采用两步消化法分离和培养多囊肝病小鼠的原代胆管上皮细胞

摘要

本方案描述了一种优化的两步消化法，用于从野生型小鼠及多囊肝病小鼠中分离高纯度、高活力的原代胆管上皮细胞。

摘要

在本实验方案中，我们优化了一种两步消化法，用于从野生型小鼠及多囊肝病（PLD）小鼠中分离高纯度、高活力的原代胆管上皮细胞。小鼠麻醉后，经下腔静脉灌注50 mL溶液A，随后在37 °C下灌注30 mL溶液B，以酶解肝脏组织。通过机械解离、振荡和显微解剖去除贴壁的实质细胞，保留完整的胆道系统。将胆道系统充分剪碎后，在37 °C下振荡消化60分钟。所得单细胞悬液使用70 µm细胞筛网收集。采用免疫磁珠法纯化胆管上皮细胞：将细胞悬液在4 °C下与抗EpCAM抗体旋转孵育45分钟，随后加入Protein G磁珠，继续在4 °C下旋转孵育45分钟。经PBS洗涤三次后，使用磁力分离器收集胆管上皮细胞。纯化后的原代胆管上皮细胞重悬于胆管上皮细胞培养基中，并接种至预先涂有1 mg/mL I型大鼠尾胶原蛋白的细胞培养皿中。通过免疫荧光染色检测胆管上皮细胞特异性标志物细胞角蛋白-19（CK19）以确认细胞纯度。尽管本研究重点为从野生型和PLD小鼠中分离原代胆管上皮细胞，但我们确信该方案亦可适用于其他疾病小鼠模型。这一详细的两步消化方法有助于 体外 胆道疾病研究及靶向治疗的开发。

引言

胆管细胞是衬在肝内胆道树上的上皮细胞，形成单层结构，约占肝脏总细胞群体的3-5%¹。这些细胞在肝脏内相互连接，构成复杂的三维导管网络²。在正常情况下，胆管细胞执行多种重要功能，包括分泌、吸收、损伤修复以及作为免疫屏障，在肝脏生理和病理过程中发挥关键作用。然而，胆管细胞功能障碍可导致多种疾病，包括肝囊性病变（PLD）、原发性硬化性胆管炎、胆管癌以及胆汁淤积性肝损伤^3,4,5。

在胆管病变相关疾病中，PLD 是一种以胆管上皮细胞来源的大量充满液体的囊肿形成为特征的遗传性疾病。这些囊肿的进行性增大显著降低了患者的生活质量⁶。目前针对 PLD 的治疗手段仍然不足，疗效有限，且常伴随较高的复发率和并发症发生率⁷。这凸显了开发安全有效治疗策略的迫切性，以满足 PLD 管理中尚未解决的临床需求。

胆道疾病（包括PLD）的发病机制研究因缺乏合适的细胞系而受到严重阻碍。为克服这一局限，可采用疾病小鼠模型，并从这些模型中分离原代胆管细胞用于研究 体外....

方案

所有小鼠护理和实验方案均经天津医科大学伦理委员会批准（文件编号：TMUa-MEC 2022016）。

1. 仪器与溶液的准备

1. 在细胞分离前至少1天，通过高压灭菌对手术器械（剪刀、镊子和手术刀柄）进行灭菌。
2. 在细胞分离前至少1天，使用表1中列出的试剂配制胆管上皮细胞培养基。通过0.22 µm滤膜过滤对该培养基进行灭菌。
3. 在细胞分离前至少1天，使用表2中列出的试剂配制用于小鼠肝脏灌注的溶液A和溶液B。通过高压灭菌或0.22 µm滤膜过滤对溶液A和溶液B进行灭菌，并在温和搅拌下使用无菌NaOH调节其pH至7.35。
   注意：胆管上皮细胞培养基、溶液A和溶液B可在4°C下保存至少一个月。
4. 实验开始前，将胶原酶II粉末加入溶液B中，轻轻混匀，使其终浓度达到0.5 mg/mL。使用前将溶液A和溶液B在37 °C水浴中预热。
5. 实验开始前立即准备好盛有无菌PBS的6 cm培养皿，并将其置于冰上，以确保操作过程中保持低温。

2. 肝组织消化灌注

1. 使用过量异氟烷吸入法对小鼠进行麻醉。将麻醉后的小鼠置于仰卧位，并用胶带固定，以方便操作。
2. ....

结果

用于分离胆管上皮细胞的两步消化法工作流程图如图1所示。整个操作过程耗时约5 h。首先，通过下腔静脉灌注溶液A以清除血液，肝脏颜色变浅即为血液清除的标志。随后，使用含II型胶原酶的溶液B灌注肝脏，以启动组织消化。该初始消化步骤对时间较为敏感，消化成功的标志是组织明显变软。接下来，通过机械解离并使用弯头镊子轻轻振荡，以去除肝细胞；当大量肝细胞脱落时，表明消化程度恰当。在解剖显微镜下，通过显微解剖仔细去除残留的贴壁实质细胞，从而保留完整的胆道系统（图2）。

在第二次消化步骤中，组织被分解成单细胞悬液，其中仍含有部分肝细胞和成纤维细胞。最后，通过免疫磁珠分离法从该悬液中获得高纯度的胆管上皮细胞。采用台盼蓝染色结合血细胞计数板进行细胞活力评估。结果显示成功分离出高活力的胆管上皮细胞（图3

讨论

本方案提供了一种通过两步消化法从小鼠中分离高纯度原代胆管上皮细胞的详细方法，可用于研究胆管病变的分子机制。为成功分离胆管上皮细胞，多个关键步骤至关重要。

第一个关键步骤是使用溶液A和溶液B确保有效的灌注和消化。溶液A成功灌注的标志是肝脏颜色变苍白，溶液B成功消化的标志是肝组织明显变软。灌注失败将阻碍肝组织的消化，并影响后续胆道系统的分离。为提高消化效率，可增加溶液A和溶液B的用量，降低灌注流速，或用棉签轻轻按压肝脏。

第二个关键步骤是使用弯头镊子对肝组织进行机械解离并轻轻振荡，随后在解剖显微镜下进行显微解剖，以去除附着的实质细胞并分离出完整的胆管树。该步骤对于获得高纯度的胆管上皮细胞至关重要。在振荡过程中用弯头镊子夹住较大的胆管，并用冷的PBS冲洗，可提高操作效率。如果肝脏消化充分，大量肝细胞会脱落，使得显微解剖相对简便。然而，若消化不完全且样本珍贵，则显微解剖过程将需要耗费大量精力，增加工作负担，并可能降低细胞得率和纯度。因此，确保使用溶液B对肝脏进行充分灌注以实现有效消化极为关键。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 μm 滤膜	PALL	4612
0.25% 胰蛋白酶	Gibco	25200-056
10 mL 注射器	KONSMED	10 mL 1.2*30TWLB
20 mL 注射器	KONSMED	20 mL 1.2*30TWLB
24 G 静脉导管	WEGO	24GX19  mm/Y-G
3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸	Sigma	T5516	1.7 mg/mL 储存液
4% 多聚甲醛	Solarbio	P1110
5 mL 注射器	KONSMED	5 mL 0.7*30TWLB
6 cm 培养皿	Thermo Scientific	150462
70 µm 细胞筛	Corning	352350
抗 CK19 抗体	DSHB	TROMA-III
抗 EpCAM 抗体	DSHB	G8.8
BSA	Solarbio	A8020
CaCl2	Sangon Biotech	A501330	2 M 储存液
化学成分明确的脂质浓缩液（100 倍）	Gibco	11905-031
胶原酶 II	Worthington	LS004176
胶原酶 XI	Sigma	C7657	3.2 mg/mL 储存液
地塞米松	Sigma	D1756	10 mg/mL 储存液
解剖显微镜	Leica	EZ4
DMEM/F12 (1:1)	VivaCell biosciences	C3130-0500
DMSO	Sigma	D2650
DNase I	Sigma	D4513	10 U/μL 储存液
驴抗大鼠 Alexa Fluor 488 二抗	Invitrogen	A21208
EGTA	Solarbio	E8050	50 mM (pH = 8) 储存液
表皮生长因子（1 mg/mL）	Sigma	SRP3196
乙醇胺	Sigma	E9508
胎牛血清	VivaCell biosciences	C04001-500
佛波醇酯	Sigma	F3917	20 mM 储存液
庆大霉素/两性霉素溶液（500 倍）	Gibco	R01510
血细胞计数板	QIUJING	XB.K.25.
HEPES	Sigma	H4034
透明质酸酶	Sigma	H3506	10 mg/mL 储存液
胰岛素-转铁蛋白-硒（100 倍）	Gibco	41400045
异氟烷	RWD	R510-22-10
KCl	Sangon Biotech	A100395
L-谷氨酰胺（200 mM）	Sigma	G7513
磁力分离器	Promega	Z5342
MEM 非必需氨基酸（100 倍）	Gibco	11140050
MEM 维生素溶液（100 倍）	Gibco	11120052
MgCl2	Sangon Biotech	A100288	1.5 M 储存液
丙酮酸钠 （100 mM）	Gibco	11360070
Na2HPO4	Sangon Biotech	A600487
NaCl	Sangon Biotech	A610476
NaOH	Sangon Biotech	A620617	1 N 储存液
PBS	VivaCell biosciences	C3580-0500
PBS	Solarbio	P1010
青霉素-链霉素（100 倍）	Gibco	15140-122
蠕动泵	BaodingRongbai	YZ1515PPS
Protein G 琼脂糖珠	Invitrogen	10004D
旋转混匀仪	Kylin-Bell	QB-528
RPMI	VivaCell biosciences	C3010-0500
大豆胰蛋白酶抑制剂	Sigma	T6522	10 mg/mL 储存液
压接式针头	Jinhuan Medical	HM601
曲拉通 X-100	Solarbio	T8200
台盼蓝	Sigma	T6146	10 mg/mL 储存液
Ⅰ型大鼠尾胶原	BD	354236