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方法文章

由遗传转化介导 根癌农杆菌 在 龙葵

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DOI：

10.3791/68212

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2025年6月24日

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Agriculture and Life Science, Liaocheng University

本文内容

摘要

本文提供了一种由根癌农杆菌介导的遗传转化方法的详细实验方案，用于生产转基因龙葵（Agrobacterium tumefaciens介导的Solanum nigrum遗传转化）。

摘要

Solanum nigrum 是马铃薯和番茄的一种孤儿茄科近缘种，其新鲜果实是一种营养丰富且美味的浆果。S. nigrum 全株可入药。然而，野生型 S. nigrum 具有一些不良性状。幸运的是，基因工程技术，尤其是 CRISPR/Cas9 等基因编辑技术，为快速改良 S. nigrum、克服这些缺陷提供了宝贵机遇。在大多数植物中，基因编辑技术介导的植物改良通常通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的遗传转化实现。本文详细描述了 A. tumefaciens 介导的 S. nigrum 遗传转化方案。S. nigrum 幼苗的子叶和下胚轴被用作遗传转化的外植体。由于 S. nigrum 对卡那霉素具有抗性，因此使用 DsRed 基因作为可视化标记以鉴定转基因植株。按照本操作方案可高效完成 S. nigrum 的遗传转化。T1 代转基因植株可通过是否发出红色荧光进行直接鉴定，无需进行 PCR 检测。

引言

Solanum nigrum（称为龙葵，2n = 6x = 72）是马铃薯和番茄的茄科近缘种1。 其果实为球形浆果，成熟后变为黑色。新鲜果实是一种营养丰富且味美可口的浆果。整株S. nigrum均可入药，具有活血化瘀、消肿、清热解毒的功效。S. nigrum以胆固醇为共同前体合成两类不同的特化代谢产物：叶片中合成甾体皂苷，浆果中合成甾体糖苷生物碱（SGAs）。源自S. nigrum的甾体皂苷——乌托苷B（Uttroside B），最近已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准作为治疗肝细胞癌的孤儿药2。在S. nigrum中敲除GAME15基因可导致植株完全缺失皂苷和甾体生物碱，同时揭示了甾体皂苷对严重农业害虫具有控制作用2。S. nigrum中的多酚类物质通过影响脂肪细胞和脂质代谢，可减轻体重和体脂含量3。S. nigrum能够富集镉，被用作研究镉富集的模式植物4,5。S. nigrum是一种未驯化的植物，其研究基础相对薄弱。近年来，针对S. nigrum的研究逐渐增多，令人鼓舞。六倍体S. nigrum的基因组最近已完成组装，且S. nigrum可能起源于其二倍体祖先Solanum americanum（2n = 2x = 24）6,7。因此，S. nigrum是一种兼具药用与食用价值的植物。对S. nigrum的研究不仅有助于深入理解其在人类疾病治疗中的潜在应用，也为提升农业生产提供了宝贵的科学依据。因此，建立S. nigrum的遗传转化体系，是利用转基因和基因编辑技术对其进行遗传改良的基础。

有数份报告重点关注 根癌农杆菌介导的遗传转化 S. nigrum8,9,10,11在我们之前的研究中，我们建立了一种 A. tumefaciens LBA4404介导的遗传转化系统 S. nigrum，并转化 AcMYB110 进入 S. nigrum，获得新的种质资源 S. nigrum 花青素含量增加1转基因与基因编辑 S. nigrum 植物通过以下方式获得 A. tumefaciens EHA105介导的遗传转化10不同的荧光蛋白具有绿色、红色、黄色、橙色和蓝色的荧光发射，广泛用于指示细胞生命活动。12在植物遗传转化过程中，红色荧光基因常被用作报告基因，以区分转基因事件与非转基因事件13. 使用 DsRed 以基因作为报告基因可方便地区分转基因事件，而使用R2R3-MYB转录因子作为报告基因时可能受到植物基因型的影响14在转基因后代中，也可利用光学仪器（如荧光显微镜或成像系统）轻松区分转基因植株与非转基因植株，从而无需依赖基于PCR的鉴定方法。通过将荧光蛋白报告基因与CRISPR基因编辑技术相结合，可精确敲除玉米中的育性相关基因，进而创制出核不育系及可控的核不育保持系。15保持系植株自花授粉并结实后，将产生保持系与不育系比例为1:1的后代。根据不同的发光特性，可通过肉眼或机器识别，对保持系和不育系种子进行无损分选。15因此，利用荧光蛋白基因作为报告基因，无需PCR分析即可简便地鉴定转基因种子或植株，这在遗传转化领域具有显著优势。本方法旨在描述该技术的实验方案。 根癌农杆菌介导的遗传转化在 S. nigrum，使用红色荧光基因， DsRed作为报告基因。

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方案

1. 无菌苗培养

注意：以下步骤均在超净工作台中进行。

  1. 采集野生种子 S. nigrum 在中国聊城市采集并命名为 Snlc1。取 50 粒野生种子 S. nigrum 将其放入2 mL离心管中。用1 mL 5%赤霉素溶液浸泡30分钟后，弃去赤霉素溶液。
  2. 加入1 mL 75%乙醇，振荡1分钟，然后弃去乙醇。
  3. 加入1 mL 2%次氯酸钠溶液，对种子表面消毒10分钟。充分振荡离心管，以彻底灭菌种子表面。10分钟后，弃去次氯酸钠溶液。
  4. 用无菌水清洗种子5次，以去除残留的次氯酸钠。将种子置于直径为90 mm的培养皿中，培养皿内含有1/2 MS固体培养基。将培养皿放入植物培养室中，在25 °C、16小时光照/8小时黑暗的光周期条件下培养。图1A).

2. 培养 A. tumefaciens LBA4404

  1. 通过电穿孔法，使用 MicroPulser（参数：电压 1800 V，电容 25 µF，电阻 200 Ω，比色杯 1 mm）将携带红色荧光基因 DsRed2 的双元载体 pRed130516 转化至农杆菌 A. tumefaciens LBA4404 中。在含 50 mg/L 卡那霉素和 50 mg/L 利福平的固体 LB 培养基上，于 28 °C 培养 48 h。
  2. 挑取一个携带 pRed1305 的 LBA4404 单克隆，接种于 15 mL 离心管中含 50 mg/L 卡那霉素和 50 mg/L 利福平的 1 mL 液体 LB 培养基中，在 28 °C、180 rpm 条件下于摇床中培养 12 h。
  3. 向 1 mL 菌液中加入 50 mL 含相同抗生素的液体 LB 培养基，于 28 °C、200 rpm 条件下在摇床中继续培养 6 h。
  4. 当菌液 OD600 达到 0.4 时停止培养，于 25 °C 以 2200 × g 离心 10 min。
  5. 用侵染液（IS：M519 4.43 g/L，蔗糖 30 g/L，6-BA 2 mg/L，AS 100 µmol/L，pH 5.8）重悬菌体沉淀，并用分光光度计将菌液浓度调整至 OD600 = 0.6。

3. 外植体感染 A. tumefaciens

注意：以下步骤均在超净工作台中进行。

  1. 将种子培养7天，直至幼苗子叶展开（图1B）。在含有经细菌IS溶液润湿的滤纸的培养皿中，用灭菌的锋利解剖刀从幼苗上切下两片子叶和长约1 cm的下胚轴，并弃去主根。使用解剖刀时需小心谨慎。
  2. 将外植体浸入侵染液中30分钟。将外植体置于干燥的滤纸上，使外植体表面的菌液被吸收。
  3. 将外植体放置于IS固体培养基（0.7%琼脂；图1C）上。将外植体置于19 °C、无光照的植物培养室中，培养3天。

4. 外植体的分化

注意：以下步骤均在超净工作台中进行。

  1. 从19 °C的植物培养室中取出外植体，用无菌水清洗5次，然后将外植体置于干燥的无菌滤纸上。
  2. 将外植体放入芽分化（SD）培养基中（SD：M519 4.43 g/L，蔗糖 30 g/L，6-BA 2 mg/L，ZT 0.5 mg/L，Cef 100 mg/L，Carb 100 mg/L，0.7 g/L 琼脂，pH 5.8），在25 °C下培养4周（图1D，E）。
  3. 使用解剖刀切下在手持式荧光灯绿色激发光下显示红色荧光的外植体的愈伤组织/芽，然后将其转移至新的SD培养基中，在25 °C下继续培养4周（图1F，G）。

5. 生根与移栽

  1. 使用手持荧光灯切下发出红色荧光的芽，将其转移至生根培养基（RM：M519 4.43 g/L，蔗糖 30 g/L，6-BA 2 mg/L，ZT 0.5 mg/L，Cef 100 mg/L，Carb 100 mg/L，琼脂 0.7 g/L，pH 5.8），在 25 °C 下培养 2–4 周，以促进生根。
  2. 将根长超过 2 cm 且显示红色荧光的幼苗移栽至土壤中（图 1H-K）。移栽前，手动去除根部的琼脂，以避免根部细菌过度生长。

6. 使用 PCR 扩增检测转基因 T0 植株

  1. 采用十六烷基三甲基溴化铵（Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide, CTAB）法提取独立转基因株系的基因组DNA17。
  2. 以10 ng基因组DNA为模板，使用RedF（5'-TGGCCTCCTCCGAGAAC-3'）和RedR（5'-CGGAGGGGAAGTTCACG-3'）引物组合，在15 µL反应体系中扩增DsRed基因，反应体系包含7.5 µL 2x PCR预混液和各0.3 µL（10 µmol/L）引物。预期扩增产物片段大小为393 bp。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，以鉴定是否为转基因植株。

7. 使用荧光灯鉴定 T1 代转基因植株

  1. 采集转基因T0代龙葵（S. nigrum）果实，待其完全变为黑紫色后，手工挤出果实内的种子，并于室温下自然风干约1周。
  2. 将干燥的种子按照本实验方案的步骤1.1至1.4接种于1/2 MS培养基中，在植物培养室中培养1周，使用手持式荧光灯区分转基因幼苗与非转基因幼苗。

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结果

由遗传转化介导 Agrobacterium tumefaciens 以产生转基因生物 S. nigrum.
接种子叶和下胚轴后 S. nigrum 幼苗与 A. tumefaciens，我们可以确定是否 农杆菌 感染成功，因为 DsRed 用作报告基因。感染后3-4周，伤口部位出现红色荧光（图1D,E），这表明 农杆菌 感染成功。几乎所有外植体上均可观察到红色荧光，且感染率 农杆菌 达到100%（图1E）。由于未向SD培养基中添加抗生素，因此生长出大量非转基因芽（...

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讨论

迄今为止，不同实验室已建立了由A. tumefaciens介导的S. nigrum遗传转化方法8,9,10,11。这些转化方法大多使用卡那霉素作为筛选物质8,9,10,11。然而，S. nigrum对卡那霉素不敏感，因此需要较高浓度的卡那霉素进行筛选，这可能导致产生非阳性转化子10。在本实验方案中，采用红色荧光报告基因DsRed作为报告基因。通过执行本步骤中的操作，可完成由A. tumefaciens

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由聊城大学科研基金（318012028）和山东省自然科学基金（ZR2020MC034）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2X SanTaq PCR 预混液（含蓝色染料）Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5320612X SanTaq PCR 预混液包含 MgCl?、dNTPs、Taq DNA 聚合酶、PCR 缓冲液、上样染料和 PCR 增强剂。
6-BASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.C14819266人工细胞分裂素
琼脂天津大茂化学试剂合伙企业（有限合伙）CAS NO:9002-18-0固体
ASSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.K914BA0002诱导农杆菌高效表达
CarbSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.抗生素
CefSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.I526BA0010抗生素
赤霉素Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.K514BA0009促进种子萌发
卡那霉素Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.I614BA0013抗生素
LB 培养基Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B540113用于细菌培养
MicroPulser (Gene Pulser Xcell)Bio-Rad, US617BR1 06783Gene Pulser Xcell
MS 固体培养基phytotech Co., Ltd., USHCA0519228A Murashige & Skoog 基础培养基（含维生素），M519
塑料盒辽苏，中国T909H植物种植盒
利福平Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.S180305抗生素
蔗糖Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.CAS NO:57-50-1   作为碳源
Tanon-5200Multi 仪器Tanon Co., Ltd., 中国5200Multi加速分离
野生龙葵（Solanum nigrum）采自聊城市
ZTSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.J921BA0014植物生长调节剂

参考文献

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