由遗传转化介导 根癌农杆菌 在 龙葵

摘要

本文提供了一种由根癌农杆菌介导的遗传转化方法的详细实验方案，用于生产转基因龙葵（Agrobacterium tumefaciens介导的Solanum nigrum遗传转化）。

摘要

Solanum nigrum 是马铃薯和番茄的一种孤儿茄科近缘种，其新鲜果实是一种营养丰富且美味的浆果。S. nigrum 全株可入药。然而，野生型 S. nigrum 具有一些不良性状。幸运的是，基因工程技术，尤其是 CRISPR/Cas9 等基因编辑技术，为快速改良 S. nigrum、克服这些缺陷提供了宝贵机遇。在大多数植物中，基因编辑技术介导的植物改良通常通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的遗传转化实现。本文详细描述了 A. tumefaciens 介导的 S. nigrum 遗传转化方案。S. nigrum 幼苗的子叶和下胚轴被用作遗传转化的外植体。由于 S. nigrum 对卡那霉素具有抗性，因此使用 DsRed 基因作为可视化标记以鉴定转基因植株。按照本操作方案可高效完成 S. nigrum 的遗传转化。T1 代转基因植株可通过是否发出红色荧光进行直接鉴定，无需进行 PCR 检测。

引言

Solanum nigrum（称为龙葵，2n = 6x = 72）是马铃薯和番茄的茄科近缘种¹。 其果实为球形浆果，成熟后变为黑色。新鲜果实是一种营养丰富且味美可口的浆果。整株S. nigrum均可入药，具有活血化瘀、消肿、清热解毒的功效。S. nigrum以胆固醇为共同前体合成两类不同的特化代谢产物：叶片中合成甾体皂苷，浆果中合成甾体糖苷生物碱（SGAs）。源自S. nigrum的甾体皂苷——乌托苷B（Uttroside B），最近已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准作为治疗肝细胞癌的孤儿药²。在S. nigrum中敲除GAME15基因可导致植株完全缺失皂苷和甾体生物碱，同时揭示了甾体皂苷对严重农业害虫具有控制作用²。S. nigrum中的多酚类物质通过影响脂肪细胞和脂质代谢，可减轻体重和体脂含量³。S. nigrum能够富集镉，被用作研究镉富集的模式植物^4,5。S. nigrum是一种未驯化的植物，其研究基础相对薄弱。近年来，针对S.....

方案

1. 无菌苗培养

注意：以下步骤均在超净工作台中进行。

1. 采集野生种子 S. nigrum 在中国聊城市采集并命名为 Snlc1。取 50 粒野生种子 S. nigrum 将其放入2 mL离心管中。用1 mL 5%赤霉素溶液浸泡30分钟后，弃去赤霉素溶液。
2. 加入1 mL 75%乙醇，振荡1分钟，然后弃去乙醇。
3. 加入1 mL 2%次氯酸钠溶液，对种子表面消毒10分钟。充分振荡离心管，以彻底灭菌种子表面。10分钟后，弃去次氯酸钠溶液。
4. 用无菌水清洗种子5次，以去除残留的次氯酸钠。将种子置于直径为90 mm的培养皿中，培养皿内含有1/2 MS固体培养基。将培养皿放入植物培养室中，在25 °C、16小时光照/8小时黑暗的光周期条件下培养。图1A).

2. 培养 A. tumefaciens LBA4404

1. 通过电穿孔法，使用 MicroPulser（参数：电压 1800 V，电容 25 µF，电阻 200 Ω，比色杯 1 mm）将携带红色荧光基因 DsRed2 的双元载体 pRed1305

结果

由遗传转化介导 Agrobacterium tumefaciens 以产生转基因生物 S. nigrum.
接种子叶和下胚轴后 S. nigrum 幼苗与 A. tumefaciens，我们可以确定是否 农杆菌 感染成功，因为 DsRed 用作报告基因。感染后3-4周，伤口部位出现红色荧光（图1D,E），这表明 农杆菌 感染成功。几乎所有外植体上均可观察到红色荧光，且感染率 农杆菌 达到100%（图1E）。由于未向SD培养基中添加抗生素，因此生长出大量非转基因芽（.......

讨论

迄今为止，不同实验室已建立了由A. tumefaciens介导的S. nigrum遗传转化方法^8,9,10,11。这些转化方法大多使用卡那霉素作为筛选物质^8,9,10,11。然而，S. nigrum对卡那霉素不敏感，因此需要较高浓度的卡那霉素进行筛选，这可能导致产生非阳性转化子¹⁰。在本实验方案中，采用红色荧光报告基因DsRed作为报告基因。通过执行本步骤中的操作，可完成由A. tumefaciens

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2X SanTaq PCR 预混液（含蓝色染料）	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B532061	2X SanTaq PCR 预混液包含 MgCl?、dNTPs、Taq DNA 聚合酶、PCR 缓冲液、上样染料和 PCR 增强剂。
6-BA	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	C14819266	人工细胞分裂素
琼脂	天津大茂化学试剂合伙企业（有限合伙）	CAS NO:9002-18-0	固体
AS	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	K914BA0002	诱导农杆菌高效表达
Carb	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		抗生素
Cef	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	I526BA0010	抗生素
赤霉素	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	K514BA0009	促进种子萌发
卡那霉素	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	I614BA0013	抗生素
LB 培养基	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B540113	用于细菌培养
MicroPulser (Gene Pulser Xcell)	Bio-Rad, US	617BR1 06783	Gene Pulser Xcell
MS 固体培养基	phytotech Co., Ltd., US	HCA0519228A	Murashige & Skoog 基础培养基（含维生素），M519
塑料盒	辽苏，中国	T909H	植物种植盒
利福平	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	S180305	抗生素
蔗糖	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	CAS NO:57-50-1	作为碳源
Tanon-5200Multi 仪器	Tanon Co., Ltd., 中国	5200Multi	加速分离
野生龙葵（Solanum nigrum）			采自聊城市
ZT	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	J921BA0014	植物生长调节剂