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方法文章

发育和成熟胚乳细胞层显微分析用完整组织的制备 拟南芥 种子

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DOI：

10.3791/68217

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2025年5月16日

 ,  , 
1Department of Life Sciences, School of Agriculture, Meiji University, 2Organization for the Strategic Coordination of Research and Intellectual Properties, Meiji University, 3Plant Functional Biotechnology, Agro-Biotechnology Research Center, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo

本文内容

摘要

本实验方案描述了拟南芥（Arabidopsis thaliana）种子中完整胚乳细胞层样品的制备方法。该方法仅需常规实验室设备，如注射针和精密镊子，即可实现对发育中和成熟种子胚乳细胞的高分辨率荧光活细胞成像。

摘要

拟南芥种子中，胚乳是位于胚胎与种皮之间的一层活细胞，在调控种子成熟、休眠和萌发过程中发挥着关键作用。对完整胚乳细胞进行显微分析，对于在细胞和分子水平上理解胚乳的生理功能至关重要。然而，由于拟南芥种子体积微小，且胚乳细胞层位于种皮之下，样品制备一直存在挑战。本文详细介绍了适用于发育中和成熟种子中完整胚乳细胞层样品的制备方法，可用于显微观察与分析。该方法无需固定或切片，即可观察大范围区域和大量完整的胚乳细胞。此外，该实验方案仅需使用常规实验室设备，如注射针、精密镊子和体视显微镜。该方法成功实现了对完整胚乳细胞中荧光信号（如绿色荧光蛋白，GFP）的高分辨率活细胞成像。利用此方法，可在不同拟南芥突变体的胚乳细胞中观察多种蛋白质的细胞内定位与运动，以及细胞器的形态。该实验方案有助于揭示胚乳的新功能，并拓展了对该重要组织进行细胞与分子研究的可能性。

引言

由于植物是固着生物，种子萌发是决定其命运的关键事件。是否萌发的决策受到内部和环境因素的严格调控，例如种子的初生休眠程度、温度、光照强度与波长以及氮浓度1,2,3,4,5,6。种子具有由多种组织类型构成的复杂结构7。在拟南芥（Arabidopsis）干燥种子中，将发育成幼苗的胚被单层胚乳和最外层的种皮所包围。种皮由多层死细胞组成，而胚和胚乳即使在干燥种子中仍保持存活状态。胚乳通常被视为一种为胚生长提供养分的贮藏组织，并与种皮共同对胚根突出提供机械阻力8,9,10,11,12,13。

最近的多项研究表明，胚乳在调控种子最佳萌发过程中起着至关重要的作用14,15,16,17。例如，胚乳细胞中的光感受器光敏色素B（PHYB）能够感知 红光（R）或 远红光（FR），从而调控萌发反应15。胚乳还具有温度感知组织的功能，在高温条件下抑制萌发反应16。胚乳的质量控制对于种子的最佳萌发至关重要，尤其是在长期贮藏的种子中17。

活细胞成像现已成为进一步阐明胚乳生理功能的必要手段。对表达荧光标记蛋白的完整胚乳细胞进行显微分析，有助于研究胚乳调控种子萌发的分子机制。然而，制备可用于显微观察的完整胚乳细胞具有较大挑战性，尤其是在拟南芥（Arabidopsis）种子中。这些种子直径约为0.4 mm，胚乳位于胚胎与种皮之间，仅为单层细胞，使得精确操作极为困难。因此，尽管胚乳具有重要的生理作用，却极少通过活细胞成像技术对其进行观察。

本文介绍了一种快速制备完整胚乳细胞层样品的方案，适用于发育中和成熟种子的活细胞成像。

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方案

在本研究中，建立了两种不同的方法用于制备活体胚乳细胞层样品：一种适用于发育中的种子，另一种适用于成熟种子。根据种皮的坚硬程度不同，所需的操作方法略有差异。所用试剂和设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 从发育中的种子制备完整的胚乳样品

  1. 角果采集
    1. 培养 拟南芥 在土壤或岩棉上种植植物直至开花。
    2. 用彩色线标记完全开放的花朵（开花后0天，0 DAF）。
      注意：避免使用绿色、黄色或棕色的线标记花朵，因为这些颜色与正在生长或成熟的植株及角果难以区分。
    3. 在果柄处切下标记的正在发育的角果（如图所示） 图1(1) 并将其收集至 1.5 mL 离心管中。
      注意：发育中的角果在授粉后12-16天适用于本方案的制备。
  2. 发育中种子的解剖
    注意：以下步骤必须在湿润的滤纸上进行，以防止样品干燥。操作应在体视显微镜下进行。
    1. 分裂一个阀门（如图所示） 图1(2)）从隔膜（图中所示） 图1（1）使用两把镊子：一把尖端较粗，用于夹持；另一把尖端尖锐，用于撕开。
    2. 用镊子夹住尖端闭合的镊尖，轻轻从角果中取出正在发育的种子，以避免损伤种子（图1(2)).
    3. 用镊子夹住种子，避免压碎种子，然后进行操作 使用注射针（27 G，0.40 mm × 19 mm）在包围胚的种皮和胚乳上制造一个约0.2 mm大小的切口图1(3)).
      注意：制作切口的最佳位置位于子叶与胚根的交界处。
    4. 用镊子夹住种子以挤出胚胎图1(4) 不要压碎由种皮和胚乳组成的空种荚，尽量保持其圆形形态。
    5. 将注射针插入空的种子囊膜的种脐处，从内向外穿刺图1(5)).
    6. 保持针头位置不变，用闭合的镊子尖端刮擦种皮表面，并剪开空种荚的一侧，使其打开（图1(6)).
    7. 使用尖头镊子将空的种子信封展开成一张纸图1（7））。此时样品应被分离为由胚乳和种皮层组成的双层片状结构（图1(8)).
      注意：如果在下方步骤3中使用水作为封片介质时样品容易卷曲，可将片状样品分割成两部分。从约授粉后18天（18 DAF）的角果中收获的种子（此阶段种皮呈褐色但尚未完全干燥）也可采用本方案处理，但在制样前需将种子浸水数分钟。

2. 成熟种子完整胚乳样品的制备

  1. 成熟种子的吸胀作用
    1. 向含有干燥物的1.5 mL离心管中加入1 mL双蒸水 拟南芥 种子。
    2. 将种子在室温下浸润至少40分钟（图2(1)).
      注意：干燥种子及吸水后40分钟内的种子在步骤2.2.1和2.2.2中难以对种皮和胚乳进行划伤，且难以在不损坏空种壳的情况下取出胚；而较长的吸水时间有利于操作。
    3. 使用1000 µL移液器将吸胀的种子转移到湿润的滤纸上。
  2. 成熟种子的解剖
    注意：以下步骤必须在湿润的滤纸上进行，以防止样品干燥。操作应在体视显微镜下进行。
    1. 用镊子夹住种子，避免压碎，使用注射针在包围胚的种皮和胚乳上制造一个约0.2 mm大小的切口图2(2)). 
    2. 用镊子夹住种子，将胚胎挤出图2（3）不要压碎空的种皮囊，其包含种皮和胚乳。尽量保持其圆形形状。
    3. 用注射针将空的种子囊的上下两侧切开，使其形成圆筒状（图2(4)).
    4. 沿圆柱形空种皮的中心轴切开，将其分为两部分图2(5)。样品应分离为由胚乳层和种皮层组成的双层片状结构（图2(6)).

3. 显微镜观察

  1. 将胚乳样品以片状置于载玻片上，并用水或全氟十氢化萘（PFD）封片。
    注意：如果样品与盖玻片之间残留气泡，使用全氟十氢化萘（PFD）会特别有效，已有文献报道其在成像含有气室的样品（如叶片）时效果良好18,19。PFD具有最低的表面张力，能够轻易填充样品表面的空气间隙。然而，对于延时成像，建议使用水作为封片介质，因为成熟种子中的水分含量应保持充足，以维持细胞的流动性。
  2. 轻柔地将盖玻片覆盖在样品上，确保胚乳层朝向盖玻片。
    注意：可使用指甲油或封片膏密封盖玻片边缘，以防止样品和封片介质脱水。

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结果

根据图1所示的方案，从开花后14天（DAF）采集的角果中分离发育中的种子以制备胚乳样品（在此阶段，种皮仍为绿色）。在较大区域内观察到大量胚乳细胞及其细胞内结构（图3A）。本实验使用C末端融合GFP的PHYB蛋白（PHYB-GFP）表达的种子。众所周知，PHYB在红光激活后会转位至细胞核，并形成称为光体（photobodies, PBs）的PHYB阳性斑点，这些结构参与调控种子萌发4,20,21,22。样品取自在22 °C连续白光条件下生长的植株。如图3B所示，在胚乳细胞的细胞核内检测到了PBs。该结果与先前研究一致，表明胚乳中的PHYB可调控种子的最适萌发15...

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讨论

通过分离种子组织（如基因表达分析以及脂质和植物激素的定量）进行的遗传学和生物化学分析，揭示了胚乳在种子萌发中的作用9,14,25,26,27。一个 体外 种子外壳铺垫实验，将空的种子包被（胚乳和种皮）与来自不同来源的分离胚结合 拟南芥 突变体，揭示了萌发过程的分子机制14,15,16,28。然而，由于样品尺寸微小，显微观察的样品制备一直具有挑战性 拟南芥 种子及种皮下方胚乳细胞层的位置。特别是，在种子发育过程...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢京都大学的Matsushita博士和Oka博士提供了由35S启动子驱动表达PHYB-GFP的phyB突变体。本研究部分得到了创新领域科学研究所专项基金、提议研究领域项目（19H05713至K.Y.）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管Watoson Bio Lab131-815C
盖玻片（18 x 18 mm）Matsunami Glass Ind.,Ltd.C218181
DDW封片用水
滤纸 No.526（400 x 400 mm）ADVANTEC VIETNAM CO., LTD.02453400 
Genki-kun Seru Senyo yodo kopu N-150 (55 L)Katakura & Co-op Agri Corporation植物生长用土壤
载玻片（26 mm x 76 mm）Matsunami Glass Ind.,Ltd.S1215
Grodan AO 36 x 36 x 40 mm 立方体Grodan植物生长用岩棉
Iris 剪刀Premium Plus Japan Co.,Ltd.FC-0212
珠宝镊子，Dumont No. 5（4 1/4 英寸）DumontF6521撕裂用镊子
Leica Application Suite X (LAS X) LeicaSterallis 8 软件
Leica Microsystems 显微镜浸油极低自发荧光浸油THMOIL-10LF
LIOR 精密镊子 110 mm  SL-14KENIS Ltd.KN33450438夹持用镊子 
NAIL HOLICKOSE指甲油
针头 27G 3/4（19 mm）RB Misawa Medical Industry Co., Ltd.切割用注射针头
Nichipet Air 1000 μLNichiryo00-NAR-10001000 µL 微量移液器
全氟十氢化萘APOLLO SCIENTIFICPC5960封片试剂
红光/远红光 LED 面板TOKYO RIKAKIKAI CO., LTD.10147599
Schappe Spun #60Fujix Co., Ltd.线
SPINKOTE 润滑脂 2 ozBECKMAN COULTER306812润滑脂
Sterallis 8Leica共聚焦激光扫描显微镜
体视显微镜 Stemi 305 cam WCarl Zeiss NTS Ltd.491903-0017-000
白光 LEDPANASONICFL40SSW/37

参考文献

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