酵母表面显示蛋白的酶修饰和流式细胞术评估

摘要

在这里，我们介绍了一种使用酵母表面显示的底物进行酶促修饰测定的方案。使用酪氨酸磷酸酶 SHP-2 对其底物之一的去磷酸化活性分析作为代表性酶修饰测定法来证明该平台。

摘要

酵母表面显示是一种基因型-表型连锁策略，能够对蛋白质功能进行高通量筛选。传统上，酵母表面显示已应用于新结合蛋白的进化，流式细胞术用于按结合强度水平进行评估和排序。最近，人们越来越关注应用酵母表面显示来筛选底物变体的酶修饰，加性修饰（例如磷酸化）或减化修饰（例如蛋白水解）可提供流式细胞术可读的表型。这种修饰通常使用细胞内共定位进行应用，但实现所展示底物的细胞外酶促修饰的能力可能会开启更多的研究反应。在这里，我们描述了设计和应用细胞外酶修饰筛选测定到酵母表面显示的候选底物的技术，以及随后使用流式细胞术分析进行的评估。我们在磷酸酶去磷酸化酵母展示的含有磷酸化酪氨酸残基的底物的背景下提供了这些方案，并评论了该应用框架如何适应开发其他酶-底物对的筛选测定。

引言

了解酶与其靶标之间的相互作用已成为一个越来越有趣的研究领域，因为它在控制细胞稳态和疾病发展的途径的生物学表征中的必要性 ^1,2。酶负责催化维持生物生命的许多反应，控制必要的途径，如细胞代谢 ^3,4、信号传导⁵，甚至基因组修复 ^6,7 等基本过程。由于它们在这些过程中的作用，它们的相互作用也在许多疾病的发展中发挥作用，因为它们活性的偏差会导致细胞活性严重失调，从而导致有害癌细胞凋亡或增殖²。酶活性的研究在新疗法的开发中具有重要应用^8,9，^需要针对每种特定酶-底物相互作用量身定制的检测¹⁰。多种酶测定已被确立为评估和表征这些相互作用的标准方案。为分析酶相互作用而开发的检测分为监测激活/抑制结合的检测检测¹¹ 或监测酶底物修饰的检测¹²。

酶的一个主要作用是调节细胞行为。信号转导是细胞对细胞外触发因素¹³ 的细胞内反应，负责细胞存活和功能。细胞增殖、分化和许多其他功能过程都涉及信号转导通路，其中酶相互作用控制它们^14,15。酶催化翻译后修饰，这通常调节负责正确传递细胞外信息的大型信号网络¹⁶。蛋白磷酸化是最常见的翻译后修饰，在细胞信号转导和多种其他细胞通路中普遍存在。因此，由于其关键的调节作用，蛋白激酶已成为潜在治疗靶标的重要比例¹⁷。磷酸酶是基于磷酸盐的细胞信号转导复合物的天然调节分子^18,19，^具有从其靶蛋白中去除磷酸盐残基的能力²⁰。在过去十年中，磷酸酶已成为癌症治疗²¹ 和炎症性疾病²² 的主要治疗靶点，因为它们参与多种细胞类型中下游信号通路的调节。蛋白激酶和磷酸酶共同提供了广泛的相互作用，可以通过开发特定的酶检测方案来研究。

酵母表面显示已被用作表征和评估酶活性的工具^23,24。当与内质网隔离策略结合使用时，它为筛选翻译后修饰过程提供了一个高通量平台^25,26。这允许激酶-底物对通过与 KDEL 受体²⁷ 结合共定位并保留在内质网中，由于激酶与其靶标之间的接近，底物的磷酸化速率可能增加。KDEL 受体结合由 C 端 FEHDEL 内质网保留序列介导，显示比其他 HDEL 序列具有更强的保留能力^25,28。然后将磷酸化底物锚定到酵母表面，以便随后通过流式细胞术进行评估²⁹。目前，还没有为酵母表面显示的底物的酶促修饰建立可推广的方案。我们通过利用细胞外表达的磷酸化底物变体并通过其已知磷酸酶的去磷酸化对其进行修饰来扩展酵母表面显示的能力。然后，流式细胞术分析提供了一个平台，通过测量由于与已知磷酸酶孵育而导致的磷酸化中位数的变化，为上述底物的表型评估提供了一个平台。这为表面显示蛋白的翻译后修饰提供了一种适应性强的方法，同时也提供了一种在使用酵母表面显示平台时对相互作用进行酶促修饰分析的方法。

我们提出了酶修饰测定的开发和应用技术，该技术描述了将激酶-底物相互作用引入酵母表面展示平台，表达的磷酸化底物与重组磷酸酶的共孵育，以及随后通过流式细胞术分析去磷酸化活性。在本报告中，这是通过将 CD28 的细胞质结构域与淋巴细胞激酶 （LCK） 共定位在酵母内质网中，然后在酵母表面显示磷酸化的 CD28，随后通过含有 Src 同源区域 2 结构域的磷酸酶-2 （SHP-2） 去磷酸化来实现的。泛抗磷酸酪氨酸抗体（在本研究中为 4G10）可检测多种肽序列中的磷酸化酪氨酸残基，用于定量磷酸化水平作为磷酸酶处理的函数。详细的过程为研究酶-底物相互作用提供了一种通用的方法;一种以纯化方式研究酶和底物的前瞻性方法。

方案

1. 携带质粒的酵母的细胞生长和蛋白质表达的诱导

1. 按照 表 1 中描述的配方，准备不含质粒的酵母 （YPD）、含质粒的酵母细胞生长 （SD-CAA） 和诱导蛋白质表达 （SRG-CAA） 以及 SD-CAA 板生长所需的培养基。
2. 通过基于锂阳离子的方法^30,31 将含有激酶-底物对的酵母展示质粒 DNA 转化到 EBY-100 酵母细胞中，该方法通常用于各种制造商的酵母转化试剂盒。
   注：根据被转化的质粒构建体，可以使用电穿孔³² 或其他优选的酵母质粒转化技术。
3. 制备含有 10 mL YPD 培养基的 14 mL 培养管。接种 EBY-100 细胞，并在 30 °C、300 rpm 的振荡培养箱中生长，直到培养物达到 0.8-1.0（8 x 10⁶- 1 x 10⁷ 个细胞/mL）的光密度 （OD_600nm）。
   注：OD_600nm 的测量方法是制备 3 mL 样品比色皿（在各自的培养基中含有 1：10 稀释的酵母培养物）和 3 mL 含有用于样品稀释的培养基的空白比色皿。分光光度计上的 OD_600nm 程序用于首先测量空白比色皿，然后通过设置为每个样品准备的相应稀释度来测量每个样品比色皿。1 OD_600nm 对应于 1 × 10⁷ 个酵母/mL。
4. 通过以 1,000 x g 离心培养物 3 分钟来收获细胞，并使用酵母转化试剂盒中提供的^{第 1 种} 洗涤溶液或 TE（10 mM Tris-HCl 和 1.0 mM EDTA）洗涤³¹。
5. 再次以 1,000 x g 的浓度沉淀细胞 3 分钟，然后重悬于酵母转化试剂盒中提供的 1 mL 转化缓冲液或无菌水中。细胞应分装成 50 μL 等分试样，可在 -80 °C 下储存长达 6 个月。
6. 对于质粒转化，制备每个质粒一个等分试样并在冰上解冻，然后将 0.5-1.5 μg 含有酵母展示构建体的质粒 DNA 直接加入到细胞中。加入 0.5 mL 酵母转化试剂盒中提供的转化溶液，或 0.5 mL 无菌 50% 聚乙二醇和 0.1 M LiOAc 溶液³¹。通过移液将细胞、质粒 DNA 和转化溶液的混合物彻底混合。
7. 在 30 °C 下静态孵育转化混合物 30-60 分钟，每隔 15 分钟涡旋混合物。通过在 1,000 × g 离心 3 分钟来收获细胞。
8. 准备一个装有 4.5 mL SD-CAA 培养基的 14 mL 培养管。将含有所需质粒的细胞重悬于 500 μL SD-CAA 中，并接种制备的 4.5 mL。
9. 注意不要刺穿琼脂，将 50 μL 的 5 mL 接种培养物分配到 SD-CAA 板上，并在 30 °C 下静态孵育 48 小时以确定转化效率。
10. 将 5 mL 的 SD-CAA 细胞培养物在 30 °C、300 rpm 的振荡培养箱中孵育至少 18 小时。16 小时和 20 小时后监测光密度 （OD_600nm）。一旦样品生长到不超过 6 的足够光密度，将培养物以 2,500 × g 离心 3 分钟。丢弃上清液，不要干扰酵母沉淀。
11. 将酵母沉淀重悬于 SRG-CAA 中，至最终 OD_600nm ，小于 1（<1 × 10⁷ 酵母/mL）。
12. 将酵母培养物在 30 °C、300 rpm 的振荡培养箱中孵育至少 8 小时但不超过 24 小时。
    注：酵母细胞中蛋白质表达的诱导可以在 20-37 °C 之间变化。30 °C 适用于合成激酶/底物对^29,33，但如果认为有必要，可以调整正在研究的特定蛋白质。
13. 测量 OD_600nm 以确定细胞密度。
    注意：此时可以通过将酵母培养物储存在 4 °C 来终止该方案。

2. 4G10 抗磷酸酪氨酸抗体的生物素化

1. 通过添加 680 μL 无菌 PBS，重悬 2 mg 小瓶 PEG4-NHS-生物素至终浓度为 5 mM。
   注：PEG4-NHS-生物素的重悬应在进行生物素化反应之前立即新鲜进行。NHS 在水溶液中水解。使用无菌 PBS 和样品瓶对于制备用于长期储存的试剂和用于基于细胞的分析非常重要，以减轻污染物对试剂活力或正在进行的敏感分析的任何潜在影响。
2. 根据 4G10 抗体浓度，将 100 μg 抗体加入无菌 1.7 mL 样品瓶中。
3. 将步骤 2.1 中制备的 5 mM PEG4-NHS-生物素 1 μL 添加到装有 100 μg 4G10 抗体的小瓶中，以达到生物素与抗体的摩尔比为 7.5：1。轻轻吸取混合物以使反应匀浆。
4. 在室温下以恒定旋转孵育反应至少 2 小时。
5. 按照制造商的 0.5 mL 离心脱盐柱方案，将缓冲液从生物素化的 4G10 （B-4G10） 交换成 PBS。
   注：截留分子量 （MWCO） 为 7 kDa 的脱盐柱通常用于抗体的生物素化，以去除未反应的生物素和其他小分子，同时保留较大的抗体。
6. 在 PBSA（含 1 g/L 牛血清白蛋白的 PBS）中将 B-4G10 抗体稀释至终浓度为 1 μM。将 B-4G10 抗体分装成更小的体积，以防止重复冻融循环。
   注：生物素化抗体可在 4 °C 下储存以供日常使用长达 3 个月，而不会显著降低效率。将其余未使用的等分试样在 -20 °C 下储存最长 2 年。

3. 酵母细胞表面表达的底物的去磷酸化

1. 如文献³⁴ 中先前所述，准备 2x 工作缓冲液。
   注意：建议使用 2 倍，以便于测量所需的成分。
2. 通过在去离子水中以 1：2 的比例稀释步骤 3.1 中制备的 2x 缓冲溶液，在 1.7 mL 小瓶中制备样品，制备工作缓冲液。
   注：每个样品的总反应体积为 20 μL，每个样品需要 10 μL 至 18 μL 的工作缓冲液。为所有样品或对照准备足够的工作缓冲液。
3. 按照 表 2 中描述的推荐样品制备方法，在 1.7 mL 样品瓶上标记相应的对照品或样品名称。
4. 根据步骤 1.9 中测量的 OD_600nm ，计算从每个样品的相应酵母培养物中回收两百万 （2 × 10⁶） 个酵母细胞所需的培养物体积。
5. 将上一步中计算的酵母培养物体积添加到每个样品的 1.7 mL 样品瓶中。
6. 将样品瓶以 4,500 × g 离心 1 分钟。使用微量移液器小心去除上清液，并作为生物危害性废物丢弃。
7. 将沉淀的细胞重悬于 1 mL PBSA 中，然后重复 步骤 3.6。
   注：在不干扰沉淀细胞的情况下去除尽可能多的上清液非常重要。
8. 根据其储备液浓度，计算在 20 μL 总反应体积中最终浓度为 1,000 nM 所需的重组人 SHP-2 体积。
   注：重组 SHP-2 应以小体积等分，以便每次测定中使用的任何蛋白质不超过两次冻融循环。在制备完所有样品进行检测后，等分试样中残留的任何 SHP-2 都应丢弃。
   重组酶的储备液浓度可能因批号而异。重组 SHP-2 的储备液浓度通常为 0.2-0.4 mg/mL。对于 0.324 mg/mL SHP-2 的储备液浓度，这对应于 4.696 μM 的储备液浓度（SHP-2 的分子量为 69 kDa）。在 20 μL 反应中加入 4.26 μL SHP-2 储备液，得到 1,000 nM SHP-2 的最终反应浓度。
9. 将 7.7 mg DTT 加入 10 mL 去离子水中，溶于 15 mL 锥形中，制成 5 mM DTT 溶液。如果设备限制难以称量毫克级，则向 10 mL 去离子水中加入 0.77 g DTT，然后进行 100 倍稀释，制成用于检测的 5 mM DTT 溶液。
   注：如果无法使用现有设备测量毫克级量，则可以在更高浓度的储备液中制备 DTT 溶液，将其稀释至 5 mM。DTT 溶液需要制备新鲜的细胞，然后再在工作缓冲液中重悬细胞，因为它容易水解，使其在水中稀释时长时间不稳定。
10. 在步骤 3.2 中制备的工作缓冲液中重悬沉淀的细胞，使每个样品或对照中的最终反应体积为 20 μL。
    注：添加的工作缓冲液的量应根据每个样品中的 DTT （2 μL） 和 SHP-2（在步骤 3.8 中计算）的量计算。
11. 向每个样品或对照中加入 2 μL 步骤 3.9 中制备的 5 mM DTT 溶液，最终反应浓度为 0.5 mM DTT。
12. 将步骤 3.8 中计算的 SHP-2 体积添加到每个样品中，最终体积为 20 μL，并使用微量移液器轻轻混合。
13. 用封口膜包裹样品瓶盖，以防止泄漏或交叉污染。
14. 将样品在 37 °C 下在转子上以恒定速度孵育 2 小时。
15. 从转子中取出样品，并向每个样品中加入 1 mL PBSA 终止反应。
16. 重复步骤 3.6。

4. 去磷酸化底物的细胞标记和流式细胞术分析

1. 如 表 2 所述，将步骤 3.16 中的样品重悬于相应主要试剂的 20 μL 混合物中。在室温下孵育样品 20 分钟。
   注：根据酵母细胞表面表达的蛋白质数量，所有使用的试剂浓度均已计算过量。该计算假设样品³⁵ 中所有 2 x 10⁶ 酵母的表达量为 10,000 种蛋白质/细胞，而通常只有 ~50% 的酵母表达。表 3 显示了表 2 中表示的每种试剂的过量标记试剂比率，计算如下：
   
2. 将样品以 4,500 × g 离心 1 分钟，并将上清液作为生物危害性废物丢弃。
3. 通过在 1 mL PBSA 中重悬来洗涤细胞一次。重复步骤 4.2。
4. 如 表 2 所述，将样品重悬于相应二级试剂的 20 μL 混合物中。在没有光线的情况下孵育样品 15 分钟。
5. 重复步骤 4.2。
6. 重复步骤 4.3。
7. 将洗涤后的样品重悬于 300-500 μL PBSA 中，并转移到 5 mL 聚苯乙烯管中，立即使用合适的流式细胞仪进行分析。
   注：如果需要运输样品，请放在湿冰上。不建议这样做，但样品可以作为湿颗粒在 4 °C 下储存最多 2 小时。
8. 为新实验执行必要的细胞仪启动和准备后，单击 File（文件）菜单中的 New Experiment（新建实验）按钮，为实验命名，然后单击 Save（保存）以确保采集的数据保存在所需的文件路径中。
9. 选择上方工具栏中的点图图标，为每个要运行的样品创建两个或多个点图。对于其中一个点图，选择 X 轴名称以显示 FSC-A 通道，选择 Y 轴名称以显示 SSC-A 通道。此图显示了侧向散射 - 面积与前向散射 - 面积，用于对酵母细胞进行门控以进行进一步分析。
10. 在另一个点图上，选择 X 轴名称以显示靶向一抗表位标签抗体的二级试剂发出荧光的通道。选择 Y 轴名称可显示链霉亲和素二抗试剂发出荧光的通道。该图将仅显示从侧面与前向散点图门控的事件为酵母细胞，并用于在 Y 轴上显示酪氨酸磷酸化，在 X 轴上显示底物表面表达。
    注：在本例中，靶向一抗表位标签抗体的二抗试剂在 FITC （AF-488） 通道中发出荧光，而链霉亲和素二抗试剂在 AF-647 通道中发出荧光。使用的通道可能因标记过程中使用的一级和二级试剂而异。
11. 将每个样品管放入细胞仪的试管架中，然后为细胞仪选择“运行”以开始加载样品并采集数据。根据需要调整要显示的事件、要记录的事件、要记录的时间和样品流速。
12. 在步骤 4.9 中创建的 SSC-A 与 FSC-A 图中定义围绕健康酵母细胞的门。 图 1 说明了要应用的门控策略的描述性表示。
    注：在 SSC-A 与 FSC-A 图中，要显示 100,000 个事件，并在定义的酵母门内记录 50,000 个事件是可视化和收集足够数据以供进一步分析的良好指南。可以根据最近报道的前向散射高度与前向散射面积图³⁶ 来应用更严格的单线态酵母选择门控策略。 图 1 所示的门控策略对应于一种不太严格的方法，包括通过分散门控的单重态和一些双联酵母。
13. 使用流式细胞术分析仪记录所有对照样品的荧光。首先定期收集对照样品以帮助定义门控策略，如下文步骤 4.14 中所述。
14. 在分析处理样品之前，为步骤 4.10 中创建的图定义设门策略。 图 1 说明了要应用的门控策略的描述性表示。
15. 使用流式细胞仪和步骤 4.12 和 4.14 中定义的门控策略记录去磷酸化样品的荧光。
16. 分析使用流式细胞术分析软件采集的流式细胞术数据。
17. 通过测量和比较在其表面表达蛋白质的细胞的 Y 轴中位数与样品和对照之间非显示细胞提供的基线磷酸化来评估去磷酸化。按如下方式计算磷酸化中位数百分比差异：
    

结果

来自我们的模型系统的单个复制品的流式细胞术分析在没有（图 1A）和（图 1B）1,000 nM SHP-2 的情况下孵育 2 小时，显示中位磷酸化差异为 63.6%，其定义为来自所有表面显示事件的 Y 轴中位数（磷酸化）减去基线磷酸化信号的比率，定义为处理样品和未处理对照之间未显示事件的 Y 轴中位数，如方程中所述在协议步骤 4.12 中定义。在分析中位数之前，根据样本的大小（前向散射）和复杂性（侧向散射）对样本进行门控，以包含一组健康的细胞。在规定的条件下，样品去磷酸化应该是在显而易见的地方可以区分的（图 1C）。

该测定由一个简单的程序定义，该程序由四种主要方法组成（图 2A）。我们使用和之前发布的酵母表面展示系统基于一种质粒，该质粒含有双向启动子，能够同时诱导表达由 CD28 的细胞质尾部和酪氨酸激酶 LCK 组成的激酶-底物对（

讨论

提出的方案允许使用酵母表面蛋白质的细胞外显示来分析酶相互作用。将内质网隔离液螯合到所使用的表面展示质粒中，引入了分析酶和翻译后修饰底物之间的细胞外特异性相互作用的能力，因为细胞内相互作用可以设计为发生^27,29。先前建立的使用酵母表面显示的酶相互作用测定涉及目标蛋白质在细胞内的表达，表面显示仅作为检测靶蛋白之间发生的细胞内相互作用的工具 23,25,29。

该方案通过将靶向酶相互作用转移到细胞外环境来构建在该平台上，这在可以研究的酶和监测其活性的环境中引入了额外的灵活性。研究的细胞外发生的相互作用使研究人员有机会调整孵育环境，使其更适合酶活性，从而扩展可以研究的酶，这些酶的活性在酵母内质网（一个高度氧化的环境）中受...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 L 培养基瓶	康宁	06-414-1D
1.7/2.0 mL 微管	Axygen	MCT-175-C
10 & micro;L SureOne 移液器吸头	Fisher Scientific	02-707-438
1000 & micro;L SureOne 移液器吸头	Fisher Scientific	02-707-408
12 mL 聚苯乙烯圆底管	Greiner	07-000-212
3 mL platic 比色皿	BRAND	759076D
300 µL SureOne 移液器吸头	Fisher Scientific	02-707-411
5 mL 血清移液器	Fisher Scientific	13-678-11D
酸性酪蛋白（酪胺酸）	Fisher Scientific	BP-1424-500
分析天平	梅特勒-托利多	30243397
培养皿	康宁	猎鹰 351008
生物安全柜	Labconco	Logic Class II，A2  302310102
生物光谱仪	Eppendorf	动力学 6136000010
牛血清 白蛋白	Fisher 生物试剂	BP1600-100
柠檬酸	Fisher Scientific	A940-500
CytoFLEX 流式细胞术分析仪	Beckam Coulter	Cytoflex C09745	CytExpert 软件
Dextrose	Fisher Scientific	D16-1
二硫苏糖醇	Fisher 生物试剂	BP172-5
驴抗山羊 FITC	Invitrogen	A16000
EDTA	Alfa Aesar	H56165.30
Ez-Link PEG4-NHS-生物素	Thermo Scientific	A39259
冷冻-EZ酵母转化II试剂盒	Zymo Research	T2001
半乳糖	Fisher Scientific	BP656-500
通用冰箱	Marvel Scientific	MS24RAS4RW
山羊抗 myc 标签抗体	Bethyl	A190-104A
微管离心机	Eppendorf	5425 R 5406000313
迷你低温冷藏培养箱	Fisher Scientific	15-015-2632
小鼠抗磷酸酪氨酸抗体 4G10	BioXcell	BE0194
Parafilm M	Bemis	M PM999
磷酸盐缓冲盐水	Fisher 生物试剂	BP399-500
移液器控制器	Eppendorf	easypet 3 4430000018
子糖	Thermo Scientific	J21060-36
重组人活性 SHP-2 蛋白	R&D Systems	1894-SH
冷冻离心机	Eppendorf	5910 R
酿酒酵母 酵母表面展示菌株 EBY 100	ATCC	MYA-4941
摇床培养箱	Eppendorf	M1335-0002 新不伦瑞克省 Innova 42
单通道移液器组	Eppendorf	05-403-151
氯化钠	Fisher Scientific	S671-500
柠檬酸钠二水合物	Fisher Scientific	S279-500
磷酸二钠 七水合物	Fisher Scientific	S373-500
磷酸钠一水合物	Fisher Scientific	S468-500
链霉亲和素 Alexa Fluor 647	Invitrogen	S32357
顶部装载天平	梅特勒-托利多
Tris 盐酸盐	EMD Millipore	648317-100GM
管式左轮手枪旋转器	Fisher Scientific	11-676-341
称重纸	Fisher Scientific	09-898-12B
酵母氮基	BD Difco	291940
Zeba 离心脱盐柱	Thermo Scientific	89883