小鼠是夜间觅食者，为了识别的稳定性，实验应在低照度和稳定照度的条件下进行，确保竞技场内的照明条件一致，避免局部阴影。本实验中的照度约为 95 勒克斯。
4. 分别根据 HSV 颜色模型中的鼠标和机器人诱饵的颜色范围获取它们的蒙版图像 （cv2.inRange）。
5. 对蒙版图像应用中间值过滤，使鼠标和机器人诱饵的轮廓更清晰、更稳定 （cv2.medianBlur）。
6. 使用轮廓检测功能（cv2.findContours）获取鼠标和机器人诱饵的轮廓信息，然后找到一个可以覆盖轮廓区域的最小矩形。将此矩形的中心坐标分别用作鼠标和机器人诱饵的位置，并将它们保存为 TXT 文件。
7. 根据鼠标和机器人诱饵在每帧中的位置信息，计算鼠标的速度和与机器人诱饵的相对距离，并将这些参数保存为 TXT 文件。
   注意：考虑到与图像处理相关的计算时间成本，脚本的实际处理速度约为 41 fps，这意味着系统可以在大约 24 毫秒内检测到鼠标和机器人诱饵的移动。在发送运动命令和检测运动之间测试的系统延迟为 59.4 ± 7.3 毫秒 （n = 8），因此鼠标移动与鼠标触发的猎物移动之间的延迟约为 83 毫秒（蟋蟀的反应时间小于 250 毫秒²²）。
8. 根据鼠标和机器人诱饵之间的相对距离以及它们在竞技场中各自的位置，确定机器人诱饵的逃逸策略 21,22,23。
   注意：如果鼠标距离机器人诱饵相对较远 （>250 mm），则假定机器人诱饵位于安全区域。假设鼠标离机器人诱饵足够近（<80 毫米，因为这种方法中的相对距离是根据鼠标和机器人诱饵的中心确定的，所以我们根据鼠标的体长（大约 11 厘米）和诱饵的直径（4 厘米）调整了这个阈值距离。在这种情况下，它被认为是成功的捕获，机器人诱饵将停止，让老鼠吃掉它上面的食物颗粒（图 2A）。在直线逃生策略中，如果饵料位于竞技场的中心区域（到边界的距离 >75 mm），表明所有逃生方向都有足够的空间，它将朝着鼠标向自身移动的方向移动。相反，如果诱饵靠近竞技场的墙壁，如周围区域所示（到边界的距离≤75 毫米），表明连续移动的空间不足，它将向距离竞技场边界更远的一侧转 90°（更多可用空间， 图 2B）。在回合制逃生策略中，机器人诱饵将向具有更多逃生空间的一侧旋转 90°，以 0.5 秒的间隔判断（图 2C）。
9. 确定转义策略后，让 Python 脚本分别对速度和方向信号进行编码，并通过串行端口 （ser.port = 'COM3'） 以 115200 的比特率将它们发送到 STM32。
   注意：STM32 中的脚本是在 C 环境中编译的。当接收到速度信号时，通过晶振分频器转换成相应频率的PWM波并输出（STM32晶振频率为72000000）。接收到方向信号后，通过上拉或下拉输出端口的电压（0 或 3.3 V）来转换数字信号。
10. 使用串行端口刻录机将编译好的 C 程序刻录到 STM32。
11. 使用重置程序将机器人诱饵移动到竞技场的中心。
    注意：通过检测机器人诱饵在竞技场中的位置，机器人诱饵被持续驱动到中心位置（5 cm/s），当检测到距离中心位置 <20 mm 时，认为它已经到达竞技场中心并停止移动。在运行主程序之前运行 reset 程序。

3. 习惯化（图 2D）

1. 将鼠标固定 12 小时，将动物的体重降低到正常体重的 90-95%，在此期间可以自由饮水。
2. 首先，运行 reset 程序将机器人诱饵移动到竞技场中心，然后用挡板将饥饿的老鼠隔离在竞技场边缘。
3. 在主程序中设置文件的保存路径和机器人诱饵的移动速度 （5 cm/s）。然后点击 Run （运行），在弹出的视频窗口中观察鼠标和机器人诱饵是否被稳定识别。
4. 取下挡板并启动计时器，观察鼠标的捕食行为 20 分钟，记录鼠标第一次从机器人诱饵中取食丸的时间。如果鼠标没有这样做，请停止诱饵并将其放在鼠标旁边喂食。
5. 将鼠标放回笼子中，等待 24 小时的恢复期，并自由获取食物和水。然后，重复习惯化。如果在同一组动物内的两次连续试验之间首次取食的时间没有显着差异，则认为习惯化是完全的。这段时间通常需要 3-5 次试验。
6. 每次适应后，用 75% 的酒精和水正确清洁竞技场。

4. 捕食任务（图 2D）

1. 在习惯化后立即开始捕食任务。
2. 将鼠标固定 12 小时，将动物的体重降低到正常体重的 90-95%，在此期间可以自由饮水。
3. 首先，运行一个重置程序，将机器人诱饵移动到竞技场的中心，然后用挡板将饥饿的老鼠隔离在竞技场边缘。
4. 在主程序中设置文件的保存路径和机器人诱饵的移动速度（0-60 cm/s，可根据实验需要设置不同的速度）。然后点击 Run，在弹出的视频窗口中观察鼠标和机器人诱饵是否被稳定检测到。
5. 取下挡板并启动计时器，观察鼠标的捕食行为 60 秒。
   1. 如果老鼠在 60 秒内成功捕获了机器人诱饵，请关闭主程序并让老鼠吃掉所有食物颗粒，然后再将其送回笼子。
   2. 如果老鼠在 60 秒内没有捕捉到机器人诱饵，请直接将老鼠放回笼子中，不得有任何奖励或惩罚。
6. 4 小时后进行第二轮捕食任务，重复步骤 4.3-4.5。
7. 让鼠标有 24 小时的恢复期，可以自由获取食物和水。然后，重复捕食任务。如果超过 80% 的小鼠在连续两次试验中花费的时间少于 15 秒，则认为小鼠是熟练的捕食者。
8. 每次捕食任务后，用 75% 的酒精和水正确清洁竞技场。

结果

为了逃离捕食者，猎物通常采用灵活多变的逃跑策略，例如改变逃跑速度或向不可预测的方向逃跑 21,22,23。在本研究中，机器人诱饵的运动模式在速度和方向上得到了灵活的控制，因此我们可以改变机器人诱饵的逃逸方向和速度，以分别模拟不同条件下的捕食任务。

首先，我们测试了平台控件的可靠性，逃逸速度可在 0-60 cm/s 范围内调节（蟋蟀的逃逸速度估计在 0-60 cm/s²² 的范围内）。网络摄像头监控实际速度，设定速度与实际速度之差小于 2%（表 1）。然后，我们为机器人诱饵设计了几个具有不同逃逸策略的捕食任务：

（i） 在机械饵料不同逃逸速度的捕食任务中，机械饵料被标准化为直线逃逸策略（补充视频 1），一组机械饵料以 15 cm/...

讨论

在这个协议中，为了实现低系统延迟的实时控制，我们使用了轻量级高效的计算机视觉库 OpnenCV 和颜色模型来识别鼠标和机器人诱饵的位置。这就要求场馆内的光线相对稳定，并尽可能避免场馆内的阴影，以免干扰黑鼠的探测。为了获得相对稳定的轮廓检测，我们在实验开始前在现场的几个位置用机器人诱饵捕获小鼠的颜色范围。此外，可以改变小鼠和机器人诱饵的颜色范围，以满足对其他品系小鼠的研究，例如 BALB/c（白色），或食用色素对捕食行为的影响。

另外值得一提的一点是，为了实现更低的延迟，我们只显示结果窗口，没有保存功能，这需要用户使用其他录屏软件将实验视频保存成离线版本。我们建议使用 DeepLabCut 的离线处理版本进行关键点识别²⁴。我们尝试集成 DeepLabCut 的实时处理版本，但多目标多关键点检测仍然存在很大的延迟²⁵.如果有更好的解决方案，我们将很乐意分享我们在多目标、多关键点检测技术方面的经验。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
亚克力圆筒	SENTAI	PMMA	直径 800 mm 高度 300 mm 厚度 8 mm
防振台	VEOO	定制	长度 1500 mm 宽度 1500 mm 高度 750 mm
相机	JIERUIWEITONG	HF868SS	像素尺寸 3 & micro;M &急性;3 & 微;m 480P：120 fps
相机支撑框架	RUITU	定制	最大宽度 3300 mm 最大高度 2600 mm
电路板	WXRKDZ	定制	长度 60 mm 宽度 40 mm 孔间距 2.54 mm
电脑	戴尔	Precision 5820 塔式	Inter（R） 至强（R） W-2155 CPU NVIDIA GeForce RTX 2080Ti
杜邦系列	TELESKY	定制	30 cm
食品颗粒	Bio-serve	F07595	20 mg
平台支撑架	恒东	OB3030	长 1600 mm 高 900 mm 宽 800 mm
稳压电源	兆芯	PS-3005D	输出电压：0-30 V 输出电流：0-3 A
圆形磁块	YPE	YPE-230213-5	直径 40 mm 厚度 10 mm
伺服电机驱动器	FEREME	FCS860P	0.1 kw-5.5 kw SVPWM 220 VAC+10% ~-15% RS-485
滑轨	JUXIANG	JX45	长度 1000 mm 宽度 1000 mm
方形亚克力板	SENTAI	PMMA	长度 800 mm 宽度 800 mm 厚度 10 mm
方形磁块	锐通	N35	长度 100 mm 宽度 50 mm 厚度 20 mm
Stm32	正电元子	F103	STM32F103ZET6 72 MHz 时钟
体管	Semtech	C118536	2N2222A， NPN