方法文章

用于发育中和成熟 拟南芥 种子胚乳细胞层显微分析的完整组织的制备

DOI：

10.3791/68217

⸱

2025年5月16日

 ,  , 
1Department of Life Sciences, School of Agriculture, Meiji University, 2Organization for the Strategic Coordination of Research and Intellectual Properties, Meiji University, 3Plant Functional Biotechnology, Agro-Biotechnology Research Center, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo

本文内容

摘要

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该方案描述了拟南 芥 种子中胚乳细胞层完整样品的制备。该方法只需要常见的实验室设备，例如注射针和精密镊子，并能够对发育中和成熟种子中的胚乳细胞进行高分辨率荧光活细胞成像。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在 拟南芥 种子中，胚乳是位于胚胎和睾丸之间的单层活细胞，在调节种子成熟、休眠和发芽方面起着关键作用。完整胚乳细胞的显微分析对于在细胞和分子水平上了解胚乳的生理功能至关重要。然而，由于 拟南芥 种子的小尺寸和胚乳细胞层位于睾丸下方，样品制备一直具有挑战性。本文详细介绍了适用于发育中和成熟种子的显微镜观察和分析的完整胚乳细胞层样品的制备。这种方法能够观察大面积和大量完整的胚乳细胞，而无需固定或切片。此外，该方案仅使用标准实验室设备，例如注射针、精密镊子和体视显微镜。这种方法成功地实现了完整胚乳细胞中荧光信号的高分辨率活细胞成像，例如绿色荧光蛋白 （GFP）。该方法允许观察不同 拟南芥 突变体的胚乳细胞中各种蛋白质的细胞内定位和运动，以及细胞器的形态。该方案有助于阐明新的胚乳功能，并扩大了这种重要组织的细胞和分子研究的潜力。

引言

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因为植物是无柄生物，所以种子发芽是决定其命运的关键事件。发芽的决定受到内部和环境因素的严格控制，例如初级种子休眠水平、温度、光强度和波长以及氮浓度 1,2,3,4,5,6。种子具有由多种组织类型组成的复杂结构7。在拟南芥干种子中，发育成幼苗的胚胎被单层胚乳和最外层的睾丸包围。睾丸由多层死细胞组成，而胚胎和胚乳即使在干燥的种子中也保持活力。胚乳通常被认为是一种储存组织，为胚胎生长提供营养，并与睾丸一起赋予对胚根突出的机械抵抗力 8,9,10,11,12,13。

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方案

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在本研究中，建立了两种不同的程序来制备活的胚乳细胞层样品：一种用于发育种子，一种用于成熟种子。根据 Testa 的坚固性，需要略有不同的方法。所用试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 从发育中的种子中制备完整的胚乳样品

  1. 角果收集
    1. 在土壤或岩棉上种植 拟南芥 植物直到开花。
    2. 用彩色线标记完全开放的花（开花后 0 天，0 DAF）。
      注意：避免使用绿色、黄色或棕色线来标记花朵，因为这些颜色很难与生长或成熟的植物和角果区分开来。
    3. 切掉花梗处标记的发育角果（如图 1（1） 所示）并将它们收集在 1.5 mL 管中。
      注意：从 12-16 DAF 开发角果适合使用此方案进行制备。
  2. 解剖发育中的种子
    注：必须在湿滤纸上执行以下步骤，以防止样品干燥。作应在立体显微镜下进行。
    1. 使用两个镊子从 replum（如图 1（1） 中所示）中分离一个瓣膜（如图 1（2）所示）：一个带有用于固定的粗....

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结果

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使用图 1 所示的方案，从从 14 DAF 的角果收获的发育种子中制备胚乳样品（在此阶段，睾丸仍然是绿色的）。观察到大面积上的大量胚乳细胞及其细胞内结构（图 3A）。在本实验中，使用了在 C 端表达 PHYB 与 GFP 融合的种子 （PHYB-GFP）。众所周知，PHYB 在被红光激活后易位到细胞核并形成 PHYB 阳性斑点，称为光体 （PB），参与种子发芽 4,20,21,22。样品是从 22 °C 连续白光条件下生长的植物中收获的。 如图 3B 所示，在胚乳细胞中检测到细胞核内的 PBs。这一结果与之前的一项研究相吻合，该研究显示胚乳中的 PHYB 调节最佳种子发芽.......

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讨论

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通过使用分离的种子组织的遗传和生化分析，例如基因表达分析以及脂质和植物激素的定量，已经揭示了胚乳在种子发芽中的作用 9,14,25,26,27。体外种皮垫料测定，将空种子包（胚乳和 testa）与从不同拟南芥突变体分离的胚胎相结合，揭示了发芽过程的分子机制 14,15,16,28。然而，由于拟南芥种子的小尺寸和胚乳细胞层位于睾丸下方，用于显微.......

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披露

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作者声明他们没有相互竞争的经济利益。

致谢

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我们感谢京都大学的 Matsushita 和 Oka 博士提供由 35S 启动子驱动的表达 PHYB-GFP 的 phyB 突变体。这项研究部分得到了创新领域科学研究补助金、拟议研究领域研究（19H05713 至 KY）的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管Watoson Bio Lab131-815C
盖玻片 （18 x 18 mm）松波玻璃工业有限公司C218181
DDW装裱用
滤纸 No.526 （400 x 400 mm）ADVANTEC 越南 CO.， LTD.02453400 
Genki-kun Seru Senyo yodo kopu N-150 （55 L）片仓 &Co-op Agri Corporation植物生长用土壤
玻片 （26mm x 76 mm）松波玻璃工业有限公司S1215
Grodan AO 36 x 36 x 40 mm 立方体Grodan岩棉，用于植物生长
鸢尾花 剪刀高级版 日本株式会社FC-0212
珠宝商镊子，Dumont No. 5（4 1/4 英寸）DumontF6521镊
徕卡应用套件 X （LAS X） Sterallis 8 徕
 显微镜用浸油极低自发荧光 浸油THMOIL-10LF
LIOR 精密镊子 110mm SL-14凯尼斯有限公司KN33450438固定的镊子 
NAIL HOLICKOSE指甲油
针 27G 3/4 （19 mm） RB 三泽医疗工业株式会社切割
Nichipet Air 1000 uLNichiryo00-NAR-1000A 1000 & micro 的插入针;L 微量移液器
全氟十卡林APOLLO SCIENTIFICPC5960
红光/远红光 LED 面板TOKYO RIKAKIKAI CO.， LTD.10147599
Schappe Spun #60Fujix Co.， Ltd.螺纹
SPINKOTE 润滑剂 2 盎司BECKMAN COULTER306812润滑脂
Sterallis 8徕卡共聚焦激光扫描显微镜
体视显微镜 Stemi 305 凸轮 WCarl Zeiss NTS Ltd.491903-0017-000
白光 LEDPANASONICFL40SSW/37
载子撕裂用于 卡显微系统的徕卡软件 用于用于 用于安装的试剂

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bentsink, L., Jowett, J., Hanhart, J. C., Koornneef, M. Cloning of DOG1, a quantitative trait locus controlling seed dormancy in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (45), 17042-17047 (2006).
  2. Toh, S., et al.

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