本研究建立了基于TurboID的果蝇（D. melanogaster）卵巢邻近标记（PL）的详细实验方案，涵盖从生物素补充、卵巢解剖到转基因表达验证以及用于质谱分析的生物素化肽段富集的全部步骤。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
邻近标记（proximity labeling, PL）是一种用于绘制蛋白质-蛋白质相互作用网络的强有力方法。标记酶技术的进步，尤其是TurboID的发展，极大地拓展了该方法在各类生物系统中的应用。TurboID因其稳定性高、无毒性且操作简便，特别适用于体内（in vivo）研究。该酶在生物素存在条件下，可在约10 nm范围内非特异性地对邻近的生物分子（包括蛋白质和核酸）进行生物素标记。我们应用该方法研究了Zucchini（Zuc）的相互作用组，Zuc是黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）卵巢生殖细胞线粒体外膜（OMM）上piwi相互作用RNA（piRNA）生成过程中的关键因子。通过在生殖细胞中表达Zuc-TurboID并补充生物素，我们诱导了Zuc邻近蛋白质的生物素化。在富集生物素化肽段后进行质谱分析，鉴定了与Zuc空间位置接近的蛋白质，其中包括已知参与piRNA生成的相互作用蛋白。值得注意的是，我们还发现了Zuc的新相互作用蛋白，这些蛋白参与蛋白质折叠、膜结构组织以及囊泡运输过程。
引言
传统的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）作图方法，如亲和纯化-质谱法（AP-MS）和酵母双杂交（Y2H）系统，通常难以捕获低丰度、瞬时表达或膜结合的蛋白质。这一局限性源于这些方法无法模拟活细胞内的天然生理环境1,2,3。为克服这些挑战，邻近标记（PL）技术应运而生，成为一种可在活体中实现亚细胞器水平高分辨率蛋白质组作图的有力手段。in vivo条件下，PL利用诱饵蛋白与一种广谱性酶的融合，使该酶能够催化生成短寿命的活性分子1。这些活性分子（如生物素）可在数纳米范围内共价标记融合蛋白附近的蛋白质4。随后，通过质谱分析分离得到的生物素标记蛋白，从而实现大规模的蛋白质鉴定5,6。
近年来，已开发出多种广谱酶以推动PL技术的发展。其中两种广泛使用的酶是 大肠杆菌衍生的R118G突变型生物素连接酶（BioID）和豌豆来源的抗坏血酸过氧化物酶2（APEX2）。BioID将生物素和ATP转化为生物素化-5'-腺苷酸（bioAMP）
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 成虫果蝇中的PL
- 生物素食品的制备
- 通过将10 M NaOH储备液用三蒸水（TDW）稀释，配制1 M NaOH溶液，室温（RT）保存。将0.0049 g生物素粉末溶于20 mL三蒸水（TDW）中，配制1 M生物素储备液。加入150–200 µL 的 1 M NaOH 以提高生物素的溶解度。涡旋振荡使溶液均匀。将生物素储备液储存于 4 ℃ °C.
- 从试剂管中取出果蝇食物，放入微波炉加热2分钟，直至完全融化。
注意：标准果蝇培养基含有5%玉米粉、3%酵母、10%蔗糖、1%琼脂、0.3%丙酸和0.3%对羟基苯甲酸甲酯13. - 将生物素储备液加入融化的食物中，终浓度为100 µM，然后涡旋混匀。立即使用血清移液管将4.5 mL添加了生物素的食物分装至每个空瓶中。让食物冷却30分钟，盖上棉塞，然后将添加生物素的食物在4℃保存 °C.
注意：必须在食物冷却凝固前加入生物素。
- 生物素喂养
- 将过表达 TurboID 融合蛋白的转基因果蝇与组织或细胞特异性的 GAL4 果蝇杂交14,15,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
示例结果如图所示 图1, 图2, 图3, 图4 此前由 Nguyen 等人发表20. 图1 展示了基于TurboID的邻近标记（PL）实验流程 果蝇 卵巢。首先构建了一个融合Zuc与TurboID的表达载体（Zuc-V5-TurboID）。同时，将已知定位于特定亚细胞器的标志性蛋白——核输出信号蛋白（NES）和线粒体外膜转位酶（Tom20）——也分别与TurboID融合（NES-V5-TurboID和Tom20-V5-TurboID）。其中，NES-V5-TurboID用于生物素标记胞质蛋白，作为阴性对照；而Tom20-V5-TurboID则作为阳性对照，用于标记线粒体外膜（OMM）的蛋白质组。将过表达这些转基因.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文提供了一种在黑腹果蝇（Drosophila）卵巢中进行基于TurboID的邻近标记（PL）的完整实验流程，该流程经过大量排查优化，以克服多种技术挑战。其中一个关键问题涉及遗传构建体的设计，不同的融合结构显著影响了蛋白表达水平和生物素化效率。例如，NES-V5-TurboID的表达水平和生物素化效果弱于其他转基因形式，有时会干扰下游实验结果的解读。然而，将核输出信号（NES）融合至TurboID的C末端所构建的改良型载体（V5-TurboID-NES）表现出更强的表达水平和更高的生物素化效率。这些结果强调了在研究早期优化目的基因（GOI）排列方式以实现有效细胞表达的重要性。可利用现有的生物信息学工具预测目标蛋白与TurboID之间的结构兼容性；或者，建议构建并比较多种转基因构型（如N末端与C末端融合）。另一个重要挑战是质谱（MS）结果中持续出现聚乙二醇（PEG）峰污染，这类污染通常来源于塑料离心管和去垢剂21。一旦引入，PEG污染可能干扰肽段离子化过程，增加质谱数据分析难度，并可能长期损害质谱仪器。在我们的实验中，使用有机溶剂洗脱肽段似乎会增加磁珠释放的类PEG物质污染.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢实验室成员的讨论与帮助。本工作由韩国政府（MSIT）资助的国家研究基金会（NRF）支持（M.L. 项目编号 RS-2024-00345327；M.L. 项目编号 RS-2023-00219563）。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>抗体 | |||
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗 | Invitrogen | 31430 | 分析纯，避光 |
| 山羊抗兔IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32731 | 分析纯，避光 |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（H+L）二抗 | Invitrogen | 31460 | 分析纯，避光 |
| HSP90 抗体（兔） | 细胞信号技术公司 | 4874 | 多克隆抗体 |
| Pierce 链霉亲和素蛋白，HRP | 赛默飞世尔科技 | 21126 | 分析纯 |
| 链霉亲和素，Alexa Fluor 594 标记物 | Invitrogen | S11227 | 对光敏感，分析纯 |
| V5标签抗体（小鼠） | Invitrogen | R960-25 | 单克隆抗体 |
| V5标签抗体（兔）（D3H8Q） | 细胞信号技术公司 | 13202 | 单克隆抗体 |
| <强>果蝇品系 | <强>公司 | <强>货号 | <强>评论/描述 |
| pUASp Tom20 V5-TurboID/TM3 | 韩国果蝇品系中心 | 2373-2 | 果蝇品系 |
| pUASp Zucchini V5-TurboID/Cyo | 韩国果蝇品系保藏中心 | 2188 | 果蝇品系 |
| pUASP_attB_V5-TurboID-NES/Cyo | 韩国果蝇品系中心 | 2635-4 | 果蝇品系 |
| w[*]; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2H | 布卢明顿果蝇品系中心 | 7062 | 果蝇品系 |
| <强>设备与耗材 | <强>公司 | <强>货号 | <强>评论/描述 |
| 分析天平 | Mettler Toledo | ME204 | 0.1 mg 可读性 |
| Amersham Protran 0.45 NC 硝酸纤维素 Western 印迹膜（300 mm） × 4 m | Cytiva | 10600002 | - |
| Axygen 1.7 mL MaxyClear Snaplock 微量离心管 | 康宁 | MCT-175-C | 共聚物 |
| BRAND 盖玻片（22 mm × 22 mm） | Sigma-Aldrich | BR470055 | 硼硅酸盐玻璃 |
| 批量移液器吸头（10 µL | 顶点 | 4110N00 | 丙烯 |
| 批量移液器吸头（1000 µL | 顶点 | 4330N00 | 丙烯 |
| 批量移液器吸头（200 µL | 顶点 | 4230N00 | 丙烯 |
| 细胞培养板（96孔） | SPL | 300096 | 聚苯乙烯，平底型 |
| 离心机（配有适用于1.5-2 mL离心管的转子） | Eppendorf | 5424 R | 固定角度，带制冷功能 |
| 离心机（配备可容纳 5 mL 管的转子） | Eppendorf | 5425 R | 固定角度，带制冷功能 |
| 化学勺 | - | - | 不锈钢 |
| ChemiDoc 成像系统 | 伯乐（Bio-Rad） | 12003153 | Western blot 成像系统 |
| CO2 果蝇培养垫 | - | - | 麻醉板 |
| CO2 储液罐 &和调节剂 | - | - | 高压气体警示 &和头晕 |
| 小型培养箱 | JSR | JSGI-10T | 注意高温 |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | 蔡司 | LSM 710 | 强激光束警示 |
| 锥形管（15 mL） | SPL | 50015 | 聚丙烯/高密度聚乙烯 |
| 锥形管（50 mL） | SPL | 50050 | 聚丙烯/高密度聚乙烯 |
| 电子天平 | - | - | - |
| 数字计时器 | - | - | - |
| 解剖皿 | - | - | 硅 |
| Dumont #5SF 镊子 | Fine Science Tools | 11252-00 | 超细尖端，注意锐器安全 |
| DynaMag-2 磁力架 | Invitrogen | 12321D | 适用于1.5–2 mL规格的微量离心管 |
| Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片（25 mm × 75 mm） | Fisher Scientific | 12-550-15 | 注意尖锐物品 |
| 果蝇培养瓶（带纸塞） | Hansol Tech | FFB-21010 | - |
| 果蝇培养管（带棉塞） | Hansol Tech | FFV-11010 | - |
| 聚焦超声波破碎仪 | Covaris | M220 | 超声波使用注意事项 |
| 凝胶切割刀 | Invitrogen | EI9010 | 不锈钢配塑料手柄 |
| 3MM 级别的印迹纸（46 厘米） × 57 厘米 | Cytiva | 3030-917 | 沃特曼滤纸 |
| 手持式匀浆器和塑料研杵 | Kimble | 749540-0000 | 无线电机 |
| 加热块 | 精细PCR | ALB6400 | 注意高温 |
| 无绒布 | Yuhan-Kimberly | 41112 | - |
| 液氮 | - | - | 注意冻伤与烧伤风险 |
| 微孔板分光光度计 | 安捷伦科技 | 时期 | 基于单色仪的光学系统 |
| 微波 | - | - | 注意高温 |
| milliTUBE 1 mL AFA 纤维 | Covaris | PN 520135 | 玻璃 |
| 迷你凝胶电泳槽 | 赛默飞世尔科技 | A25977 | 注意高温 |
| NuPAGE Bis-tris 小型蛋白凝胶，4–12%, 1.0–1.5 mm，10孔 | Invitrogen | NP0323BOX | 含聚丙烯酰胺，注意毒性 |
| NuPAGE Bis-tris 小型蛋白凝胶，4–12%, 1.0–1.5 mm，15孔 | Invitrogen | NP0321BOX | 含有聚丙烯酰胺，注意毒性 |
| 画笔（Ø 1.8 mm | Hwa hong | 791240 | - |
| Pipetman L (P1000L) | Gilson | FA10006M | 带金属弹射器的单通道微量移液器 |
| Pipetman L (P200L) | Gilson | FA10005M | 带金属弹射器的单通道微量移液器 |
| Pipetman L (P20L) | Gilson | FA10003M | 带金属弹射器的单通道微量移液器 |
| Pipetman L（P2L） | Gilson | FA10001M | 带金属弹射器的单通道微量移液器 |
| 电源供应 | 主要科学领域 | MP-310 | 注意高压电 |
| 可编程旋转仪 | Biosan | RS-24 | - |
| 蛋白质防吸附管 管 | Eppendorf | 30108302 | - |
| 剃刀刀片 | Dorco | 304020 | 不锈钢，小心锐器 |
| 滚轴 | - | - | - |
| 10 mL 血清移液管 | SPL | 91010 | 聚苯乙烯 |
| 血清移液管（25 mL） | SPL | 91025 | 聚苯乙烯 |
| 5 mL 血清移液管 | SPL | 91005 | 聚苯乙烯 |
| 血清移液管（50 mL） | SPL | 91050 | 聚苯乙烯 |
| 低吸附带盖微量离心管（1.5 mL） | 赛默飞世尔科技 | 3451PK | 聚丙烯 |
| 海绵垫 | Invitrogen | EI9052 | - |
| 体视显微镜 | 蔡司 | Stemi 508 | - |
| 体视显微镜 | Leica | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | 1.5 &和5 mL大小的块状物 |
| 镊子 | Aven Tools | 18526 | 塑料平头尖端 |
| 涡旋混合器 | 科学工业公司 | SI-0236 | - |
| XCell II 转膜模块 | Invitrogen | EI9051 | 注意高温 |
| XCell SureLock mini-cell | Invitrogen | EI0001 | 注意高温危险 |
| <强>化学品 | <强>公司 | <强>货号 | <强>评论/描述 |
| 丙酮 | Sigma-Aldrich | 650501 | 分析纯 |
| 乙腈 | Supelco | 1.00029.1000 | LC-MS级，注意吸入毒性和易燃性 |
| 白蛋白标准安瓿瓶（含牛血清白蛋白（BSA）2 mg/mL，溶于0.9%生理盐水并添加0.05%叠氮化钠） | 赛默飞世尔科技 | 23209 | Pierce BCA 蛋白检测试剂盒（Thermo Scientific，23225）的一部分 |
| 牛血清白蛋白 | Bioshop | ALB001 | 分析纯 |
| 碳酸氢铵 | Sigma-Aldrich | 09830 | 分析纯 |
| 生物素 | Sigma-Aldrich | B4639 | 细胞 &以及组织培养级 |
| 氯化钙（CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | 细胞培养级 |
| Clarity Western ECL 底物 | 伯乐（Bio-Rad） | 1705060 | 分析纯 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | MBD0015 | 对光敏感，分析纯 |
| 二硫苏糖醇（DTT） | 赛默飞世尔科技 | R0861 | 分析纯 |
| 胎牛血清 | 康宁 | 35-015-CV | 细胞培养级 |
| 甲酸 | Sigma-Aldrich | F0507 | 试剂级，注意吸入毒性 |
| Grace昆虫培养基 | Gibco | 11595030 | 细胞培养级 |
| 即食干酵母 | 无品牌 | N1019 | - |
| 碘乙酰胺 | Sigma-Aldrich | I1149 | 对光敏感，分析纯 |
| 甲醇 | Carlo Erba | 41484 | 分析纯 |
| 指甲油 | - | - | Clear-type |
| Novex Tris-甘氨酸 SDS 样品缓冲液（2X） | Invitrogen | LC2676 | 分析纯 |
| NuPAGE MOPS SDS 电泳缓冲液（20X） | Invitrogen | NP0001 | 分析纯 |
| PageRuler 预染蛋白质标准品 | 赛默飞世尔科技 | 26616 | 分析纯 |
| 苯甲基磺酰氟 | 赛默飞世尔科技 | 36978 | 分析纯 |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | P4417 | 分析纯 |
| Pierce 16% 甲醛（w/v） | 赛默飞世尔科技 | 28908 | 分析纯，避光 |
| Pierce BCA 蛋白检测试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | 23225 | 分析纯 |
| Pierce BCA 试剂A（含有碳酸钠、碳酸氢钠、双辛可宁酸和酒石酸钠的0.1 M氢氧化钠溶液） | 赛默飞世尔科技 | 23228 | Pierce BCA 蛋白质定量试剂盒（Thermo Scientific，23225）的一部分 |
| Pierce BCA 试剂 B（含4%硫酸铜） | 赛默飞世尔科技 | 1859078 | Pierce BCA 蛋白质检测试剂盒（Thermo Scientific，23225）的一部分 |
| 丙酸 | Sigma-Aldrich | 402907 | ACS级 |
| 蛋白酶抑制剂混合物套装 III | Calbiochem | 539134 | 细胞 &及组织培养级 |
| SlowFade Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | S36936 | 光敏感的 |
| 氯化钠（NaCl） | Bioneer | C-9025 | 分析纯 |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma-Aldrich | D6750 | 分析纯 |
| 十二烷基硫酸钠 | Sigma-Aldrich | 71736 | 分子生物学级 |
| 氢氧化钠（NaOH） | Biosesang | SR2018-100-00 | 分析纯 |
| 三蒸水 | - | - | 超纯（一级） |
| Tris缓冲盐水 | Sigma-Aldrich | 94158 | 分析纯 |
| Tris-甘氨酸转移缓冲液 | Koma Biotech | K0341001 | 分析纯 |
| Tris-HCl，pH 8 | Bioneer | C-9006 | 分析纯 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | 分子生物学级 |
| 胰蛋白酶 | 赛默飞世尔科技 | 20233 | 细胞培养级 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 分子生物学级别 |
| 尿素 | Sigma-Aldrich | U5378 | 分子 &和细胞培养级 |
参考文献
- Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: Proximity-based labeling of proteins in living cells. Trend Cell Biol. 26 (11), 804-817 (2016).
- Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
