介绍了一种利用蛛网膜下腔病毒灌注实现腺相关病毒广泛递送的新技术。该方法不仅能够确保小鼠新皮层浅层神经元的广泛转导，而且即使使用非特异性启动子，也能实现目的基因在第五层锥体神经元中的选择性表达。
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本文内容
摘要
摘要
重组腺相关病毒是在实验生物学多个领域，特别是在神经科学中，用于递送和表达各种目的基因的灵活而强大的工具。在特定脑区驱动目的转基因表达的最常用方法是将AAV载体直接注射到脑实质中。然而，该方法无法实现某些in vivo实验所需的广泛神经元转导。本文介绍一种基于将病毒注入脑蛛网膜下腔的新型技术，可在小鼠新皮层实现广泛基因表达。这种神经元标记方法不仅能够确保成年小鼠浅层新皮层神经元的广泛转导，而且即使使用CAG等强非特异性启动子，也能在大量第五层锥体神经元中实现高特异性的转基因表达。此外，由于细胞转导发生在距离注射部位较远的位置，该方法有助于保护脑组织，便于后续进行神经元活动的光学或电生理记录。
引言
哺乳动物的大脑由大量相互连接的抑制性、兴奋性和调节性细胞组成，这些细胞通过数万亿个突触形成神经环路1。神经科学的核心挑战之一是解析不同类型细胞在脑环路组织和功能以及行为中的作用。要在大脑内操控特定基因定义的细胞，需要引入并表达外源基因的方法。基于病毒的基因递送系统迄今为止是向中枢神经系统递送基因最有效且最简便的方法2。病毒递送系统基于具有复制能力的病毒（如腺病毒、腺相关病毒（AAVs）、慢病毒和逆转录病毒），这些病毒能够将遗传信息传递至宿主细胞2,3。
基于AAV的载体现已成为将目的转基因递送至脑内细胞的最常用工具之一，广泛应用于基础神经科学研究以及神经系统疾病基因治疗的开发。与其他病毒相比，复制缺陷型AAV具有多种优势特征，使其成为此类应用的理想载体。尤为突出的是，AAV载体能够高效转导非分裂细胞（终末分化细胞），如神经元和胶质细胞，从而实现高水平的转基因表达 体内2. 载体可轻松制备出高功能性滴度，适用于 体内 使用3,4,
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方案
实验使用成年 C57BL/6 小鼠，年龄为 2-4 个月，雌雄均有（俄罗斯科学院谢米亚金-奥夫钦尼科夫生物有机化学研究所普希诺繁殖中心）。小鼠饲养于温度受控的动物房中（22 ˚C ± 2 ˚C，12 小时明暗循环，光照于 08:00 开启），自由摄取食物和水。ad libitum。所有实验操作均按照 ARRIVE 指南和欧盟动物实验指令 2010/63/EU 进行。研究方案经俄罗斯科学院人类神经活动研究所伦理委员会批准（2022 年 2 月 1 日第 1 号协议）。所有努力均旨在尽量减少动物痛苦，并确保结果的可靠性。
1. 手术准备
- 手术开始前，对所有手术器械和材料（纸片和塑料薄膜）进行灭菌处理（使用高压灭菌器或紫外灭菌器）。使用70%乙醇清洁手术区域。
- 检查麻醉系统中的异氟烷液位，必要时进行补充。在诱导室底部放置一张干净的纸巾。
- 将加热垫放置在立体定位仪框架上，并用一张干净的纸巾覆盖垫子。
- 准备一个装有2%次氯酸钠溶液的瓶子，用于收集接触过病毒的微量移液器吸头、管子、棉签及其他物品。
- 从-80 °C冰箱中取出一份AAV样品，置于冰上解冻。
2. 注射器准备
- 使用33G钝头RN针清洗一支5 µL ....
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结果
在一系列初步实验中，我们采用传统的皮层内注射方法，使用携带快速通道视紫红质（oChIEF）基因并融合了EGFP荧光蛋白、在CaMKII启动子驱动下的AAV2病毒，转导小鼠新皮层第五层的锥体神经元。与AAV2的典型特征一致12，我们获得的感染区域相对较小，宽度不超过1 mm（图1A）。然而，在部分实验中，我们观察到AAV2异常广泛的扩散，某些情况下覆盖了超过半个大脑半球的新皮层区域（图1B）。我们推测，这种广泛的病毒分布可能发生在病毒进入蛛网膜下腔后，随脑脊液（CSF）流动而扩散至整个脑表面所致。我们注意到，这种情况通常出现在注射针插入深度较浅（<200 µm），且硬脑膜上的穿刺孔直径恰好与针头直径匹配，从而阻止了病毒颗粒悬液回流时发生。为了可视化这一过程，我们在病毒颗粒注射液中添加了红色荧光纳米颗粒（n = 3只小鼠）。注射3周后，经心脏灌注10%缓冲甲醛溶液，小心地从颅骨中取出脑组织，且未损伤硬脑膜。在落射荧光双目显微镜下观察完整脑组织，发现红色.......
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讨论
我们开发了一种新的方法，通过将AAV2病毒颗粒悬液注射到脑部蛛网膜下腔来转导小鼠新皮层神经元。该方法可实现病毒的广泛分布，感染组织体积几乎是将等量病毒直接注射入脑实质时的四倍。
通过不同途径（例如脑室内、鞘内或小脑延髓池注射）将病毒载体直接注射到脑脊液（CSF）中，是实现中枢神经系统广泛基因递送的常用策略33,34,35。然而，AAV2载体在成年大脑中通过脑室内或鞘内给药时，由于其对室管膜细胞具有高度亲和性，导致脑部转导效率有限28,33,36,37。室管膜细胞以单层形式存在，衬于第三和第四脑室以及脊髓中央管的内表面
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作获得了俄罗斯科学基金会资助，项目编号 20-15-00398P。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 仪器设备 | |||
| 10 µL 气密式进样器，型号 1701 RN（5 µL 75 RN Hamilton 微量进样器） | Hamilton Company | 货号/目录号 # 7634-01，Hamilton 或货号 HAM7634-01，Merck | |
| 33 G RN 针头，尖端类型 3 | Hamilton Company | 货号/目录号 # 7803-05，Hamilton | |
| 双目显微镜 | Nikon 或 Micromed | 型号 MC-4 ZOOM | |
| 基于 Cerna 平台的激光扫描共聚焦显微镜 | ThorLabs | ||
| 冷光源 | RWD | 型号 76312 | |
| Leica VT1000 S 振动切片机 | Leica Biosystems | 76001-014 | |
| 低流量麻醉系统（含启动套件） | Kent Scientific Corporation | 13-005-111（型号 SomnoSuite） | |
| 机械移液器 0.1 – 2.5 µL Eppendorf Research plus | Eppendorf | 3123000012 | |
| 机械移液器 10 – 100 µL Eppendorf Research plus | Eppendorf | 3123000047 | |
| 小鼠剃毛器 | RWD | 型号 CP-5200 | |
| 微型钻机及钻头（0.5 mm，圆形） | RWD | 78001, 78040 | |
| 或台式数字立体定位仪、小鼠麻醉面罩、小鼠耳杆（60 度） | RWD | 型号 68027, 68665, 68306 | |
| 空气压缩机 | Bambi | BB8 | |
| 单通道手动移液器 0.5–10 µL | RAINN | 17008649 | |
| 小型动物立体定位仪 | KOPF | 型号 962 | |
| 立体定位注射器 | Stoelting | 10-000-004 | |
| 手术器械（工具） | |||
| 30 G 牙科针头（Ni-pro） | Biodent Co. Ltd. | 用于切开硬脑膜 | |
| 骨刮匙 | Fine Science Tools | 10075-16 | |
| 骨钳 | Fine Science Tools | 16025-14 | 用于去除颅骨 |
| 弯头刮勺 | Mozhaisk Medical Supplies Factory | 用于从颅腔中取出脑组织 | |
| 牙科磨头 | DRENDEL + ZWEILING | 用于开颅；形状：梨形/圆头圆柱形/圆形；尖端直径：0.55–0.8 mm | |
| 持针器（Halsey 微型持针器） | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| 聚丙烯外科缝线或 Vicryl 外科缝线（5-0，可吸收） | Walter Products (Ethicon) | S139044 (W9442) | |
| 手术刀柄（#3）配手术刀片（#11） | Fine Science Tools | 10003-12, 10011-00 | |
| 剪刀（超窄剪刀） | Fine Science Tools | 14088-10 | 用于剪开皮肤 |
| 剪刀（精细剪刀） | Fine Science Tools | 14094-11 | 用于剪断缝线 |
| PROLENE 外科缝线（聚丙烯） | Ethicon (Johnson & Johnson) | ||
| 镊子（#5 镊子） | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 镊子（抛光不锈钢镊） | Fine Science Tools | 11210-20 | |
| 一次性耗材 | |||
| 1 mL 胰岛素注射器 | SITEKMED | 用于将凡士林油装入微量注射器，或给药 | |
| 细胞培养板 | SPL Life Science | ||
| 棉签 | |||
| 盖玻片 | Fisher Scientific | 12-545E | |
| 胰岛素注射器针头（27 G） | SITEKMED | 用于清除孔洞（开颅部位）中的碎屑 | |
| 无尘擦拭布 CLEANWIPER | NetLink | ||
| 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 纸巾 | Luscan | ||
| Parafilm 封口膜 | StatLab | STLPM996 | |
| 无菌外科手套 | Dermagrip | ||
| 无菌针式滤器（0.2 μm） | Corning | 431229 | |
| 药品/化学品（试剂） | |||
| 10% 缓冲福尔马林或 4% 多聚甲醛 | Thermo Scientific Chemicals | J61899.AK | |
| 碘酒溶液（5%） | Renewal | ||
| 抗生素软膏 Baneocin（杆菌肽 + 新霉素） | Sandoz | 外用抗菌剂 | |
| Aqua Polymount 封片剂 | Poly-sciences | 18606-20 | |
| 羧甲基纤维素眼用凝胶 Vidisic（眼用凝胶） | BAUSCH+LOMB (Santen) | ||
| 羧基修饰红色荧光微球（FluoSphere） | Thermo Fisher Scientific | F-8801 | |
| 地塞米松（4 mg/mL） | Ellara (KRKA) | 合成糖皮质激素 | |
| 蒸馏水 H2O | |||
| 乙醇（70%） | |||
| 氟比洛芬 2.5%（酮洛芬） | VIC | 非甾体抗炎药（NSAIDs） | |
| 葡萄糖溶液 5% | Solopharm | ||
| 山羊抗兔 IgG（H+L）交叉吸附，Alexa Fluor 546 标记 | Thermo Fisher Scientific | A-11010 | |
| 异氟烷 | Karizoo | ||
| 利多卡因溶液（2% / 4%） | Solopharm | ||
| 正常山羊血清（NGS） | Abcam | ab7481 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Eco-servis | ||
| 兔抗小清蛋白抗体 | Merck Millipore | AB15736 | |
| 兔单克隆重组抗钙结合蛋白抗体 | Abcam | ab108404 | |
| 生理盐水（0.9% NaCl 溶于 H2O） | Solopharm | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 50-178-1844 | |
| 凡士林油 | Genel |
参考文献
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).
- Sena-Esteves, M., Gao, G. Introducing Genes into Mammalian Cells: Viral Vectors. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (8), (2020).
- Kootstra, N. A., Verma, I. M.
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