口服β-氨基丙腈联合皮下输注血管紧张素II诱导的小鼠胸主动脉夹层模型

摘要

本方案提供了在小鼠中诱导胸主动脉夹层的详细分步操作流程。具体包括β-氨基丙腈和血管紧张素II所需剂量的精确计算、渗透压泵的填充步骤，以及渗透压泵的植入技术。

摘要

胸主动脉夹层（TAD）是一种致死率极高的心血管疾病，目前缺乏有效的药物治疗方法。建立能够模拟TAD病理生理过程的动物模型，对于研究TAD的内在发病机制至关重要。目前广泛使用的由β-氨基丙腈（BAPN，一种不可逆的、口服有效的赖氨酰氧化酶抑制剂）诱导的小鼠TAD模型存在成功率不稳定的局限性。本方案详细描述了一种已报道的改良型小鼠TAD模型，即通过口服BAPN联合皮下输注血管紧张素II（Ang II）诱导TAD的方法。在连续给予BAPN四周后，再进行24小时Ang II输注，可稳定诱导出具有类似人类TAD特征的小鼠模型，显著提高了TAD模型构建的成功率。口服BAPN可抑制弹性蛋白和胶原蛋白的交联，导致主动脉壁结构破坏，从而在一定程度上引发主动脉扩张和夹层形成；随后输注Ang II进一步加剧主动脉壁的退行性改变，促进TAD的发生。因此，联合使用BAPN与Ang II是一种优化的小鼠TAD建模方法，为深入研究TAD的发病机制及潜在治疗策略提供了有价值的实验工具。

引言

胸主动脉夹层（TAD）是一种严重的主动脉疾病，由胸主动脉壁内出血导致内膜撕裂，进而引起主动脉壁各层分离，血液进入主动脉壁中膜，形成假腔，并对真腔产生压迫^1,2,3。流行病学研究表明，TAD 的年发病率约为每 10 万人中 7 至 9 例⁴。目前认为，TAD 的发病机制主要源于主动脉中膜结构异常及血流动力学改变，高血压、血脂异常和遗传性血管疾病等因素可增加 TAD 的发病风险⁵。外科干预仍是 TAD 的主要治疗手段。然而，由于围手术期风险较高，深入探究 TAD 的发病机制并寻找早期干预方法以延缓疾病进展，对于改善 TAD 患者预后具有重要意义。由于难以直接获取人体样本并在人体上开展实验，因此有必要建立能够模拟人类 TAD 特征的动物模型。

在过去的几十年中，已有大量关于主动脉瘤（AA）动物模型的报道。然而，关于胸主动脉夹层（TAD）模型建立的研究仍然较少；一些研究人员甚至认为TAD是主动脉瘤动物模型的副产物⁶。事实上，由于TAD是由胸主动脉内膜撕裂起始，并伴随假腔迅速扩张所致，这种机制上的显著差异使TAD与主动脉瘤明显不同⁷。迄今为止，β-氨基丙腈（BAPN）诱导的啮齿类动物主动脉夹层是最常用的TAD模型。BAPN是一种特异性且不可逆的赖氨酰氧化酶抑制剂，可抑制主动脉壁中弹性纤维和胶原纤维的交联，广泛应用于主动脉夹层的动物模型构建^8,9,10。在大多数情况下，BAPN被添加至小鼠的饮水中以构建TAD模型，也有报道通过渗透泵联合使用BAPN与血管紧张素II（Ang II）来建立TAD模型^11,12。然而，这些构建TAD模型的方法并未被详细描述。由于小鼠品系、BAPN给药方式以及Ang II浓度和作用时间的不同，不同实验之间TAD病变的发生率和严重程度存在不稳定性。因此，迫切需要一种稳定的方法来构建小鼠TAD模型。

本文详细逐步描述了一种利用含BAPN的饮用水与Ang II渗透泵联合使用构建小鼠TAD模型的简单且高效的方法。该方法适用于大多数实验室，易于掌握，即使没有小鼠模型构建经验的研究人员也能稳定地完成操作。

方案

动物实验方案经天津医科大学机构动物护理和使用委员会批准（批准编号 TMUaMEC 2022036）。本研究使用8周龄C57BL/6J雄性小鼠。所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 动物的维持与分组

1. 将小鼠饲养在标准维持饲料上。本研究使用三周龄的小鼠。
2. 将小鼠随机分配至对照组（Control）、口服BAPN组（BAPN）、口服BAPN联合生理盐水输注组（BAPN + Saline）以及口服BAPN联合Ang II输注组（BAPN + Ang II）（图1）。对照组小鼠给予普通饮用水。
3. BAPN组小鼠饮用添加BAPN的水，剂量为1 mg/g/天，持续4周。在口服BAPN给药4周后，对BAPN + Ang II组小鼠输注Ang II（1 ng/g/min），对BAPN + Saline组小鼠输注等量生理盐水，持续24小时。

2. 制备含BAPN的饮用水

1. 在适应性喂养3天后，连续4周为小鼠提供含BAPN的饮用水，以1天为一个诱导周期。
2. 称量每笼小鼠的体重，以计算饮水中所需的BAPN用量。
3. 记录每笼小鼠过去24小时的饮水量（vol）。
4. 为确保充分饮水，以每日饮水量的1.3倍（1.3 × vol）作为诱导周期的用水量。据此，将所需BAPN质量的1.3倍溶解于计算所得体积的饮水中。详细计算方法及示例见表1。
   注意：此年龄段的小鼠仍处于快速生长期。建议在整个模型诱导期间每日记录小鼠饮水量，并每天更换笼内含BAPN的饮用水。为防止BAPN分解，需用铝箔包裹水瓶以避光。

3. 血管紧张素II质量的计算

1. 称量每只小鼠的体重，并根据最大体重计算实验所需的血管紧张素II（Ang II）质量。
2. 使用计算模板（表2）计算实验所需的血管紧张素II（Ang II）质量。
3. 计算每只小鼠130 µL血管紧张素II（Ang II）溶液所需的Ang II质量，因为每个泵大约需要100 µL。
4. 使用计算模板（表3）计算实验所需的血管紧张素II（Ang II）溶液和生理盐水的填充体积。

4. 血管紧张素 II 溶解

1. 将冻干的Ang II粉末存放在密封小瓶中，置于-80 °C保存。为防止水分冷凝，使用前需先将Ang II恢复至室温，然后离心后再打开。
2. 使用分析天平在无菌微量离心管中称取计算量的Ang II。
3. 向含有冻干Ang II的微量离心管中加入计算体积的生理盐水，充分涡旋振荡直至完全溶解。
4. 根据小鼠体重，在洁净工作台中为每只小鼠单独配制所需浓度的Ang II溶液。将微量离心管倒置，确保溶液充分混匀。

5. 渗透泵填充

1. 从包装中取出渗透泵的两个部件，并使用无菌器械进行泵的准备，以避免感染风险。
2. 使用分析天平称量每个泵（包括泵体和流量调节器），记录数据并用于计算填充率。
3. 将填充管连接至新开封的1 mL无菌注射器上，小心吸取上述制备好的Ang II溶液，注意避免吸入气泡。
4. 将填充管保持向上位置，小心排出注射器中的任何气泡。保持此位置，防止气泡进入填充管。
5. 轻轻将填充管末端插入渗透泵顶部的开口，直至无法再插入为止。
6. 保持渗透泵直立，缓慢推动注射器活塞。一旦Ang II溶液出现在出口处，立即停止并小心移除填充管。
7. 小心且缓慢地将流量调节器插入渗透泵的开口中，直至流量调节器与泵顶部之间无可见缝隙。用无菌吸水纸擦去多余的Ang II溶液。
8. 将装药后的泵在分析天平上称重并记录。泵在灌注前后的重量差即为所加载的Ang II溶液质量。
9. 使用以下公式计算填充率：
   填充率 = (填充后泵的质量 - 空泵质量) / (标准体积) × 100%
   注：填充体积应超过说明书上标注的标准体积的90%。若达到，则填充成功；否则应排空后重新填充。
10. 将填充好的泵置于37 °C的无菌生理盐水中，调节器头部朝上，至少放置6小时，直至植入前。

6. 泵植入手术操作步骤

1. 在泵植入手术前24小时，对所有手术器械（包括剪刀、止血钳、镊子、持针钳和缝合针）进行高压灭菌。
2. 术前2–4小时给予小鼠口服卡洛芬片（5 mg/kg）。将小鼠置于麻醉诱导舱中，使用1.5%–2%异氟烷，气体流速为2 L/min，稳定麻醉状态2分钟。剃除小鼠肩胛中部皮肤约2 cm × 1 cm区域的毛发。
   注意：由于小鼠对异氟烷的反应存在个体差异，可能需要调整浓度以维持稳定的麻醉状态。
3. 将小鼠俯卧位固定，鼻部置于连接异氟烷麻醉机的鼻罩中。在眼睛上涂抹兽用眼膏，防止麻醉期间角膜干燥。在泵植入前及植入过程中，确保小鼠对疼痛刺激无反应。
4. 使用医用碘伏对背部皮肤消毒三次。
5. 使用手术刀在皮肤上小心做一长约1 cm的横向切口。
6. 用弯头镊子轻轻夹住切口边缘，用另一把弯头镊子钝性分离皮下组织，形成可容纳泵的皮下囊袋。确保囊袋足够大，使泵可在其中自由移动。
7. 将装满药物的泵插入皮下囊袋，使流速调节头朝向小鼠尾部方向。留出足够空间以便缝合切口，避免皮肤过度拉伸。
8. 泵植入后，整齐对合切口边缘，使用6-0不可吸收缝线缝合皮肤。
   注意：仔细检查切口部位，确保伤口完全闭合，且泵体未直接压迫切口。
9. 再次用碘伏清洁切口，并使用无菌棉签局部涂抹5%利多卡因麻醉凝胶。关闭异氟烷（0%）。

7. 术后动物护理

1. 泵植入后密切监测小鼠，并将其放置在恢复笼中，同时使用电热毯保温。
2. 让小鼠在温暖的笼子中单独恢复至少20分钟，直至苏醒，然后将其放回原始饲养笼中。
3. 术后最初6小时内每小时观察一次小鼠；随后18小时内每6小时观察一次。根据需要给予术后镇痛处理；若小鼠在血管紧张素II（Ang II）给药期间出现濒死状态或死亡，应立即采集样本。

8. 主动脉的收获、固定、清洗与成像

1. 在实验结束时，使用异氟烷麻醉所有实验组的小鼠，随后通过颈椎脱位法处死小鼠。
2. 将小鼠置于仰卧位，并固定在小鼠解剖板上。在下腹部做一切口，并沿胸壁延伸，直至完全暴露胸腔和腹腔。
   1. 立即在右心房处做一小切口，将无菌注射器插入左心室，通过左心室缓慢注入约10 mL冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS），直至肺和肝脏变为白色。
3. 随后，切除肺、肝、脾和肠道。完全暴露整个主动脉，使用数显卡尺测量胸主动脉的最大直径。从心脏处分离主动脉，并横断所有动脉分支及髂总动脉，以完整获取整段主动脉。
4. 用数码相机拍摄主动脉图像，随后将其置于4%多聚甲醛中固定24–48小时，再进行石蜡包埋以备切片。
   注意：操作时应避免损伤肠道，以免影响组织分析。
5. 使用切片机将主动脉石蜡组织切成3–5 µm厚度的切片，然后进行脱蜡和水化处理。根据试剂盒说明书，分别使用苏木精-伊红（H&E）和弹性-范吉森（EVG）染色试剂盒对切片进行染色。

结果

本研究共纳入70只3周龄雄性C57BL/6J小鼠，随机分为四组：对照组（n = 10）、BAPN组（n = 20）、BAPN + 生理盐水组（n = 20）和BAPN + Ang II组（n = 20）。在BAPN组中，20只小鼠中有11只在给予BAPN后28天发生胸主动脉夹层（TAD），其中4只因主动脉破裂死亡。在BAPN + 生理盐水组中，20只小鼠中有12只发生TAD，4只因破裂死亡。值得注意的是，在BAPN + Ang II组中，所有20只小鼠均发生TAD，其中7只因主动脉破裂死亡。对照组未观察到TAD形成（图2A）。各组代表性主动脉图像见图2B。

各组主动脉最大直径的平均值分别为：对照组 1.00 ± 0.09 mm，BAPN 组 2.57 ± 0.22 mm，BAPN + 生理盐水组 2.57 ± 0.33 mm，以及 B...

讨论

由于对危及生命的胸主动脉夹层（TAD）了解有限，建立稳定的动物模型对于探索TAD发生和进展的分子机制至关重要。β-氨基丙腈（BAPN）是一种赖氨酰氧化酶抑制剂，因其可破坏胶原蛋白和弹性蛋白的交联，从而削弱主动脉壁并增加其对机械应力的易感性，故在TAD的啮齿类动物模型中被广泛应用¹³。然而，单独使用BAPN处理往往导致不同研究中TAD发生率不一致。

作为一种赖氨酰氧化酶抑制剂，BAPN 可不可逆地抑制弹性蛋白和胶原蛋白的交联¹⁰。人们普遍认为，在幼年阶段，这些细胞外基质成分的交联过程仍在持续进行¹⁴。因此，在这一关键发育窗口期给予 BAPN 可能特别有效地干扰基质成熟，从而提高成功诱导胸主动脉瘤（TAD）的可能性。多项研究表明，单独使用 BAPN 即可在幼年小鼠中诱导 TAD，尽管报道的发生率差异较大，在给予 BAPN 4 周后，发生率范围为 9% 至 91%^12,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
富马酸氨基丙腈	Sigma-Aldrich	A3134
分析天平	Radwag	AS 220.R2
麻醉机	上海仁逸生物科技有限公司	MSS-3
血管紧张素II	MCE	HY-13948
C57BL/6J雄性小鼠	集萃药康	N000013
普通饲料	斯贝福（北京）生物技术有限公司	SPF-F02-002
电热恒温水浴槽	一恒科技有限公司	DK-8D
EVG染色试剂盒	索莱宝	G1590
GraphPad Prism	Graphpad	Ver 10.0.2
H&E染色试剂盒	赛维尔	G1076
止血钳	新华医疗仪器有限公司	ZH240RN
异氟烷	RWD	R510-22-10
微量离心管	Axygen Scientific, Inc.	MCT-150-C
持针器	新华医疗仪器有限公司	ZM234R/RN/RB
渗透压泵	Alzet	1003D
多聚甲醛	赛维尔	G1101
PBS, 1x	赛维尔	G4202
生理盐水	赛维尔	G4702
手术刀	新华医疗仪器有限公司	ZB084R/RN
剪刀	新华医疗仪器有限公司	ZC480RN/RB/RNj/RNh
体视显微镜	Leica	EZ4
缝合线	金环医疗器械有限公司	F604
镊子	新华医疗仪器有限公司	ZO022RB