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方法文章

采用两步消化法分离和培养多囊肝病小鼠的原代胆管上皮细胞

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DOI：

10.3791/68202

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2025年5月16日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Oncology, Tianjin First Central Hospital, School of Medicine, Nankai University, 2The Province and Ministry Co-sponsored Collaborative Innovation Center for Medical Epigenetics, Key Laboratory of Immune Microenvironment and Disease (Ministry of Education), State Key Laboratory of Experimental Hematology, Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University

本文内容

摘要

本方案描述了一种优化的两步消化法，用于从野生型小鼠及多囊肝病小鼠中分离高纯度、高活力的原代胆管上皮细胞。

摘要

在本实验方案中，我们优化了一种两步消化法，用于从野生型小鼠及多囊肝病（PLD）小鼠中分离高纯度、高活力的原代胆管上皮细胞。小鼠麻醉后，经下腔静脉灌注50 mL溶液A，随后在37 °C下灌注30 mL溶液B，以酶解肝脏组织。通过机械解离、振荡和显微解剖去除贴壁的实质细胞，保留完整的胆道系统。将胆道系统充分剪碎后，在37 °C下振荡消化60分钟。所得单细胞悬液使用70 µm细胞筛网收集。采用免疫磁珠法纯化胆管上皮细胞：将细胞悬液在4 °C下与抗EpCAM抗体旋转孵育45分钟，随后加入Protein G磁珠，继续在4 °C下旋转孵育45分钟。经PBS洗涤三次后，使用磁力分离器收集胆管上皮细胞。纯化后的原代胆管上皮细胞重悬于胆管上皮细胞培养基中，并接种至预先涂有1 mg/mL I型大鼠尾胶原蛋白的细胞培养皿中。通过免疫荧光染色检测胆管上皮细胞特异性标志物细胞角蛋白-19（CK19）以确认细胞纯度。尽管本研究重点为从野生型和PLD小鼠中分离原代胆管上皮细胞，但我们确信该方案亦可适用于其他疾病小鼠模型。这一详细的两步消化方法有助于 体外 胆道疾病研究及靶向治疗的开发。

引言

胆管细胞是衬在肝内胆道树上的上皮细胞，形成单层结构，约占肝脏总细胞群体的3-5%1。这些细胞在肝脏内相互连接，构成复杂的三维导管网络2。在正常情况下，胆管细胞执行多种重要功能，包括分泌、吸收、损伤修复以及作为免疫屏障，在肝脏生理和病理过程中发挥关键作用。然而，胆管细胞功能障碍可导致多种疾病，包括肝囊性病变（PLD）、原发性硬化性胆管炎、胆管癌以及胆汁淤积性肝损伤3,4,5。

在胆管病变相关疾病中，PLD 是一种以胆管上皮细胞来源的大量充满液体的囊肿形成为特征的遗传性疾病。这些囊肿的进行性增大显著降低了患者的生活质量6。目前针对 PLD 的治疗手段仍然不足，疗效有限，且常伴随较高的复发率和并发症发生率7。这凸显了开发安全有效治疗策略的迫切性，以满足 PLD 管理中尚未解决的临床需求。

胆道疾病（包括PLD）的发病机制研究因缺乏合适的细胞系而受到严重阻碍。为克服这一局限，可采用疾病小鼠模型，并从这些模型中分离原代胆管细胞用于研究 体外 实验已证明对于揭示胆道疾病潜在的分子机制并确定可能的治疗策略具有重要价值。

在我们最近的一项研究8中，我们利用Pkd1条件性敲除（KO）小鼠成功建立了PLD小鼠模型。在Pkd1基因删除后1个月即可观察到肝囊肿，并且其大小随时间推移逐渐增大。尽管已有文献详细记载了从大鼠和人分离胆管上皮细胞的方案9,10，但由于小鼠体积较小以及门静脉和胆道系统的结构复杂，从小鼠分离原代胆管上皮细胞仍然极具挑战性。现有方法存在诸多局限性，包括细胞纯度低、存活率差、操作流程复杂以及成本高昂11,12。

本文提供了一种利用两步消化法从小鼠中分离高纯度原代胆管上皮细胞的详细实验方案。该优化方法旨在支持 体外 研究，促进对胆道疾病分子机制的探究，并推动新型治疗策略的开发。

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方案

所有小鼠护理和实验方案均经天津医科大学伦理委员会批准（文件编号：TMUa-MEC 2022016）。

1. 仪器与溶液的准备

  1. 在细胞分离前至少1天，通过高压灭菌对手术器械（剪刀、镊子和手术刀柄）进行灭菌。
  2. 在细胞分离前至少1天，使用表1中列出的试剂配制胆管上皮细胞培养基。通过0.22 µm滤膜过滤对该培养基进行灭菌。
  3. 在细胞分离前至少1天，使用表2中列出的试剂配制用于小鼠肝脏灌注的溶液A和溶液B。通过高压灭菌或0.22 µm滤膜过滤对溶液A和溶液B进行灭菌，并在温和搅拌下使用无菌NaOH调节其pH至7.35。
    注意：胆管上皮细胞培养基、溶液A和溶液B可在4°C下保存至少一个月。
  4. 实验开始前，将胶原酶II粉末加入溶液B中，轻轻混匀，使其终浓度达到0.5 mg/mL。使用前将溶液A和溶液B在37 °C水浴中预热。
  5. 实验开始前立即准备好盛有无菌PBS的6 cm培养皿，并将其置于冰上，以确保操作过程中保持低温。

2. 肝组织消化灌注

  1. 使用过量异氟烷吸入法对小鼠进行麻醉。将麻醉后的小鼠置于仰卧位，并用胶带固定，以方便操作。
  2. 用75%乙醇对小鼠腹部消毒后，打开腹腔，使用压接针在下腔静脉上打一个滑结。用20 mL注射器吸取溶液A冲洗24 G静脉导管。
  3. 将静脉导管插入滑结下方的下腔静脉，收紧滑结，并用胶带固定导管位置。
  4. 使用20 mL注射器以10 mL/min的灌注速率经下腔静脉向肝脏灌注50 mL溶液A，同时切开肝门静脉以排出灌注液。
  5. 使用蠕动泵以3.5 mL/min的流速继续用含有II型胶原酶的30 mL溶液B进行灌注。
    注意：此步骤用于消化肝组织。
  6. 取出灌注成功的肝组织，放入盛有冷的无菌PBS的6 cm培养皿中。

3. 胆管上皮细胞的分离

注意：由于正常小鼠的胆管上皮细胞数量相对较少，建议使用2-6只小鼠作为一组进行实验。然而，对于胆管上皮细胞异常增殖的小鼠疾病模型（如多囊肝病，PLD），单只小鼠的胆管上皮细胞已足够。除非另有说明，所有样本和试剂均需始终置于冰上，且所有操作应在生物安全柜中进行。

  1. 使用弯头镊子机械解离并轻轻振荡肝组织。随后在解剖显微镜下进行显微解剖，去除附着的实质细胞，保留完整的胆管树结构。在进入下一步之前，移除胆囊组织。
    用 PBS 洗涤组织两次。
  2. 使用手术刀将胆管树精细切碎，每只小鼠加入 3 mL 消化液（表 3），在 37 °C 条件下以 90 rpm 振荡消化 60 分钟。在消化 30 分钟时，使用移液器吸头轻轻吹打混合物，确保充分混匀。
    注意：消化液应在使用前新鲜配制。
  3. 将细胞悬液通过 70 µm 细胞筛过滤。使用 5 mL 或 10 mL 注射器的推杆轻轻将细胞悬液压过筛网。用 PBS 洗涤筛网。
  4. 在 4 °C 条件下，以 500 x g 离心 5 分钟。用 RPMI 培养基洗涤细胞三次。
  5. 再次在 4 °C 条件下，以 500 x g 离心 5 分钟。
  6. 弃去上清液，将细胞重悬于 900 µL 含 40 U/mL DNase I 的 RPMI 培养基中。加入 2 µg 抗 EpCAM 抗体，在 4 °C 条件下以 20 rpm 旋转孵育 45 分钟。
  7. 在 4 °C 条件下，以 500 x g 离心 5 分钟。
  8. 弃去上清液，将细胞重悬于 1 mL 含 40 U/mL DNase I 的 RPMI 培养基中。用 1 mL RPMI 培养基预洗涤 Protein G 磁珠。向细胞悬液中加入 20 µL Protein G 磁珠，在 4 °C 条件下以 20 rpm 旋转孵育 45 分钟。
    注意：抗 EpCAM 抗体也可预先与 Protein G 磁珠孵育，形成磁珠-抗体复合物，再加入细胞悬液。
  9. 使用磁力分离器用 PBS 洗涤细胞三次。
  10. 使用台盼蓝染色法（0.04%，3 分钟）在血细胞计数板上进行细胞计数和细胞活力评估。
    注意：无需在胆管上皮细胞培养前去除磁珠， 磁珠在培养开始后会自然脱落，且不会干扰细胞培养。

4. 胆管上皮细胞培养

注意：在胆管细胞培养前，需新鲜制备I型大鼠尾胶原包被的细胞培养皿。所有试剂均需预先在冰上预冷。

  1. 根据制造商说明书，将无菌 ddH2O、10x PBS、1 N NaOH 和 I 型大鼠尾胶原混合，制备终浓度为 1 mg/mL 的 I 型大鼠尾胶原（溶于 1x PBS）溶液。将该混合液均匀涂布于细胞培养皿表面，置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 30 分钟，使胶原凝固。
  2. 用预热的 PBS 清洗经 I 型大鼠尾胶原包被的细胞培养皿。
  3. 将胆管上皮细胞重悬于预热的胆管上皮细胞培养基中，接种至已包被 1 mg/mL I 型大鼠尾胶原的细胞培养皿中，在 37 °C、5% CO2 条件下培养，每 2 天更换一次培养基。

5. 胆管细胞的传代与冷冻保存

  1. 用 PBS 清洗胆管上皮细胞两次，然后将细胞在 37 °C 条件下用 0.25% 胰蛋白酶消化 5–10 分钟。
  2. 加入等体积的胆管上皮细胞培养基以中和胰蛋白酶，随后在 500 × g 条件下离心 5 分钟。
  3. 按照步骤 4.1 所述方法制备 I 型大鼠尾胶原包被的细胞培养皿。
  4. 执行步骤 4.2 和 4.3。
  5. 若需冷冻保存，将胆管上皮细胞重悬于冻存液（9:1 的 FBS: DMSO）中，并储存于 -80 °C 超低温冰箱或液氮中。根据需要解冻细胞以供后续使用。

6. 胆管细胞验证

注意：胆管细胞的纯度通过胆管细胞标志物CK19的染色进行评估。

  1. 用 PBS 清洗胆管上皮细胞 2 次，然后用 4% 多聚甲醛固定 15 分钟。
  2. 用 PBS 清洗胆管上皮细胞，然后用 1% Triton X-100 透化 8 分钟。
  3. 用 PBS 清洗胆管上皮细胞，然后用 5% BSA 封闭 1 小时。
  4. 用 PBS 清洗胆管上皮细胞，然后在 4 °C 下与抗 CK19 一抗（用 2% BSA 稀释至 1:12）孵育过夜。
  5. 用 PBS 清洗胆管上皮细胞 2 次，然后在室温下与驴抗大鼠 Alexa Fluor 488 二抗（用 PBS 稀释至 1:1,000）孵育 1 小时。
  6. 用 PBS 清洗胆管上皮细胞，加入 4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色 15 分钟，然后在显微镜下观察。

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结果

用于分离胆管上皮细胞的两步消化法工作流程图如图1所示。整个操作过程耗时约5 h。首先，通过下腔静脉灌注溶液A以清除血液，肝脏颜色变浅即为血液清除的标志。随后，使用含II型胶原酶的溶液B灌注肝脏，以启动组织消化。该初始消化步骤对时间较为敏感，消化成功的标志是组织明显变软。接下来，通过机械解离并使用弯头镊子轻轻振荡，以去除肝细胞；当大量肝细胞脱落时，表明消化程度恰当。在解剖显微镜下，通过显微解剖仔细去除残留的贴壁实质细胞，从而保留完整的胆道系统（图2）。

在第二次消化步骤中，组织被分解成单细胞悬液，其中仍含有部分肝细胞和成纤维细胞。最后，通过免疫磁珠分离法从该悬液中获得高纯度的胆管上皮细胞。采用台盼蓝染色结合血细胞计数板进行细胞活力评估。结果显示成功分离出高活力的胆管上皮细胞（图3

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讨论

本方案提供了一种通过两步消化法从小鼠中分离高纯度原代胆管上皮细胞的详细方法，可用于研究胆管病变的分子机制。为成功分离胆管上皮细胞，多个关键步骤至关重要。

第一个关键步骤是使用溶液A和溶液B确保有效的灌注和消化。溶液A成功灌注的标志是肝脏颜色变苍白，溶液B成功消化的标志是肝组织明显变软。灌注失败将阻碍肝组织的消化，并影响后续胆道系统的分离。为提高消化效率，可增加溶液A和溶液B的用量，降低灌注流速，或用棉签轻轻按压肝脏。

第二个关键步骤是使用弯头镊子对肝组织进行机械解离并轻轻振荡，随后在解剖显微镜下进行显微解剖，以去除附着的实质细胞并分离出完整的胆管树。该步骤对于获得高纯度的胆管上皮细胞至关重要。在振荡过程中用弯头镊子夹住较大的胆管，并用冷的PBS冲洗，可提高操作效率。如果肝脏消化充分，大量肝细胞会脱落，使得显微解剖相对简便。然而，若消化不完全且样本珍贵，则显微解剖过程将需要耗费大量精力，增加工作负担，并可能降低细胞得率和纯度。因此，确保使用溶液B对肝脏进行充分灌注以实现有效消化极为关键。

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到了天津市教育委员会资助项目（2022ZD054，授予 L.Z.）的支持

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 μm 滤膜PALL4612
0.25% 胰蛋白酶Gibco25200-056
10 mL 注射器KONSMED10 mL 1.2*30TWLB
20 mL 注射器KONSMED20 mL 1.2*30TWLB
24 G 静脉导管WEGO24GX19  mm/Y-G
3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸SigmaT55161.7 mg/mL 储存液
4% 多聚甲醛SolarbioP1110
5 mL 注射器KONSMED5 mL 0.7*30TWLB
6 cm 培养皿Thermo Scientific150462
70 µm 细胞筛Corning352350
抗 CK19 抗体DSHBTROMA-III
抗 EpCAM 抗体DSHBG8.8
BSASolarbioA8020
CaCl2Sangon BiotechA5013302 M 储存液
化学成分明确的脂质浓缩液（100 倍）Gibco11905-031
胶原酶 IIWorthingtonLS004176
胶原酶 XISigmaC76573.2 mg/mL 储存液
地塞米松SigmaD175610 mg/mL 储存液
解剖显微镜LeicaEZ4
DMEM/F12 (1:1)VivaCell biosciencesC3130-0500
DMSOSigmaD2650
DNase ISigmaD451310 U/μL 储存液
驴抗大鼠 Alexa Fluor 488 二抗InvitrogenA21208
EGTASolarbioE805050 mM (pH = 8) 储存液
表皮生长因子（1 mg/mL）SigmaSRP3196
乙醇胺SigmaE9508
胎牛血清VivaCell biosciencesC04001-500
佛波醇酯SigmaF391720 mM 储存液
庆大霉素/两性霉素溶液（500 倍）GibcoR01510
血细胞计数板QIUJINGXB.K.25.
HEPESSigmaH4034
透明质酸酶SigmaH350610 mg/mL 储存液
胰岛素-转铁蛋白-硒（100 倍）Gibco41400045
异氟烷RWDR510-22-10
KClSangon BiotechA100395
L-谷氨酰胺（200 mM）SigmaG7513
磁力分离器PromegaZ5342
MEM 非必需氨基酸（100 倍）Gibco11140050
MEM 维生素溶液（100 倍）Gibco11120052
MgCl2Sangon BiotechA1002881.5 M 储存液
丙酮酸钠 （100 mM）Gibco11360070
Na2HPO4Sangon BiotechA600487
NaClSangon BiotechA610476
NaOHSangon BiotechA6206171 N 储存液
PBSVivaCell biosciencesC3580-0500
PBSSolarbioP1010
青霉素-链霉素（100 倍）Gibco15140-122
蠕动泵BaodingRongbaiYZ1515PPS
Protein G 琼脂糖珠Invitrogen10004D
旋转混匀仪Kylin-BellQB-528
RPMIVivaCell biosciencesC3010-0500
大豆胰蛋白酶抑制剂SigmaT652210 mg/mL 储存液
压接式针头Jinhuan MedicalHM601
曲拉通 X-100SolarbioT8200
台盼蓝SigmaT614610 mg/mL 储存液
Ⅰ型大鼠尾胶原BD354236

参考文献

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