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方法文章

体内应用基于TurboID的邻近标记技术于Drosophila melanogaster

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DOI：

10.3791/68193

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2025年6月13日

 , 
1Soonchunhyang Institute of Medi-bio-Science, Soonchunhyang University, 2Department of Integrated Biomedical Science, Soonchunhyang University

本文内容

摘要

本研究建立了基于TurboID的果蝇（D. melanogaster）卵巢邻近标记（PL）的详细实验方案，涵盖从生物素补充、卵巢解剖到转基因表达验证以及用于质谱分析的生物素化肽段富集的全部步骤。

摘要

邻近标记（proximity labeling, PL）是一种用于绘制蛋白质-蛋白质相互作用网络的强有力方法。标记酶技术的进步，尤其是TurboID的发展，极大地拓展了该方法在各类生物系统中的应用。TurboID因其稳定性高、无毒性且操作简便，特别适用于体内（in vivo）研究。该酶在生物素存在条件下，可在约10 nm范围内非特异性地对邻近的生物分子（包括蛋白质和核酸）进行生物素标记。我们应用该方法研究了Zucchini（Zuc）的相互作用组，Zuc是黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）卵巢生殖细胞线粒体外膜（OMM）上piwi相互作用RNA（piRNA）生成过程中的关键因子。通过在生殖细胞中表达Zuc-TurboID并补充生物素，我们诱导了Zuc邻近蛋白质的生物素化。在富集生物素化肽段后进行质谱分析，鉴定了与Zuc空间位置接近的蛋白质，其中包括已知参与piRNA生成的相互作用蛋白。值得注意的是，我们还发现了Zuc的新相互作用蛋白，这些蛋白参与蛋白质折叠、膜结构组织以及囊泡运输过程。

引言

传统的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）作图方法，如亲和纯化-质谱法（AP-MS）和酵母双杂交（Y2H）系统，通常难以捕获低丰度、瞬时表达或膜结合的蛋白质。这一局限性源于这些方法无法模拟活细胞内的天然生理环境1,2,3。为克服这些挑战，邻近标记（PL）技术应运而生，成为一种可在活体中实现亚细胞器水平高分辨率蛋白质组作图的有力手段。in vivo条件下，PL利用诱饵蛋白与一种广谱性酶的融合，使该酶能够催化生成短寿命的活性分子1。这些活性分子（如生物素）可在数纳米范围内共价标记融合蛋白附近的蛋白质4。随后，通过质谱分析分离得到的生物素标记蛋白，从而实现大规模的蛋白质鉴定5,6。

近年来，已开发出多种广谱酶以推动PL技术的发展。其中两种广泛使用的酶是 大肠杆菌衍生的R118G突变型生物素连接酶（BioID）和豌豆来源的抗坏血酸过氧化物酶2（APEX2）。BioID将生物素和ATP转化为生物素化-5'-腺苷酸（bioAMP）1。这种活性分子可在±10 nm半径范围内共价结合邻近蛋白质的赖氨酸残基。基于BioID的邻近标记（PL）的一个关键优势在于使用生物素。生物素是生物体内天然存在且无毒的生物分子，因此可安全使用 体内 标记6然而，BioID 存在一些局限性，包括标记动力学较慢（18–24 小时）以及需要较高温度（37 °C）才能实现最佳催化活性4这些特性可能阻碍其在研究动态生物过程中的应用。与此同时，APEX2 在生物素-苯酚和过氧化氢（H₂O₂）存在的情况下可催化生成生物素-苯氧自由基。2O2)7这些自由基主要与富含电子的氨基酸（如酪氨酸）的侧链发生反应，也可与半胱氨酸、组氨酸和色氨酸结合。8. 辣根过氧化物酶的快速标记能力（< 1 分钟）适用于捕获动态且瞬时的蛋白质相互作用（PPIs）9此外，其检测范围（可达20 nm）比生物素连接酶更广。然而，基于APEX2的邻近标记技术也存在缺点，包括需要使用有毒的氧化剂H2O2, 以及生物素-苯酚的低渗透性，这些限制了其适用性 体内10.

2018年，Branon等人开发了一种名为TurboID的新型生物素连接酶，它是大肠杆菌（E. coli）中天然生物素连接酶BirA的一个35 kD突变体版本4。该酶在R118位点（R118S）发生突变，并相对于BirA还含有另外15个突变。其催化活性比BioID高出两倍。TurboID在10分钟内诱导的生物素标记所产生的蛋白质组数据，在规模和特异性方面均可与BioID标记18小时的结果相媲美。此外，它在30 °C时表现出优异的标记活性4。因此，TurboID更适用于如果蝇（Drosophila）或秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）等模式生物，这些生物通常分别在25 °C和20 °C下培养。

本研究旨在利用基于 TurboID 的邻近标记（PL）技术对果蝇（Drosophila）卵巢中的相互作用组进行研究。本文所述方案用于绘制生殖细胞中 Zuc 蛋白的相互作用组。Zuc 是一种定位于线粒体外膜（OMM）的核酸内切酶，参与 piRNA 的生成，而 piRNA 是一类对维持基因组完整性至关重要的小非编码 RNA11,12,13。通过比较 Zuc-TurboID 分析中鉴定出的生物素标记蛋白与另外两个对照（NES-TurboID 和 Tom20-TurboID）的结果，我们确定了特异性的 Zuc 相互作用候选蛋白。

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方案

1. 成虫果蝇中的PL

  1. 生物素食品的制备
    1. 通过将10 M NaOH储备液用三蒸水（TDW）稀释，配制1 M NaOH溶液，室温（RT）保存。将0.0049 g生物素粉末溶于20 mL三蒸水（TDW）中，配制1 M生物素储备液。加入150–200 µL 的 1 M NaOH 以提高生物素的溶解度。涡旋振荡使溶液均匀。将生物素储备液储存于 4 ℃ °C.
    2. 从试剂管中取出果蝇食物，放入微波炉加热2分钟，直至完全融化。
      注意：标准果蝇培养基含有5%玉米粉、3%酵母、10%蔗糖、1%琼脂、0.3%丙酸和0.3%对羟基苯甲酸甲酯13.
    3. 将生物素储备液加入融化的食物中，终浓度为100 µM，然后涡旋混匀。立即使用血清移液管将4.5 mL添加了生物素的食物分装至每个空瓶中。让食物冷却30分钟，盖上棉塞，然后将添加生物素的食物在4℃保存 °C.
      注意：必须在食物冷却凝固前加入生物素。
  2. 生物素喂养
    1. 将过表达 TurboID 融合蛋白的转基因果蝇与组织或细胞特异性的 GAL4 果蝇杂交14,15,16作为阴性对照，将野生型果蝇与GAL4驱动果蝇杂交，以确保无生物素化诱导。
    2. 大约杂交后10天，子代将开始孵化。将干酵母粉溶于TDW中，搅拌成均匀糊状。用实验勺取少量酵母糊涂于新试剂管内壁。轻轻敲击装有刚孵化果蝇的旧试剂管，使果蝇聚集于管底。将旧试剂管倒置并套在装有酵母糊的新试剂管上，确保两个试剂管的管口对齐，防止果蝇逃逸。
    3. 轻敲这些小瓶，将果蝇从旧瓶转移到新瓶底部。果蝇转移完毕后，将棉塞牢固地盖回新瓶和旧瓶上。静置3天。酵母糊可在室温下保存数天。
      注意：转移果蝇时需尽快完成，因为果蝇仅会暂时处于麻醉状态。
    4. 通过将250稀释制备0.5%丙酸溶液 µ将丙酸储备液加入50 mL TDW中，定容至L。室温保存。
    5. 第3天rd 天，准备 100 µ将1 M生物素储备液用TDW稀释，配制成M生物素工作液，然后加入500 µ0.5% 丙酸溶液。将生物素工作液与干酵母粉混合，搅拌至形成糊状。取一药匙生物素-酵母糊，涂抹于生物素食物小瓶内壁。生物素-酵母糊可在室温下保存数天。
    6. 将果蝇分为两组。一组保留在正常食物试剂瓶中作为对照，另一组转移至含生物素的食物试剂瓶（添加生物素-酵母膏）以启动生物素化。生物素化16小时后，将果蝇转移至新的正常食物试剂瓶中。
      注意：我们此前进行了4小时、8小时和16小时的生物素喂养实验。生物素化信号在喂养16小时后最强，因此我们选择该时间点用于后续实验。
  3. 果蝇 卵巢采集
    1. 将果蝇放入 CO₂2 果蝇培养垫，保留雌蝇，弃去雄蝇。待果蝇完全麻醉（不再移动）后，用移液器将1 mL冷的Grace昆虫培养基滴加到解剖皿中。
    2. 用精细尖头镊子将果蝇转移至解剖皿中，使其浸入溶液。用镊子夹住果蝇胸部，注意不要压碎虫体。然后用另一把镊子轻轻去除腹部后端末端（即生殖器所在部位）。
    3. 用镊子从上腹部向下轻轻挤压，将卵巢缓慢挤出。
    4. 取出后，去除包裹卵巢的肌肉网和其他组织，注意不要损伤卵巢。
    5. 用镊子将清洁的卵巢小心转移至1.7 mL离心管中，并将管子置于冰上。对后续果蝇重复步骤1.3.2–1.3.4。
    6. 3,500 x g 离心管 g 4℃下持续30秒 °C，然后使用微量移液器吸头吸除残留的培养基。注意不要触碰卵巢。
    7. 用液氮速冻试管，然后将卵巢储存在-80℃ °C. 卵巢样本在1年内保持稳定。

2. 通过蛋白质印迹实验检测转基因表达与生物素标记蛋白

注意：进行蛋白质印迹实验时，每个样本收集约五对卵巢。

  1. 组织裂解
    1. 解冻冷冻的卵巢组织。加入 50 µL RIPA裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8，150 mM NaCl，0.1% 十二烷基硫酸钠（SDS），0.5% 脱氧胆酸钠，1% Triton X-100），添加1×蛋白酶抑制剂（PI）混合物和1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）。RIPA裂解缓冲液（不含1× PI混合物和1 mM PMSF）于4℃保存 °C.
      注意：PI 混合蛋白酶抑制剂和 PMSF 应在实验开始前立即加入。
    2. 使用手持式匀浆器配合塑料研杵匀浆卵巢组织（每管1分钟）。为确保充分裂解，需在冰上进行10分钟的组织裂解处理，随后进行匀浆。
    3. 以 13,500 x g 离心 g 4℃下10分钟 °C，以分离蛋白质裂解液与碎片。
    4. 用移液器将澄清的蛋白裂解液转移至新的1.7 mL离心管中（避免吸取上层脂质层），然后将裂解液于-20 ℃保存 °C，直至进一步使用。
  2. 通过二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白质浓度
    1. 按50:1的比例混合试剂A和试剂B，配制二辛可宁酸（BCA）工作液（WR）。混合均匀 µ裂解液或稀释的BSA标准品与200 L µ在96孔板中加入WR的L（设两个复孔），然后将板在37℃孵育 °30 分钟，30°C
      1. 使用以下公式计算所需的WR量：
        (#  标准品 + # 样本 × （重复次数） × （每份样品的WR体积）
        ​为制备一组蛋白质标准品，使用RIPA裂解缓冲液（不含PI cocktail和PMSF）对2 mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）进行系列稀释，得到终浓度分别为0、25、125、250、500、750、1000、1500和2000的稀释液 µg/mL
    2. 使用酶标仪在495 nm波长下测定吸光度。根据牛血清白蛋白（BSA）的吸光度值绘制标准曲线，进而确定蛋白质浓度。
  3. Western blot 实验
    1. 凝胶电泳
      1. 加入30-50 µ将g蛋白裂解液加入2x SDS上样缓冲液中。如有需要，加入TDW，使终体积为2 µ克/µL蛋白浓度和1×SDS终浓度，然后在95℃下煮沸样品 °10 分钟，C
      2. 将25 mL 20x MOPS缓冲液与500 mL TDW混合，配制成1x工作浓度的电泳缓冲液。室温保存。
      3. 用1 mL电泳缓冲液冲洗Bis-Tris凝胶的加样孔（3次），然后将Bis-Tris凝胶放入电泳槽中。向电泳槽前槽加入新的电泳缓冲液，直至所有加样孔完全浸没（± 250 mL）。用已使用过的运行缓冲液填充电泳槽的背面（用量为新运行缓冲液用量的一半即可）。
      4. 将样品上样至 Bis-Tris 凝胶，并使用 4 µ加入预染蛋白质ladder作为分子量标记，进行电泳（200 V，30 min）。从凝胶夹中取出凝胶，并用去离子水冲洗。
    2. 膜印迹
      1. 将20 mL转膜缓冲液（25倍浓缩液）和50 mL甲醇加入430 mL去离子水中，配制转膜缓冲液。
      2. 在印迹模块中按顺序放置夹心结构，包括印迹垫、滤纸、凝胶和硝酸纤维素膜。每叠加一层前，使用滚轮去除气泡。
      3. 将转膜模块安装到转移槽上，然后向槽中加入500 mL转移缓冲液。在175 mA条件下转移蛋白质1小时。
        注意：转移缓冲液应在实验前新鲜配制。
    3. 封闭
      1. 将5 mL Tween20储备液加入45 mL TDW中，配制成10% Tween20储备液。将两片磷酸盐缓冲液（PBS）片剂溶解于400 mL TDW中。取出4 mL溶液，加入4 mL 10% Tween20（终浓度0.1%），配制成1× PBST溶液。室温保存。
      2. 从转印槽中取出已印迹的膜，然后用1×PBST缓冲液冲洗。
        注意：如果需要将膜与不同的抗体分别孵育，在封闭步骤之前，应根据目标蛋白的预期大小，使用洁净的不锈钢刀片对膜进行切割。
      3. 为检测基因表达，使用含2% BSA的1×PBST进行封闭（室温，1小时）。配制方法：将1 g BSA加入50 mL 1×PBST中，混匀。对于生物素标记蛋白的检测，使用含3% BSA的1×PBST进行封闭（4℃过夜）。 °C). 将1.5 g BSA粉末溶于50 mL 1×PBST中，配制成3% BSA溶液。将封闭液于4℃保存 °C.
        注意：此处使用的BSA与BCA检测中使用的BSA不同。用于BCA检测的BSA是BCA试剂盒的一部分。
    4. 一抗孵育
      1. 稀释1 µL 的 α-V5 抗体，使用 10 mL 的 2% BSA 溶液按 1:10,000 比例稀释，并加入 10 µ内参基因的L值 α- HSP90（1:1,000）溶于含2% BSA的溶液中。加入2.7 µ将链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物（SA-HRP）加入 9 mL 1× PBST 溶液中，配制成 0.3 µg/mL SA-HRP 溶液
      2. 为检测基因表达，将膜在4℃下与一抗孵育过夜 °C. 对于生物素标记蛋白的检测，在4℃下将膜孵育1小时 °C. 将一抗储存回 4℃ °C. 可多次使用。
      3. 用1×PBST在室温下洗涤膜，每次15分钟，共洗3次。
    5. 二抗孵育
      1. 通过加入2配制二抗溶液 µ将羊抗兔或羊抗鼠IgG（辣根过氧化物酶（HRP）标记）加入10 mL 2% BSA中（1:5,000）。
        注意：使用SA-HRP时，无需二抗，可直接进行显色步骤。二抗应在实验前新鲜稀释。
      2. 在室温下将膜置于二抗溶液中孵育40分钟。在室温下用1×PBST洗涤膜，每次15分钟，共洗3次。
    6. 使用增强型化学发光（ECL）方法进行蛋白质检测
      1. 混合 750 µL 的鲁米诺和 750 µL HRP溶液（1:1比例）。配制混合液时，保持膜在洗涤缓冲液中湿润。
        注意：该混合液应在实验前新鲜配制。由于这些化学物质对光敏感，应避免接触阳光或其他强光源（短期暴露于实验室灯光下无影响）。
      2. 将膜浸入溶液中30秒，然后置于透明塑料片之间。使用Chemidoc仪器观察印迹的蛋白质条带。

3. 通过免疫荧光染色验证转基因表达与定位

注意：为了检测基因表达和定位，从饲喂酵母糊的2日龄雌性果蝇中，每份样品解剖约五对卵巢。年轻的卵巢主要包含卵室的早期阶段，由于其中含有丰富的滋养细胞（生殖系细胞）且细胞膜通透性相对较高，因此非常适合进行免疫荧光染色17。卵室的晚期阶段因卵壳复合物的形成而变得更为坚硬且难以渗透，卵壳复合物的形成始于第9阶段18。对于蛋白质生物素化检测，按照步骤1.2所述，从饲喂生物素的4日龄雌性果蝇中，每份样品解剖约五对卵巢。

  1. 样品制备
    1. 用镊子固定解剖后卵巢的后部，用另一把镊子轻轻将卵巢分离成单个的卵室。操作时需小心，避免破裂卵室。卵室分离方案已在文献中详细描述。19小心地将卵室用移液器转移至1.7 mL离心管中，然后用1 mL 1×PBS（室温）洗涤。移液前剪去移液器吸头的尖端边缘，以防止卵室卡在吸头中。
      注意：仅使用第9阶段及以下（透明的）卵室。丢弃成熟卵母细胞和第10阶段及以上的晚期卵室。移液操作会导致卵室漂浮在溶液中，因此在进行后续步骤前，需让卵室沉降至管底（静置5分钟）。
  2. 固定
    1. 将3.125 mL的16%甲醛（FA）储备液加入6.875 mL的1×PBS中，配制成5%的FA溶液。室温保存。
      注意：FA 对光敏感，需避光保存。
    2. 将1 mL 5%甲醛（FA）移液至含有卵母细胞的离心管中。将离心管置于多向旋转仪上，固定卵母细胞30分钟。
      注意：从固定到细胞核染色步骤为止，实验均在多功能旋转仪上轻轻旋转进行。
    3. 将10 mL 10% Triton X-100 储液加入190 mL 1x PBS中，配制0.5% Triton X-100的1x PBS溶液（1x PBT），作为洗涤液。室温保存。
    4. 用1 mL 1×PBT缓冲液冲洗固定后的卵室1次，随后在室温下用1 mL 1×PBT缓冲液洗涤3次，每次10分钟。
  3. 封闭
    1. 通过加入250 μL胎牛血清（FBS）制备5%胎牛血清（FBS）溶液 µ将 FBS 储液加入 4.75 mL 1x PBT 中。
      注意：该溶液应在实验前新鲜配制。
    2. 加入1 mL 5% FBS至离心管中，在室温下封闭1小时。卵母细胞洗涤1次。
  4. 一抗孵育
    1. 为检测转基因表达与定位，稀释 2 µL of α-V5 和 2 µL of α-ATP5A 或 α-Tom20（作为线粒体标记物）在400 µ1× PBT 溶液，体积为 L（1:200 比例）。
      注意：尽管可以同时使用两种抗体对同一样本进行染色，但它们的宿主必须不同，以避免后续的二抗发生交叉结合。
    2. 将卵室与400孵育 µ稀释的一抗溶液（4℃过夜） °C）。
      注意：与蛋白质印迹实验类似，一抗可用于多次免疫染色。在将抗体溶液重新储存前，需确保其中不含任何卵室。
    3. 卵室在室温下先冲洗1次，再洗涤3次，每次10分钟。
  5. 二抗孵育
    1. 稀释2 µ山羊 L α-Rb IgG Alexa Fluor 488 和 2 µ山羊的 L α-M IgG Alexa Fluor 594 在 400 µL 的 1× PBT（1:200 比例）。将卵室与 400 µ稀释的二抗溶液中室温孵育2小时。对于生物素化检测，加入2 µ将链霉亲和素偶联的Alexa Fluor 594以1:200的比例加入1x PBT中，并与二抗共同孵育。
      注意：从这一步开始，需避免样品暴露于光线下。二抗应在实验前新鲜稀释。可同时使用多种二抗，但每种一抗应分别对应来自不同宿主且标记不同荧光染料的二抗，以避免信号重叠。例如，488 羊 α-Rb 会与兔源抗体结合 α-V5。对于小鼠 α-ATP5A，594 山羊 α-M 用作其相应的二抗。在检测生物素化时，应避免使用与链霉亲和素偶联物波长相同的其他染料。
    2. 将卵室冲洗1次，随后在室温下洗涤3次，每次10分钟。
  6. 细胞核染色
    1. 稀释1 µ1 mL 1×PBS 中加入 DAPI 至终浓度为 1:1,000。将卵室与 1 mL 稀释后的 DAPI 溶液在室温下孵育 5 分钟。
      注意：DAPI 应在实验前新鲜稀释。
    2. 用预冷的PBS在室温下冲洗卵室1次，随后在室温下洗涤3次，每次10分钟。
      注意：卵室可在 4℃ 条件下保存于 1x PBS 溶液中 °在封片前于4°C放置数小时，但建议尽快进行后续操作。
  7. 载玻片封片
    1. 用无绒布擦拭载玻片，然后在上面写明样品信息。从离心管中移除1×PBS，但保留少量液体以防止干燥。
    2. 剪切微量移液器吸头的尖端，然后小心地将卵室移取到玻片上。使用镊子将卵室在玻片上均匀分散，避免聚集。将玻片置于显微镜下观察（2倍放大倍数即可），确保卵室分布均匀。
    3. 用移液器移除玻片上残留的 PBS。移取 15-30 µ加入抗荧光淬灭剂（避光）至载玻片上，确保其与所有卵室充分接触。
    4. 使用镊子夹住盖玻片边缘，然后将其从一端开始缓慢覆盖到载玻片上，确保完全覆盖卵室区域。操作时应缓慢进行，避免产生气泡。用无绒纸巾吸去多余液体，随后用指甲油密封盖玻片边缘。待指甲油完全干燥后± 5 分钟）。
    5. 使用共聚焦显微镜对切片进行成像。将切片于 -20 ℃ 保存 °C.

4. 用于质谱分析的生物素化肽段富集

注意：质谱样品需要约 3 mg 蛋白质。因此，需解剖约 100 对卵巢以获得该数量的蛋白。

  1. 组织裂解
    1. 解冻冷冻的卵巢组织。同时，将1片TBS缓冲液片剂溶解于500 mL的TDW中，配制1×Tris缓冲盐溶液（TBS），室温保存。用16 mL的1×TBS稀释4 mL的10% SDS储备液，配制含2% SDS的1×TBS裂解缓冲液，室温保存。
    2. 加入500 µ将2% SDS溶于1×TBS（含1×PI cocktail）的溶液1 L加入含有卵巢的离心管中。静置数分钟，直至细胞裂解，溶液变黏稠。
    3. 将裂解液用移液器转移至含有自适应聚焦声学（AFA）纤维的1 mL规格militube中。使用前剪去移液器吸头尖端。为确保高效的超声处理，每次转移的液体量不应超过500 µ每管加入 L 裂解液。
    4. 采用以下条件进行超声处理：峰值入射功率 75 W，占空比 10%，每脉冲周期数 200，时间 180 s，温度 6 °C.
      注意：如果样品需要多次进行超声处理，应设置适当的间隔时间，以避免产生过多热量。
  2. 丙酮沉淀
    1. 将裂解液转移至5 mL低吸附离心管中，然后加入6倍样品体积的预冷丙酮。例如，向500 μL样品中加入3 mL丙酮 µ裂解液的体积（L）
      注意：丙酮应预先在 -20 ℃ 冷却 °使用前置于冰上。
    2. 涡流管，将其放入多管旋转仪中并过夜孵育（± 16 小时）于 -20 °C.
      注意：此为暂停节点，表示实验在此步骤后可暂时中止。
    3. 15,000 x g 离心沉淀蛋白质 g 4℃下孵育15分钟 °C. 弃去上清液，然后在4℃下离心收集管中物质 °C.
    4. 加入2 mL由90%冷丙酮和10% 1x TBS组成的混合溶液。用移液器上下吹打以混匀沉淀和溶液。使用前剪去移液器吸头尖端。
    5. 涡旋混合后，将其放入多管旋转仪中，在 -20 ℃ 孵育 2 小时 °C.
    6. 15,000 x g 离心沉淀蛋白质 g 4℃下孵育15分钟 °C. 弃去上清液，然后在4℃下离心收集管中的沉淀 °C. 打开管子，将沉淀物室温晾干10分钟。
      注意：切勿将沉淀过度干燥，否则后续将难以重悬。
    7. 配制500 mM碳酸氢铵（ABC）储存液：将0.7906 g ABC溶解于20 mL TDW中。配制50 mM ABC工作液：取3 mL 500 mM ABC储存液，加入27 mL TDW稀释。
    8. 通过将 0.4805 g 尿素加入 1 mL 50 mM ABC 中，配制 8 M 尿素溶液。
      注意：实验前应 freshly prepared 尿素溶液。
    9. 将蛋白沉淀重悬于 500 µ8 M 尿素的体积。可通过减少8 M尿素的体积来提高蛋白质浓度。
    10. 将重悬的蛋白质转移至含有AFA纤维的1 mL militube中，然后按照步骤4.1.4中所述相同条件进行超声处理。
    11. 使用BCA法测定蛋白浓度。此步骤为暂停点，将蛋白样品于4℃保存 °C，直至进一步使用。
  3. 胰蛋白酶消化
    1. 将3 mg蛋白质与TDW（如需要）在5 mL低吸附离心管中混合，总体积为500 µL 溶液
    2. 使用恒温振荡器在37℃、450 rpm条件下变性蛋白质1小时 °C.
    3. 加入5 µ将1 M DTT（溶于TDW）加入管中，使DTT终浓度为10 mM，然后在37℃、450 rpm条件下使用恒温振荡仪孵育1小时以还原蛋白质 °C.
    4. 通过将 0.0111 g 碘乙酰胺溶解于 150 μL 水中，配制 400 mM 碘乙酰胺溶液 µABC 的 L。加入 55 µ将400 mM碘乙酰胺溶液L加入管中（终浓度为40 mM），然后在37℃、450 rpm条件下使用温控金属块孵育1小时以烷基化蛋白质 °C.
      注意：碘乙酰胺对光敏感，所有碘乙酰胺溶液均需在实验前新鲜配制。
    5. 加入50 mM ABC溶液将样品稀释至总体积达到4 mL。稀释后，溶液中尿素浓度约为1 M。
    6. 制备 1 M CaCl₂2 通过溶解1.1098 g CaCl配制储备液2 在10 mL去离子水中。加入4 µ1 M CaCl₂ 溶液2 将储备液加入管中，使终浓度为1 mM，然后用移液器吹打混匀溶液。
    7. 将 0.001 g 胰蛋白酶加入 1 mL ABC 中，配制 1 mg/mL 胰蛋白酶储存液。加入 150 µ向管中加入L量的胰蛋白酶（胰蛋白酶：样品 = 1:20 比例）。使用温控金属浴在37℃、450 rpm条件下孵育16小时以消化蛋白质 °C.
      注意：胰蛋白酶应在实验前新鲜溶解。此步骤为暂停点。将消化后的肽段于4℃保存 °C，直至进一步使用。
  4. 生物素化肽段富集
    注意：实验前应 freshly 配制洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。
    1. 在10 mL 1×TBS溶液中加入1.2012 g尿素，配制2 M尿素的1×TBS溶液。
    2. 使用150 µ每3 mg样品加入L链霉亲和素偶联磁珠。用1 mL含2 M尿素的1×TBS缓冲液洗涤链霉亲和素磁珠，重复此步骤4次。每次洗涤后，将离心管置于磁力架上1分钟，然后弃去洗涤液。
      注意：推荐使用Pierce链霉亲和素磁珠，因其可在质谱结果中最大限度减少类似PEG的背景信号。
    3. 将1 mL消化后的肽段加入含有珠子的离心管中，轻轻混匀，然后将混合物转移至5 mL低吸附离心管中，与剩余样品合并。将离心管置于多向旋转混合仪上，室温孵育1小时。
    4. 将1 mL混合物转移至1.5 mL离心管中，置于磁力架上1分钟。弃去上清液。重复此步骤直至收集全部磁珠。
    5. 将0.7207 g尿素溶解于6 mL 50 mM ABC中，配制2 M尿素溶液（溶剂为50 mM ABC）。用1 mL含2 M尿素的50 mM ABC溶液（2x）洗涤磁珠一次，再用1 mL TDW洗涤一次。每次洗涤后，将离心管置于磁力架上1分钟，随后弃去洗涤液。
    6. 配制10%甲酸储存液，将1 mL甲酸溶解于9 mL TDW中。配制洗脱缓冲液，含80%乙腈和0.1%甲酸的TDW溶液。例如，混合1.2 mL乙腈、15 µ10% 甲酸储备液的升数，以及 285 µ加入 L 型 TDW 以配制 1.5 mL 洗脱缓冲液。
      警告：乙腈和甲酸因其挥发性而具有危害性，操作时需佩戴口罩并谨慎小心。
    7. 移液100 µ将洗脱缓冲液加入管中，轻轻匀浆，然后在60℃、300 rpm条件下使用恒温振荡块洗脱肽段5分钟。 °C. 洗脱后，将离心管置于磁力架上，将洗脱液转移至新的1.5 mL离心管中。转移过程中避免带走磁珠。重复此步骤5次。
    8. 将含有500的试管置于 µ将洗脱液置于磁力架上静置5分钟，然后转移至新的1.5 mL离心管中，以确保完全去除磁珠。所得洗脱样品可进行干燥处理，随后用于质谱分析。
    9. 有关富集肽样品的LC-MS/MS分析及质谱数据处理的更多信息，请参阅Nguyen 等20.

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结果

示例结果如图所示 图1, 图2, 图3, 图4 此前由 Nguyen 等人发表20. 图1 展示了基于TurboID的邻近标记（PL）实验流程 果蝇 卵巢。首先构建了一个融合Zuc与TurboID的表达载体（Zuc-V5-TurboID）。同时，将已知定位于特定亚细胞器的标志性蛋白——核输出信号蛋白（NES）和线粒体外膜转位酶（Tom20）——也分别与TurboID融合（NES-V5-TurboID和Tom20-V5-TurboID）。其中，NES-V5-TurboID用于生物素标记胞质蛋白，作为阴性对照；而Tom20-V5-TurboID则作为阳性对照，用于标记线粒体外膜（OMM）的蛋白质组。将过表达这些转基因...

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讨论

本文提供了一种在黑腹果蝇（Drosophila）卵巢中进行基于TurboID的邻近标记（PL）的完整实验流程，该流程经过大量排查优化，以克服多种技术挑战。其中一个关键问题涉及遗传构建体的设计，不同的融合结构显著影响了蛋白表达水平和生物素化效率。例如，NES-V5-TurboID的表达水平和生物素化效果弱于其他转基因形式，有时会干扰下游实验结果的解读。然而，将核输出信号（NES）融合至TurboID的C末端所构建的改良型载体（V5-TurboID-NES）表现出更强的表达水平和更高的生物素化效率。这些结果强调了在研究早期优化目的基因（GOI）排列方式以实现有效细胞表达的重要性。可利用现有的生物信息学工具预测目标蛋白与TurboID之间的结构兼容性；或者，建议构建并比较多种转基因构型（如N末端与C末端融合）。另一个重要挑战是质谱（MS）结果中持续出现聚乙二醇（PEG）峰污染，这类污染通常来源于塑料离心管和去垢剂21。一旦引入，PEG污染可能干扰肽段离子化过程，增加质谱数据分析难度，并可能长期损害质谱仪器。在我们的实验中，使用有机溶剂洗脱肽段似乎会增加磁珠释放的类PEG物质污染...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢实验室成员的讨论与帮助。本工作由韩国政府（MSIT）资助的国家研究基金会（NRF）支持（M.L. 项目编号 RS-2024-00345327；M.L. 项目编号 RS-2023-00219563）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>抗体
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗Invitrogen31430分析纯，避光
山羊抗兔IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 488InvitrogenA32731分析纯，避光
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（H+L）二抗Invitrogen31460分析纯，避光
HSP90 抗体（兔）细胞信号技术公司4874多克隆抗体
Pierce 链霉亲和素蛋白，HRP赛默飞世尔科技21126分析纯
链霉亲和素，Alexa Fluor 594 标记物InvitrogenS11227对光敏感，分析纯
V5标签抗体（小鼠）InvitrogenR960-25单克隆抗体
V5标签抗体（兔）（D3H8Q）细胞信号技术公司13202单克隆抗体
<强>果蝇品系<强>公司<强>货号<强>评论/描述
pUASp Tom20 V5-TurboID/TM3韩国果蝇品系中心2373-2果蝇品系
pUASp Zucchini V5-TurboID/Cyo韩国果蝇品系保藏中心2188果蝇品系
pUASP_attB_V5-TurboID-NES/Cyo韩国果蝇品系中心2635-4果蝇品系
w[*]; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2H布卢明顿果蝇品系中心7062果蝇品系
<强>设备与耗材<强>公司<强>货号<强>评论/描述
分析天平Mettler ToledoME2040.1 mg 可读性
Amersham Protran 0.45 NC 硝酸纤维素 Western 印迹膜（300 mm） × 4 mCytiva10600002-
Axygen 1.7 mL MaxyClear Snaplock 微量离心管康宁MCT-175-C共聚物
BRAND 盖玻片（22 mm × 22 mm）Sigma-AldrichBR470055硼硅酸盐玻璃
批量移液器吸头（10 µL顶点4110N00丙烯
批量移液器吸头（1000 µL顶点4330N00丙烯
批量移液器吸头（200 µL顶点4230N00丙烯
细胞培养板（96孔）SPL300096聚苯乙烯，平底型
离心机（配有适用于1.5-2 mL离心管的转子）Eppendorf5424 R固定角度，带制冷功能
离心机（配备可容纳 5 mL 管的转子）Eppendorf5425 R固定角度，带制冷功能
化学勺--不锈钢
ChemiDoc 成像系统伯乐（Bio-Rad）12003153Western blot 成像系统
CO2 果蝇培养垫--麻醉板
CO2 储液罐 &和调节剂--高压气体警示 &和头晕
小型培养箱JSRJSGI-10T注意高温
共聚焦激光扫描显微镜蔡司LSM 710强激光束警示
锥形管（15 mL）SPL50015聚丙烯/高密度聚乙烯 
锥形管（50 mL）SPL50050聚丙烯/高密度聚乙烯 
电子天平---
数字计时器---
解剖皿--硅
Dumont #5SF 镊子 Fine Science Tools11252-00超细尖端，注意锐器安全
DynaMag-2 磁力架Invitrogen12321D适用于1.5–2 mL规格的微量离心管
Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片（25 mm × 75 mm）Fisher Scientific12-550-15注意尖锐物品
果蝇培养瓶（带纸塞）Hansol TechFFB-21010-
果蝇培养管（带棉塞）Hansol TechFFV-11010-
聚焦超声波破碎仪CovarisM220超声波使用注意事项
凝胶切割刀InvitrogenEI9010不锈钢配塑料手柄
3MM 级别的印迹纸（46 厘米） × 57 厘米Cytiva3030-917沃特曼滤纸
手持式匀浆器和塑料研杵Kimble749540-0000无线电机
加热块精细PCRALB6400注意高温
无绒布Yuhan-Kimberly41112-
液氮--注意冻伤与烧伤风险
微孔板分光光度计安捷伦科技时期基于单色仪的光学系统
微波--注意高温
milliTUBE 1 mL AFA 纤维CovarisPN 520135玻璃
迷你凝胶电泳槽赛默飞世尔科技A25977注意高温
NuPAGE Bis-tris 小型蛋白凝胶，4–12%, 1.0–1.5 mm，10孔InvitrogenNP0323BOX含聚丙烯酰胺，注意毒性
NuPAGE Bis-tris 小型蛋白凝胶，4–12%, 1.0–1.5 mm，15孔InvitrogenNP0321BOX含有聚丙烯酰胺，注意毒性
画笔（Ø 1.8 mmHwa hong791240-
Pipetman L (P1000L)GilsonFA10006M带金属弹射器的单通道微量移液器
Pipetman L (P200L)GilsonFA10005M带金属弹射器的单通道微量移液器
Pipetman L (P20L)GilsonFA10003M带金属弹射器的单通道微量移液器
Pipetman L（P2L）GilsonFA10001M带金属弹射器的单通道微量移液器
电源供应主要科学领域MP-310注意高压电
可编程旋转仪BiosanRS-24-
蛋白质防吸附管 管Eppendorf30108302-
剃刀刀片Dorco304020不锈钢，小心锐器
滚轴---
10 mL 血清移液管SPL91010聚苯乙烯
血清移液管（25 mL）SPL91025聚苯乙烯
5 mL 血清移液管SPL91005聚苯乙烯
血清移液管（50 mL）SPL91050聚苯乙烯
低吸附带盖微量离心管（1.5 mL）赛默飞世尔科技3451PK聚丙烯
海绵垫InvitrogenEI9052-
体视显微镜蔡司Stemi 508-
体视显微镜 Leica
ThermoMixer CEppendorf53820000151.5 &和5 mL大小的块状物
镊子Aven Tools18526塑料平头尖端
涡旋混合器科学工业公司SI-0236-
XCell II 转膜模块InvitrogenEI9051注意高温
XCell SureLock mini-cellInvitrogenEI0001注意高温危险
<强>化学品<强>公司<强>货号<强>评论/描述
丙酮Sigma-Aldrich650501分析纯
乙腈Supelco1.00029.1000LC-MS级，注意吸入毒性和易燃性
白蛋白标准安瓿瓶（含牛血清白蛋白（BSA）2 mg/mL，溶于0.9%生理盐水并添加0.05%叠氮化钠）赛默飞世尔科技23209Pierce BCA 蛋白检测试剂盒（Thermo Scientific，23225）的一部分
牛血清白蛋白BioshopALB001分析纯
碳酸氢铵Sigma-Aldrich09830分析纯
生物素 Sigma-AldrichB4639细胞 &以及组织培养级
氯化钙（CaCl2)Sigma-AldrichC5670细胞培养级
Clarity Western ECL 底物伯乐（Bio-Rad）1705060分析纯
DAPISigma-AldrichMBD0015对光敏感，分析纯
二硫苏糖醇（DTT）赛默飞世尔科技R0861分析纯
胎牛血清康宁35-015-CV细胞培养级
甲酸Sigma-AldrichF0507试剂级，注意吸入毒性
Grace昆虫培养基Gibco11595030细胞培养级
即食干酵母无品牌N1019-
碘乙酰胺Sigma-AldrichI1149对光敏感，分析纯
甲醇Carlo Erba41484分析纯
指甲油--Clear-type
Novex Tris-甘氨酸 SDS 样品缓冲液（2X）InvitrogenLC2676分析纯
NuPAGE MOPS SDS 电泳缓冲液（20X）InvitrogenNP0001分析纯
PageRuler 预染蛋白质标准品赛默飞世尔科技26616分析纯
苯甲基磺酰氟 赛默飞世尔科技36978分析纯
磷酸盐缓冲液Sigma-AldrichP4417分析纯
Pierce 16% 甲醛（w/v）赛默飞世尔科技28908分析纯，避光
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒赛默飞世尔科技23225分析纯
Pierce BCA 试剂A（含有碳酸钠、碳酸氢钠、双辛可宁酸和酒石酸钠的0.1 M氢氧化钠溶液）赛默飞世尔科技23228Pierce BCA 蛋白质定量试剂盒（Thermo Scientific，23225）的一部分
Pierce BCA 试剂 B（含4%硫酸铜）赛默飞世尔科技1859078Pierce BCA 蛋白质检测试剂盒（Thermo Scientific，23225）的一部分
丙酸Sigma-Aldrich402907ACS级
蛋白酶抑制剂混合物套装 IIICalbiochem539134细胞 &及组织培养级
SlowFade Gold 抗荧光淬灭封片剂InvitrogenS36936光敏感的
氯化钠（NaCl）BioneerC-9025分析纯
脱氧胆酸钠Sigma-AldrichD6750分析纯
十二烷基硫酸钠Sigma-Aldrich71736分子生物学级
氢氧化钠（NaOH）BiosesangSR2018-100-00分析纯
三蒸水--超纯（一级）
Tris缓冲盐水Sigma-Aldrich94158分析纯
Tris-甘氨酸转移缓冲液Koma BiotechK0341001分析纯
Tris-HCl，pH 8BioneerC-9006分析纯
Triton X-100Sigma-Aldrich93443分子生物学级
胰蛋白酶赛默飞世尔科技20233细胞培养级
Tween 20Sigma-AldrichP9416分子生物学级别
尿素Sigma-AldrichU5378分子 &和细胞培养级

参考文献

  1. Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: Proximity-based labeling of proteins in living cells. Trend Cell Biol. 26 (11), 804-817 (2016).
  2. Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by turboid. eLife. 8, e47864(2019).
  3. Qi, Y., Katagiri, F. Purification of low-abundance Arabidopsis plasma-membrane protein complexes and identification of candidate components. Plant J. 57 (5), 932-944 (2009).
  4. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with turboid. Nat Biotechnol. 36 (9), 880-887 (2018).
  5. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  6. Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. J Cell Biol. 196 (6), 801-810 (2012).
  7. Quantitative Proteomics. , https://case.edu/medicine/nutrition/centers-and-collaborations/case-center-proteomics-and-bioinformatics/proteomics-and-small-molecule-mass-spectrometry-core/quantitative-proteomics (2025).
  8. Udeshi, N. D., et al. Antibodies to biotin enable large-scale detection of biotinylation sites on proteins. Nat Meth. 14 (12), 1167-1170 (2017).
  9. Ummethum, H., Hamperl, S. Proximity labeling techniques to study chromatin. Front Genet. 11, 450(2020).
  10. Han, S., Li, J., Ting, A. Y. Proximity labeling: Spatially resolved proteomic mapping for neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 50, 17-23 (2018).
  11. Nishimasu, H., et al. Structure and function of zucchini endoribonuclease in pirna biogenesis. Nature. 491 (7423), 284-287 (2012).
  12. Zamudio, N., et al. DNA methylation restrains transposons from adopting a chromatin signature permissive for meiotic recombination. Genes Dev. 29 (12), 1256-1270 (2015).
  13. Cha, S. J., et al. Therapeutic modulation of gsto activity rescues fus-associated neurotoxicity via deglutathionylation in als disease models. Dev Cell. 57 (6), 783-798.e8 (2022).
  14. Pulver, S. R., Berni, J. The fundamentals of flying: Simple and inexpensive strategies for employing Drosophila genetics in neuroscience teaching laboratories. J Undergrad Neurosci Educ. 11 (1), A139-A148 (2012).
  15. Feizy, N., et al. In vivo identification of Drosophila rhodopsin interaction partners by biotin proximity labeling. Sci Rep. 14 (1), 1986(1986).
  16. Zhang, B., Zhang, Y., Liu, J. L. Highly effective proximate labeling in Drosophila. G3. 11 (5), jkab077(2021).
  17. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
  18. Waring, G. L. Morphogenesis of the eggshells in Drosophila. Int Rev Cytol. 198, 67-108 (2000).
  19. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual drosophila egg chambers for live imaging. J Vis Exp. (60), e3679(2012).
  20. Nguyen, T. T. M., et al. In vivo profiling of the zucchini proximal proteome in the Drosophila ovary. Development. 150 (4), dev201220(2023).
  21. Ahmadi, S., Winter, D. Identification of poly(ethylene glycol) and poly(ethylene glycol)-based detergents using peptide search engines. Anal Chem. 90 (11), 6594-6600 (2018).
  22. Zada, A., Khan, I., Zhang, M., Cheng, Y., Hu, X. Airid-based proximity labeling for protein-protein interaction in plants. J Vis Exp. (187), e64428(2022).
  23. Fang, B., et al. Lowering sample requirements to study tyrosine kinase signaling using phosphoproteomics with the tmt calibrator approach. Proteomics. 20 (24), 2000116(2020).
  24. Park, N., et al. One-stage tip method for tmt-based proteomic analysis of a minimal amount of cells. ACS Omega. 8 (22), 19741-19751 (2023).
  25. Zhang, Y., et al. Turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. J Vis Exp. (159), e60728(2020).
  26. Trinkle-Mulcahy, L. Recent advances in proximity-based labeling methods for interactome mapping. F1000Res. 8, Faculty Rev-135 F1000(2019).
  27. Wei, X. F., Li, S., Hu, J. L. A turboid-based proximity labelling approach for identifying the DNA-binding proteins. STAR Protoc. 4 (1), 102139(2023).
  28. Bosch, J. A., Chen, C. L., Perrimon, N. Proximity-dependent labeling methods for proteomic profiling in living cells: An update. WIREs Dev Biol. 10 (1), e392(2021).
  29. Rayaprolu, S., et al. Cell type-specific biotin labeling in vivo resolves regional neuronal and astrocyte proteomic differences in mouse brain. Nat Commun. 13, 2927(2022).
  30. Uckun, E., et al. In vivo profiling of the alk proximitome in the developing Drosophila brain. J Mol Biol. 433 (23), 167282(2021).
  31. Xiong, Z., et al. In vivo proteomic mapping through gfp-directed proximity-dependent biotin labelling in zebrafish. Elife. 10, e64631(2021).
  32. Holzer, E., Rumpf-Kienzl, C., Falk, S., Dammermann, A. A modified turboid approach identifies tissue-specific centriolar components in C. elegans. PLoS Genet. 18 (4), e1010150(2022).
  33. Artan, M., et al. Interactome analysis of Caenorhabditis elegans synapses by turboid-based proximity labeling. J Biol Chem. 297 (3), 101094(2021).
  34. Zhang, Y., et al. Turboid-based proximity labeling reveals that ubr7 is a regulator of n nlr immune receptor-mediated immunity. Nat Comm. 10 (1), 3252(2019).
  35. Baumgartner, L., et al. The Drosophila zad zinc finger protein kipferl guides rhino to pirna clusters. eLife. 11, e80067(2022).

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