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方法文章

通过细胞分选分离肺部含视黄醇细胞

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DOI：

10.3791/68205

⸱

2025年4月11日

 ,  , 
1Department of Animal Sciences, School of Environmental and Biological Sciences, Rutgers, The State University of New Jersey, 2Undergraduate Program in Biochemistry, School of Environmental and Biological Sciences, Rutgers, The State University of New Jersey, 3Rutgers Center for Lipid Research, 4Rutgers Center for Environmental Exposures & Disease

本文内容

摘要

以下方案通过利用特定的类维生素A自体荧光并结合荧光激活细胞分选技术，提供了一种从高度异质性的肺细胞群体中分离含类维生素A细胞的简单而有效的方法。

摘要

类视黄醇（维生素A及其代谢物）是肺泡微环境中的重要脂质成分，特定细胞类型的类视黄醇代谢对于维持发育中及成年肺脏的功能健康至关重要。肺部细胞利用特定通路，高效摄取血液中以视黄醇（ROH）形式循环的类视黄醇，并在细胞内逐步将其转化为具有转录活性的类视黄醇分子——全反式维甲酸（all-转-视黄酸（ATRA）。ATRA介导的（或类视黄醇介导的）信号通路对于调控肺泡化、表面活性物质生成、血管生成、通透性及免疫功能至关重要。重要的是，某些特定肺细胞（包括成纤维细胞）能够以视黄酯（RE）的形式积累类视黄醇，并将其储存，或在需要时进一步转化为视黄醇（ROH），转移至邻近细胞。含有类视黄醇的肺细胞可通过消化肺组织获得的单细胞悬液，利用类视黄醇的自发荧光（在350 nm激发下于455 nm发射）结合荧光激活细胞分选（FACS）进行分离与收集。此外，基于细胞特异性 体内 用红色荧光蛋白标记肺细胞，可实现对特定含视黄醇的肺细胞群体进行分离和收集。所获得的细胞可直接用于分析，或进行培养以进一步研究细胞形态、基因表达以及对药物干预的响应。该分离与应用技术对于肺部健康和肺损伤动物模型研究具有重要意义，有助于深入理解肺组织中视黄醇代谢的细胞机制以及脂质介导的细胞间通讯。

引言

类维生素A（维生素A及其代谢物）是肺泡微环境的重要脂质成分，特定细胞类型的类维生素A代谢和信号传导对于维持发育中及成年肺脏的功能健康至关重要1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14。肺细胞利用特定通路，能够高效地从血液中摄取饮食来源的循环类维生素A，即视黄醇（ROH）15,16,17,18,19，随后在细胞内逐步将ROH转化为具有转录活性的类维生素A分子——全反式视黄酸（ATRA）20。ATRA介导的（或类维生素A介导的）信号传导通过ATRA与其三种特异性核激素受体——视黄酸受体（RARα、RARβ和RARγ21,22）——相互作用而实现，在调控肺泡化23,24,25,26,27,28,29、表面活性物质生成30,31,32,33,34,35、血管生成36、通透性37以及免疫反应38,39,40等方面发挥关键作用。尤为重要的是，某些特定肺细胞（尤其是肺成纤维细胞）能够以视黄酯（RE）的形式储存类维生素A，这些储存的RE可在需要时被动员转化为ROH，并转移至邻近细胞1。

视黄醇代谢与信号传导的复杂性以及肺部细胞的复杂性，使得旨在探索肺中视黄醇代谢的研究具有挑战性 体内 具有挑战性。我们已制定了一种简单且可靠的方案，用于分离含视黄醇类物质的细胞（图1利用特定的类维生素A自体荧光（在350 nm激发下于455 nm发射）并结合荧光激活细胞分选（FACS），可从高度异质性的肺细胞群体中分离出储存类维生素A的细胞。该方案无需额外的细胞标记，仅在研究目标为基于类维生素A储存能力分离和表征原代活肺细胞时，需进行活细胞染色。这显著缩短了细胞分选前的制备时间，避免了额外染色步骤，并可获得高产量的活原代细胞。然而，若研究目标为分离和表征特定的肺细胞亚群（如成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞或免疫细胞），可在使用细胞特异性抗体标记已分选的含类维生素A细胞后，进一步进行额外的细胞分选。

视黄醇自体荧光已在已发表的研究中用于确定含视黄醇细胞的身份和/或定量肝脏中这些细胞的丰度41,42,43,44，胰腺45,46肾脏41,47和肺41此外，多个研究团队报道了利用类视黄醇荧光通过FACS分离并研究来自活体组织（包括肝脏）的原代含类视黄醇细胞。44,48,49,50,51,52,53 和肺1在本实验方案中，我们展示了如何对特定细胞群体进行标记 体内 在使用tdTomato（红色荧光蛋白）分离含视黄醇的细胞之前。tdTomato的光谱特性（在554 nm激发时，发射波长为581 nm）54）和亮度不会干扰类视黄醇的自发荧光，因此在分选过程中便于实现细胞特异性。鉴于类视黄醇代谢及其信号传导在正常肺泡微环境中具有关键作用1, 所述的肺细胞分离技术是在肺部健康与疾病动物模型研究中一种有用的工具，可用于深入理解肺内视黄醇代谢的细胞机制及脂质介导的细胞间通讯 体内.

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方案

所有涉及小鼠的操作和实验均经罗格斯大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准（IACUC 编号：PROTO202200111），并依照美国国家科学院编制的《实验动物照护与使用指南》中规定的要求进行55。

1. 实验的注意事项与准备工作

  1. 动物饲养与操作
    注意：可使用三个月大（10–12 周龄）的雄性和雌性小鼠进行研究。卵磷脂：视黄醇酰基转移酶缺陷型小鼠（Lrat-缺陷的， Lrat-/- 小鼠56) 在 C57BL/6J 遗传背景下的同窝年龄匹配小鼠（野生型， Lrat+/+ 小鼠被用于所述实验。通过将携带tdTomato报告基因盒（B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor）的小鼠与特异性在成纤维细胞中表达tdTomato基因的小鼠（F-tdT小鼠）杂交，获得F-tdT小鼠模型。tm14(CAG-tdTomato)Hze/J，杰克逊实验室品系#007914）与Col1a2-CreER小鼠（B6.Cg-Tg(Col1a2-Cre/ERT,-ALPP)7Cpd/2J，杰克逊实验室品系#029567）杂交。
    1. 使用表达Cre的转基因小鼠模型，这是标记目标细胞群体的多种可选方法之一 体内.
      注意：根据靶细胞的选择、Cre 表达水平、Cre 介导重组的效率以及细胞特异性，研究人员可选用任何可靠的表达 Cre 的小鼠模型。
    2. 利用 tdTomato 转基因表达（通过如下所述的他莫昔芬处理）进行标记 Col1a2+ 成纤维细胞，随后通过以下所述方法从消化后的肺组织单细胞悬液中分离。
  2. Cre介导的重组与转基因激活 体内
    1. 通过腹腔注射（IP）给予F-tdT小鼠他莫昔芬，每次2 mg，每24小时一次，连续5天。
    2. 注射前用70%乙醇对注射部位进行消毒。末次他莫昔芬注射后1个月，将小鼠用于实验。
    3. 在分选实验前检测Cre重组的有效性。通过使用抗tdTomato抗体分离经他莫昔芬处理的F-tdT小鼠肺成纤维细胞靶细胞群，验证Cre重组的有效性及tdTomato的表达情况。Pdgfrα 磁珠和磁激活细胞分选（MACS）。
  3. 溶液、塑料器皿和玻璃器皿的准备
    注意：以下所述操作步骤应遵循无菌技术。溶液配制、组织消化和细胞分离等操作均应在超净工作台内进行。溶液需使用0.2 µm滤器过滤除菌；手术器械及实验耗材应通过高压灭菌进行消毒。
    1. 在超净工作台内，配制不含钙、镁的汉克斯平衡盐溶液（HBSS without Ca²⁺, Mg²⁺）。2+/毫克2+，含有 5.3 mM KCl、0.4 mM KH2PO4，4.2 mM NaHCO₃3，137.9 mM NaCl，0.3 mM Na2HPO4，5.6 mM D-葡萄糖）用于肺灌注（每只小鼠5 mL）。使用0.2 µm滤器过滤溶液以灭菌，并将溶液注入注射器中。
    2. 在超净工作台内，配制不含钙和镁的汉克斯平衡盐溶液（HBSS without Ca2+/毫克2+，含有 1.3 mM CaCl2，0.5 MgCl2·6H2O，0.4 mM MgSO₄4·7H2O，5.3 mM KCl，0.4 mM KH2PO4，4.2 mM NaHCO₃3，137.9 mM NaCl，0.3 mM Na2HPO4，含5.6 mM D-葡萄糖、0.3 mg/mL IV型胶原酶和1 mg/mL dispase，用于肺灌注（每只小鼠10 mL）。使用0.2 µm滤器过滤灭菌后，将溶液装入注射器中。
    3. 在超净工作台内，用含钙的HBSS进行配制2+/毫克2+，含0.3 mg/mL IV型胶原酶、1 mg/mL分散酶和5 mg/mL DNase I，用于肺组织消化（每只小鼠10 mL）。使用0.2 µm滤器过滤除菌，并将溶液装入注射器中。
    4. 在超净工作台内，向细胞培养皿（35 mm × 10 mm，每只小鼠取材的肺组织使用一个培养皿）中加入 2 mL 含钙的无菌 HBSS2+/毫克2+将含有 Ca 的 HBSS 的培养皿放置好2+/毫克2+ 置于冰上。

2. 肺脏灌注、消化及单细胞悬液的收集

  1. 通过腹腔注射给予小鼠麻醉混合剂，剂量为每千克体重100 mg氯胺酮和每千克体重10 mg赛拉嗪，以麻醉小鼠。
    注意：以下技术需要在麻醉条件下使用活体动物，以防止肺微血管内形成血凝块，否则可能限制酶对肺泡区域的进入，从而显著影响目标细胞群的后续分离。
  2. 通过脚趾夹捏反应确认小鼠是否处于深度无意识状态。无反应表明动物已充分麻醉，可进行后续操作。清除手术部位的浮毛及可见的污物或碎屑，并用70%酒精擦拭手术区域以消毒。
  3. 使用无菌外科器械打开腹腔和胸腔。剪开肋骨和膈肌以暴露肺和心脏。
    注意：开胸术将确保动物死亡，因为自主呼吸可能不再发生；若操作得当，从手术开始至完成开胸术需时约3分钟，随后动物将很快死亡。
  4. 剪断下腔静脉，并用吸收垫吸收流出的血液。
  5. 灌注肺脏 原位 通过右心室使用带有25 G × 1针头的10 mL注射器" 不含钙的无菌HBSS填充的针管，容量为5 mL2+/毫克2+如果灌注成功，肺组织会变为白色。
  6. 灌注肺脏 原位 使用带有25 G × 1的10 mL注射器" 含有10 mL无菌HBSS（含Ca）的注射器2+/毫克2+，含有 IV 型胶原酶（0.3 mg/mL）和分散酶（1 mg/mL）。
  7. 取出肺组织，转移至含有2 mL含钙的无菌HBSS的细胞培养皿（35 mm × 10 mm）中2+/毫克2+.
  8. 在超净工作台中，用无菌手术刀片（#20，适配#4刀柄）冲洗肺组织并将其切碎成小块。加入5 mL含钙HBSS，将切碎的肺组织转移至15 mL离心管中2+/毫克2+ 加入含有 0.3 mg/mL IV 型胶原酶、1 mg/mL dispase 和 5 mg/mL DNase I 的溶液至剪碎的组织中，并用 10 mL 血清移液管转移。用剩余的 5 mL 含 Ca²⁺ 的 HBSS 冲洗细胞培养皿，收集并转移残留的组织碎片2+/毫克2+ 含 0.3 mg/mL IV 型胶原酶、1 mg/mL dispase 和 5 mg/mL DNase I。
  9. 将剪碎的肺组织在含 Ca 的 HBSS 中孵育2+/毫克2+ 在37 °C下，于含有0.3 mg/mL IV型胶原酶、1 mg/mL dispase和5 mg/mL DNase I的溶液中，在旋转摇床上孵育45分钟。每隔15分钟，在超净台内将剪碎的组织通过10 mL血清移液管吹打10次，以促进细胞更好地解离。
  10. 将所得的细胞悬液通过100 µm细胞筛，收集单细胞至含有20 mL冷的活细胞成像溶液（含20 mM HEPES、pH 7.4的生理盐水）的50 mL离心管中，该溶液中胎牛血清（FBS）含量低于5%。在500 × g条件下离心收集细胞 g 4 °C 下离心 10 分钟。
  11. 吸弃上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL红细胞裂解缓冲液中，室温（RT）孵育5分钟以去除红细胞。加入20 mL含少于5% FBS的冷的活细胞成像溶液。在500 × g条件下离心收集细胞 g 4 °C 下离心 10 分钟。
  12. 吸弃上清液，将细胞沉淀重悬于 20 mL 含少于 5% FBS 的冷活细胞成像溶液中。将所得细胞悬液通过 40 µm 滤网，收集单细胞至含有 20 mL 含少于 5% FBS 的冷活细胞成像溶液的 50 mL 管中。在 500 ×g 离心收集细胞 g 4 °C 下离心 10 分钟。
  13. 吸弃上清液，将细胞沉淀重悬于 10 mL 含有低于 5% FBS 的冷活细胞成像溶液中。计数细胞，并将细胞浓度调整至约 5–10 × 10⁶ 个/mL。6 细胞/毫升

3. 使用荧光激活细胞分选（FACS）分离含视黄醇的肺细胞

  1. 取一份细胞悬液，留作未染色的设门对照。向剩余的细胞悬液中加入活死染料SYTOX Green（1:1000稀释，终浓度为30 nM）。
  2. 将细胞悬液通过连接在聚苯乙烯5 mL（12 x 75 mm）收集管上的滤器。
  3. 通过荧光激活细胞分选（FACS）进行细胞分离，根据细胞在455 nm处的发射光信号，分选含有类视黄醇的活单细胞。使用前向散射光（前向散射光高度/FSC-H 对比前向散射光面积/FSC-A）图进行单细胞判别。根据侧向散射光特征及SYTOX Green染色排除死细胞。
  4. 在350 nm激发光下，依据455 nm发射光信号设门、分选并收集单个活的含类视黄醇细胞。
    注：采用所述方法，可从一只小鼠肺组织中收集约5·105个含类视黄醇的肺细胞。
  5. 使用流式细胞术分析软件进行FACS数据分析。

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结果

肺部含视黄醇细胞的分离
小鼠肺组织（来自 Lrat+/+ 和 Lrat-/-) 小鼠组织经酶消化处理，制备单细胞悬液，并按照上述方案进行流式细胞术分析。细胞分选和数据采集使用配备 SpectroFlo CS 软件（版本 1.3.0）的 Cytek Aurora™ 细胞分选系统完成，采用 100 µm 喷嘴和15 psi压力。首先，通过前向散射（前向散射高度/FSC-H 对 前向散射面积/FSC-A）图进行单细胞（单细胞群体）的选取和设门，随后利用侧向散射和SYTOX Green染色区分死细胞（图2最后，为了分选含有视黄醇的目标细胞群体，选择了一群在 λ = 455 nm 处具有强自发荧光的活单细胞群体（图2A). 为验证所采用的设门策略及整体方法的特异性，使用肺组织单细胞悬液 Lrat-/-

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讨论

早在20世纪40年代，已有研究首次报道了利用荧光显微镜检测人和动物组织中维生素A的能力及其组织学可视化方法。59,60随后，视黄醇自体荧光现象被成功应用于旨在定位组织中高浓度维生素A的研究。 体外61 以及动物胚胎组织形态发生的表征62 利用荧光显微镜观察。后续通过实验观察并证实，细胞内视黄醇类物质具有独特的自发荧光特性（在 λ = 350 nm 处激发，于 λ = 455 nm 处产生特征性的蓝绿色发射光），且该特性与特定细胞类型相关，因此可用于分离和鉴定此类细胞63,64,65.

已有发表的研究利用类维生素A自发荧光来确定含类维生素A细胞的身份和/或定量肝脏

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院/国家心肺血液研究所（NIH/NHLBI）R01 HL171112（资助对象：I.S.）提供的资助、由美国国立卫生研究院/国家环境健康科学研究所（NIH/NIEHS）P30 ES005022 资助的罗格斯大学环境暴露与疾病研究中心（Rutgers Center for Environmental Exposures & Disease）提供的职业发展奖（资助对象：I.S.），以及新泽西州立罗格斯大学（Rutgers, The State University of New Jersey）的启动资金（资助对象：I.S.）共同支持。作者谨此感谢罗格斯癌症研究所免疫监测与流式细胞术共享资源平台（Immune Monitoring and Flow Cytometry Shared Resource at the Rutgers Cancer Institute）的工作人员，该平台部分获得了美国国家癌症研究所癌症中心支持拨款（NCI-CCSG P30CA072770-5920）的资助，其对本文所呈报工作的贡献至关重要。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 mL 血清移液管Avantor/VWR76452-284
100 µm 细胞筛 Greiner Bio-One542000
15 mL 离心管Corning352099
40 µm 细胞筛 Greiner Bio-One542040
50 mL 离心管Corning352070
细胞培养皿，35 mm ´ 10 mmCorning430165
细胞分选培养基GibcoA59688DJ
IV 型胶原酶 Worthington Biochemical CorporationLS004188 
Cytek Aurora 细胞分选系统 Cytek Biosciences
Dispase IISigma-AldrichD4693
DNase ISigma-AldrichDN25
Falcon 品牌 5 mL 聚丙烯圆底管，12 mm ´ 75 mmCorning352063
Falcon 品牌 5 mL 聚苯乙烯圆底管，带细胞筛帽，12 mm ´ 75 mmCorning352235
FlowJo 软件 Becton Dickinson流式细胞术软件
含 Ca2+/Mg2+ 的 HBSSGibco14925-092
不含 Ca2+/Mg2+ 的 HBSSGibco14175-095
Nalgene Rapid-Flow 一次性无菌瓶顶过滤器ThermoFisher595-3320
红细胞裂解缓冲液Sigma-AldrichR7757
SpectroFlo CS 软件 Cytek BiosciencesVersion 1.3.0 
Surgical Design Royaltek 不锈钢手术刀片Fisher Scientific22-079-683
SYTOX Green 死细胞染料InvitrogenS34860
他莫昔芬Sigma-AldrichT2859

参考文献

  1. Shmarakov, I. O., et al. Retinoids stored locally in the lung are required to attenuate the severity of acute lung injury in male mice. Nat Commun. 14 (1), 851(2023).
  2. Bogue, C. W., Jacobs, H. C., Dynia, D. W., Wilson, C. M., Gross, I. Retinoic acid increases surfactant protein mRNA in fetal rat lung in culture. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 271 (5), L862-L868 (1996).
  3. Ng-Blichfeldt, J. -P., et al. Retinoic acid signaling balances adult distal lung epithelial progenitor cell growth and differentiation. EBioMedicine. 36, 461-474 (2018).
  4. Chen, F., et al. Prenatal retinoid deficiency leads to airway hyperresponsiveness in adult mice. J Clin Invest. 124 (2), 801-811 (2014).
  5. Esteban-Pretel, G., Marin, M. P., Renau-Piqueras, J., Barber, T., Timoneda, J. Vitamin A deficiency alters rat lung alveolar basement membrane: reversibility by retinoic acid. J Nutr Biochem. 21 (3), 227-236 (2010).
  6. Massaro, G. D., Massaro, D. Postnatal treatment with retinoic acid increases the number of pulmonary alveoli in rats. Am J Physiol. 270 (2 Pt 1), L305-L310 (1996).
  7. Hind, M., Maden, M. Retinoic acid induces alveolar regeneration in the adult mouse lung. Eur Respir J. 23 (1), 20-27 (2004).
  8. Belloni, P. N., Garvin, L., Mao, C. P., Bailey-Healy, I., Leaffer, D. Effects of all-trans-retinoic acid in promoting alveolar repair. Chest. 117 (5 Suppl 1), 235S-241S (2000).
  9. Veness-Meehan, K. A., Bottone, F. G. Jr, Stiles, A. D. Effects of retinoic acid on airspace development and lung collagen in hyperoxia-exposed newborn rats. Pediatr Res. 48 (4), 434-444 (2000).
  10. Cho, S. J., George, C. L., Snyder, J. M., Acarregui, M. J. Retinoic acid and erythropoietin maintain alveolar development in mice treated with an angiogenesis inhibitor. Am J Respir Cell Mol Biol. 33 (6), 622-628 (2005).
  11. Massaro, G. D., Massaro, D. Retinoic acid treatment abrogates elastase-induced pulmonary emphysema in rats. Nat Med. 3 (6), 675-677 (1997).
  12. Stinchcombe, S. V., Maden, M. Retinoic acid induced alveolar regeneration: critical differences in strain sensitivity. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (2), 185-191 (2008).
  13. Fraslon, C., Bourbon, J. R. Retinoids control surfactant phospholipid biosynthesis in fetal rat lung. Am J Physiol. 266 (6 Pt 1), L705-L712 (1994).
  14. Zachman, R. D. Role of vitamin A in lung development. J Nutr. 125 (6 Suppl), 1634s-1638s (1995).
  15. van Bennekum, A. M., et al. Lipoprotein lipase expression level influences tissue clearance of chylomicron retinyl ester. J Lipid Res. 40 (3), 565-574 (1999).
  16. Blaner, W. S., et al. Lipoprotein lipase hydrolysis of retinyl ester: possible implications for retinoid uptake by cells. J Biol Chem. 269 (24), 16559-16565 (1994).
  17. Trites, M. J., Febbraio, M., Clugston, R. D. Absence of CD36 alters systemic vitamin A homeostasis. Sci Rep. 10 (1), 20386(2020).
  18. Wassef, L., Quadro, L. Uptake of dietary retinoids at the maternal-fetal barrier: in vivo evidence for the role of lipoprotein lipase and alternative pathways. J Biol Chem. 286 (37), 32198-32207 (2011).
  19. Spiegler, E., Kim, Y. -K., Wassef, L., Shete, V., Quadro, L. Maternal-fetal transfer and metabolism of vitamin A and its precursor β-carotene in the developing tissues. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1821 (1), 88-98 (2012).
  20. Kedishvili, N. Y. Enzymology of retinoic acid biosynthesis and degradation. J Lipid Res. 54 (7), 1744-1760 (2013).
  21. Channabasappa, S., Caldwell, S., Kanthan, R., Singh, B. Retinoid receptors are expressed in mouse and human lungs. Anat Rec. 305 (9), 2281-2289 (2022).
  22. Kimura, Y., et al. Retinoid receptors in the developing human lung. Clin Sci (Lond). 103 (6), 613-621 (2002).
  23. Yang, L., Naltner, A., Yan, C. Overexpression of dominant negative retinoic acid receptor alpha causes alveolar abnormality in transgenic neonatal lungs. Endocrinology. 144 (7), 3004-3011 (2003).
  24. Snyder, J. M., et al. Alveolarization in retinoic acid receptor-beta-deficient mice. Pediatr Res. 57 (3), 384-391 (2005).
  25. Gao, R. -w, et al. Retinoic acid promotes primary fetal alveolar epithelial type II cell proliferation and differentiation to alveolar epithelial type I cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51 (5), 479-487 (2015).
  26. Dirami, G., et al. Lung retinol storing cells synthesize and secrete retinoic acid, an inducer of alveolus formation. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (2), L249-L256 (2004).
  27. Massaro, G. D., Massaro, D., Chambon, P. Retinoic acid receptor-alpha regulates pulmonary alveolus formation in mice after, but not during, perinatal period. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 284 (2), L431-L433 (2003).
  28. Massaro, G. D., et al. Retinoic acid receptor-beta: an endogenous inhibitor of the perinatal formation of pulmonary alveoli. Physiol Genomics. 4 (1), 51-57 (2000).
  29. McGowan, S., et al. Mice bearing deletions of retinoic acid receptors demonstrate reduced lung elastin and alveolar numbers. Am J Respir Cell Mol Biol. 23 (2), 162-167 (2000).
  30. Yan, C., et al. Retinoic acid-receptor activation of SP-B gene transcription in respiratory epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 275 (2), L239-L246 (1998).
  31. Ghaffari, M., Whitsett, J. A., Yan, C. Inhibition of hSP-B promoter in respiratory epithelial cells by a dominant negative retinoic acid receptor. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 276 (3), L398-L404 (1999).
  32. Yang, L., et al. Synergy between signal transducer and activator of transcription 3 and retinoic acid receptor-α in regulation of the surfactant protein b gene in the lung. Mol Endocrinol. 18 (6), 1520-1532 (2004).
  33. Metzler, M. D., Snyder, J. M. Retinoic acid differentially regulates expression of surfactant-associated proteins in human fetal lung. Endocrinology. 133 (5), 1990-1998 (1993).
  34. George, T. N., Snyder, J. M. Regulation of surfactant protein gene expression by retinoic acid metabolites. Pediatr Res. 41 (5), 692-701 (1997).
  35. Naltner, A., Ghaffari, M., Whitsett, J. A., Yan, C. Retinoic acid stimulation of the human surfactant protein B promoter is thyroid transcription factor 1 site-dependent. J Biol Chem. 275 (1), 56-62 (2000).
  36. Ng-Blichfeldt, J. P., et al. Deficient retinoid-driven angiogenesis may contribute to failure of adult human lung regeneration in emphysema. Thorax. 72 (6), 510-521 (2017).
  37. Lochbaum, R., et al. Retinoic acid signalling adjusts tight junction permeability in response to air-liquid interface conditions. Cell Signal. 65, 109421(2020).
  38. Mamidi, S., Hofer, T. P., Hoffmann, R., Ziegler-Heitbrock, L., Frankenberger, M. All-trans retinoic acid up-regulates prostaglandin-e synthase expression in human macrophages. Immunobiology. 217 (6), 593-600 (2012).
  39. Hashimoto, S., et al. Retinoic acid differentially regulates interleukin-1beta and interleukin-1 receptor antagonist production by human alveolar macrophages. Leuk Res. 22 (11), 1057-1061 (1998).
  40. Li, S., Lei, Y., Lei, J., Li, H. Alltrans retinoic acid promotes macrophage phagocytosis and decreases inflammation via inhibiting CD14/TLR4 in acute lung injury. Mol Med Rep. 24 (6), (2021).
  41. Nagy, N. E., et al. Storage of vitamin A in extrahepatic stellate cells in normal rats. J Lipid Res. 38 (4), 645-658 (1997).
  42. Thompson, K. C., et al. Primary rat and mouse hepatic stellate cells express the macrophage inhibitor cytokine interleukin-10 during the course of activation in vitro. Hepatology. 28 (6), 1518-1524 (1998).
  43. Zhang, X. Y., Sun, C. K., Wheatley, A. M. A novel approach to the quantification of hepatic stellate cells in intravital fluorescence microscopy of the liver using a computerized image analysis system. Microvasc Res. 60 (3), 232-240 (2000).
  44. D'Ambrosio, D. N., et al. Distinct populations of hepatic stellate cells in the mouse liver have different capacities for retinoid and lipid storage. PLoS One. 6 (9), e24993(2011).
  45. Apte, M. V., et al. Periacinar stellate shaped cells in rat pancreas: identification, isolation, and culture. Gut. 43 (1), 128-133 (1998).
  46. Kim, N., et al. Formation of vitamin A lipid droplets in pancreatic stellate cells requires albumin. Gut. 58 (10), 1382-1390 (2009).
  47. Kida, Y., et al. Characterization of vitamin A-storing cells in mouse fibrous kidneys using Cygb/STAP as a marker of activated stellate cells. Arch Histol Cytol. 70 (2), 95-106 (2007).
  48. Ogawa, T., et al. Identification of vitamin A-free cells in a stellate cell-enriched fraction of normal rat liver as myofibroblasts. Histochem Cell Biol. 127 (2), 161-174 (2007).
  49. Tacke, F., Weiskirchen, R. Update on hepatic stellate cells: pathogenic role in liver fibrosis and novel isolation techniques. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 6 (1), 67-80 (2012).
  50. Bartneck, M., et al. Isolation and time lapse microscopy of highly pure hepatic stellate cells. Anal Cell Pathol (Amst). , (2015).
  51. Balaphas, A., et al. Optimized isolation and characterization of C57BL/6 mouse hepatic stellate cells. Cells. 11 (9), (2022).
  52. Kubota, H., Yao, H. L., Reid, L. M. Identification and characterization of vitamin A-storing cells in fetal liver: implications for functional importance of hepatic stellate cells in liver development and hematopoiesis. Stem Cells. 25 (9), 2339-2349 (2007).
  53. Larsen, A. K., et al. Autofluorescence in freshly isolated adult human liver sinusoidal cells. Eur J Histochem. 65 (4), (2021).
  54. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  55. National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , The National Academies Press. Washington DC. (2011).
  56. O'Byrne, S. M., et al. Retinoid absorption and storage is impaired in mice lacking lecithin: retinol acyltransferase (LRAT). J Biol Chem. 280 (42), 35647-35657 (2005).
  57. McGowan, S. E., Torday, J. S. The pulmonary lipofibroblast (lipid interstitial cell) and its contributions to alveolar development. Annu Rev Physiol. 59, 43-62 (1997).
  58. McGowan, S. E. The lipofibroblast: more than a lipid-storage depot. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 316 (5), L869-L871 (2019).
  59. Meyer, K. A., Popper, H., Ragins, A. B. Histologic distribution of vitamin A in biopsy specimens of the liver. Arch Surg. 43 (3), 376-385 (1941).
  60. Popper, H. L. Histological demonstration of vitamin A in rats by means of fluorescence microscopy. Proc Soc Exp Biol Med. 43, 133-136 (1940).
  61. Van Exan, R. J., Hardy, M. H. Localization of vitamin A by autofluorescence during induced metaplastic changes in cultures of skin. In Vitro. 15 (8), 631-640 (1979).
  62. Schweigert, F. J., Siegling, C., Tzimas, G., Seeger, J., Nau, H. Distribution of endogenous retinoids, retinoid binding proteins (RBP, CRABPI) and nuclear retinoid X receptor beta (RXRbeta) in the porcine embryo. Reprod Nutr Dev. 42 (4), 285-294 (2002).
  63. Wake, K. Perisinusoidal stellate cells (fat-storing cells, interstitial cells, lipocytes), their related structure in and around the liver sinusoids, and vitamin A-storing cells in extrahepatic organs. Int Rev Cytol. 66, 303-353 (1980).
  64. Senoo, H., Kojima, N., Sato, M. Vitamin A-storing cells (stellate cells). Vitam Horm. 75, 131-159 (2007).
  65. Senoo, H., et al. Hepatic stellate cell (vitamin A-storing cell) and its relative--past, present and future. Cell Biol Int. 34 (12), 1247-1272 (2010).

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通过细胞分选分离肺部含视黄醇细胞
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