使用低温重合荧光、电子和离子束显微镜对细胞进行靶向研磨的工作流程

摘要

该工作流程能够使用低温三重合成像平台，针对小（轴向范围<1μm）和稀有（每个细胞1个拷贝）的荧光标记生物结构的薄片生产。该平台将荧光显微镜、聚焦离子束铣削和扫描电子显微镜集成在单个焦点位置，并在铣削时实现同步荧光显微镜。

摘要

使用扫描电子显微镜的低温聚焦离子束铣削 （CryoFIB-SEM） 已成为制备用于低温电子断层扫描 （CryoET） 的 200 nm 以下厚度的细胞薄片的主要方法。最近，荧光显微镜已被纳入 CryoFIB-SEM 系统中，以引导薄片生产朝向荧光标记的靶标。然而，在大多数实现中，光学和离子束成像系统在真空室的不同区域具有不同的焦平面，可作为两个独立的显微镜有效地发挥作用。这种配置需要模态之间的图像配准，这通常缺乏可靠地定位小型、稀有结构所需的 精度。我们提出了一种基于定制的三重合成像平台的工作流程，该平台可同时进行荧光成像和聚焦离子束铣削。这允许实时荧光反馈，可用于确定何时终止铣削，以便在最终薄片中保留感兴趣的荧光标记结构。使用这种方法，我们靶向玻璃化巨噬细胞中的微管组织中心（MTOC），并取得了>60%的成功率，随后的低温电子断层扫描和相关光学和电子显微镜证实了这一点。

引言

低温电子断层扫描 （CryoET） 能够以大分子分辨率 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 对接近天然状态的生物标本进行可视化.然而，真核细胞的厚度（通常为几微米）超过 300 kV 电子的平均自由程 （~300 nm），限制了未散射电子的穿透深度，从而限制了可用的样品厚度。为了解决这个问题，可以使用聚焦离子束（FIB）在称为CryoFIB研磨的过程中烧蚀大部分低温保存的细胞，产生足够薄的薄片，用于CryoET成像12,13,14,15,16。

在先前报道的工作流程中，首先通过浸入式冷冻17,18,19将样品保存在玻璃化冰中，然后加载到配备CryoFIB和扫描电子显微镜（SEM）的双光束仪器中。SEM成像可用于识别感兴趣的亚细胞特征，例如细胞器，甚至一些蛋白质结构^20,21。该信息可用于指导 CryoFIB 研磨过程，其中样品以逐步消融方式进行消融，目标是产生适合 CryoET 13,14,22 的 200 nm 以下厚度的薄片。然而，这种方法提出了当前协议解决的两个关键挑战。首先，通常需要获得特定蛋白质结构的冷冻ET，但SEM可能具有破坏性，并且在对未染色的生物材料进行成像时，SEM无法辨别大多数蛋白质结构。如何以无损伤的方式将铣削准确引导到特定的亚细胞区域或含有特定生物分子的区域？其次，即使在产生薄片和随后的冷冻ET之后，由于明确识别所需的分辨率、信噪比和/或对比度不足，在最终重建中识别特定的生物分子也可能具有挑战性。如何在冷冻 ET 重建中确定这些生物分子的空间位置？

为了应对这两个挑战，该领域越来越多地转向荧光显微镜。结合靶蛋白的基因编码荧光蛋白或外源性染料通常用于标记感兴趣的特定生物分子^5,23,24。研磨后采集的玻璃化细胞的低温荧光显微镜可以与所得断层扫描相关联。这种方法被称为低温相关光电显微镜（CryoCLEM），已得到广泛应用，并已广泛用于定位CryoET重建中的特定蛋白质5,12,23,24。最近的进展包括使用荧光生物传感器和超分辨率方法来增强互补信息和空间精度25,26,27,28,29。

CryoCLEM 是克服上述第二个挑战的一种方法，可以确定薄片内特定蛋白质的位置。然而，如果最终薄片不含感兴趣的蛋白质，CryoCLEM 对用户没有任何作用。值得庆幸的是，荧光显微镜也可用于将铣削引导到标记的感兴趣区域。虽然荧光引导FIB铣削是比CryoCLEM较新的发展，最初的工作流程大约在十年前出现¹²，但它已经得到了快速和广泛的采用。早期的方案依靠外部光学显微镜来获取 2D 或 3D 荧光数据集，然后在将样品转移到 CryoFIB-SEM 后将其配准到 SEM 和离子束图像中。最近，荧光显微镜已直接集成到 CryoFIB-SEM 真空室中。这种集成减少了转移过程中的冰污染，并能够更轻松地对最终薄片进行成像。现在已经开发了几个平台，将荧光显微镜与 CryoFIB-SEM 相结合，用于荧光引导铣削。这些已成功靶向细胞器和大蛋白质复合物 ^5,23,24。然而，除了少数例外³⁰，光路在真空室的不同物理区域中产生与 FIB-SEM 不同的焦平面。因此，仍然需要在荧光和离子图像之间进行精确配准才能进行直接铣削，就像使用独立光学显微镜一样。

由于三个关键因素，该配准过程容易不准确：折射率不匹配（导致明显的焦距偏移）^31,32，铣削过程中的样品运动和定位误差。此外，配准通常由微米级荧光基准点辅助，这些基准点在离子和光学模式中均可见，并用作对准点对来计算离子和光学图像之间的变换。然而，这些磁珠可能会遮挡样品的荧光信号或与样品的荧光信号竞争，并且它们在光学和离子图像中的定位和对准速度缓慢且用户密集型。这些限制共同阻碍了对小型和罕见特征的常规定位。虽然很难定义目前可以在薄片中保存的结构的精确限制，但基于配准的方法通常被认为对于捕获轴向尺寸低于一微米的目标无效³³。

在这里，我们报告了在单个焦点位置集成了FIB，SEM和荧光显微镜的三重合成像系统的使用^34,35。与非重合积分相比，这种配置无需注册光学和离子图像，从而实现更简单、更准确的荧光引导铣削。在低背景和高信号的理想条件下，可以达到10 nm量级的制导精度³⁶。它还允许在整个铣削过程中获取多色低温荧光显微镜数据，包括从最终薄片中获取多色低温荧光显微镜数据，从而能够对亚衍射极限目标进行相关分析和定位³⁵。为了实现这一目标，我们采用定制的图像转换工具包，将这些荧光图像与低放大倍率透射电子显微镜精确对齐，以确定收集 CryoET 的位置，简化数据收集并确保在最终断层扫描重建中捕获目标。

为了指导铣削，我们利用系统实时监测荧光强度变化的能力。用户无需尝试对齐光学图像和离子图像来找到我们的目标，只需观察样品的荧光信号即可。随着铣削的进行，荧光以一种非常典型的方式表现：当显微镜物镜和荧光标记样品之间的碳支撑膜被去除时，荧光首先变亮，然后随着失焦自发荧光材料被磨掉而逐渐下降，最后，随着标记结构本身被部分去除，荧光急剧下降。该实时信号精确地确定了铣削过程中的位置以及何时停止铣削，确保感兴趣的目标保留在最终薄片³⁷ 中。在详细的协议中，我们还将讨论一种更先进的方法，该方法使用干涉效应引起的荧光亮度振荡来引导铣削到轴向范围为<300 nm的物体。

我们通过靶向微管组织中心（MTOC）³⁸来证明该平台的实用性。MTOC 是参与细胞分裂和分化的关键细胞器。在哺乳动物细胞中，标记微管蛋白的荧光显微镜显示 MTOC 在活细胞中为直径约 1 μm 的单个荧光点。这种方法已被用于成功地将MTOC以高保真度定位到玻璃化细胞的薄片上。MTOC 微管的详细组织及其与其他细胞器的相互作用在随后的断层扫描重建中得到揭示。该工作流程无需配准即可实现高精度相关荧光显微镜和 CryoFIB-SEM，从而减少了用户输入并扩大了对细胞结构的访问，这些结构以前小得令人望而却步，无法通过非重合方法进行稳健捕获。

定义和仪器说明
集成光学显微镜在Boltje等人³⁵中进行了详细描述，有关集成显微镜使用的更多详细信息可以在最近发布的协议³⁴中找到。该物镜从下方集成，并配备了x、y和z定位功能，以实现与FIB-SEM重合点的对准。它目前使用带有盖玻片校正器的 100 倍、0.85 NA 物镜运行。光学成像通过盖玻片进行，保护物镜免受溅射材料以及FIB和SEM的照射。宽场照明由一组跨越多个可见波长的 LED 提供。荧光检测是使用 sCMOS 检测器完成的。有三个定义的载物台位置：加载：加载样品的载物台位置;涂层：通过气体喷射系统进行涂层的载物台位置;3-光束：所有三个（FIB、SEM 和光学）显微镜可以共同对准的载物台位置。

方案

注意：此处使用的三重合系统是集成到市售双光束 FIB-SEM 系统中的定制低温荧光成像组件。作的原理和顺序通常可以适应未来的三重合实现。

1. 设置

1. 将系统冷却至低温。使用两个传感器监测温度：一个位于样品台上，另一个位于腔室内。将样品台保持在比腔室高约 20 °C 的温度（例如，级在 ~-170 °C，腔室在 ~-190 °C），以尽量减少样品上的结冰。冷却过程通常需要大约 1.5 小时。

2. 样品加载

1. 一旦系统温度接近低温（约 -167.5 °C），使用液氮手动冷却转运站。系统温度显示在光学显微镜软件的左上角。
2. 将一个夹紧的 Autogrid 装入专为低温光学显微镜系统设计的样品盒中。该盒由胶合盖玻片和垫片组成，自动网格位于它们之间。拧紧环形螺钉关闭盒式磁带，然后将其插入传输站³⁴ 上的插槽中。
3. 将传输站连接到系统，并使用内部腔室摄像头将样品盒引导到样品台上。

3. 用于样品涂层的气体注入系统 （GIS）

1. 打开光学显微镜控制软件，将样品台从 “上样” 位置移动到 “包衣” 位置。
2. 通过单击 Snowflake 图标，使用 FIB-SEM 控制软件插入 GIS 针。在 GIS 控制下，选择 插入 GIS 针选项。
3. 通过打开气流，允许 GIS 沉积 30 秒。
   注意：根据样品类型，这从 20 秒到 1 分钟不等。此步骤的目标是在随后的 FIB 铣削过程中充分保护样品。
4. 缩回 GIS 针，将样品台移回预定义的 加载 位置。

4. 三梁系统对准

注：本节改编自王³⁹。

1. 在光学显微镜软件中，将样品台从 加载 位置移动到预定义的 3 光束 位置。
2. 在FIB-SEM软件中，单击左上角窗口，将SEM设置为100倍的放大倍率。
3. 在光学显微镜软件的“对齐”选项卡中，单击“查看”功能以获取网格的 SEM 图集。此图集图像使用先前设置的参数。
4. 识别一个有破损碳膜的方形区域，然后双击它以将样品台移动到该位置。
5. 返回 FIB-SEM 控制软件并将 SEM 调整到 更高的放大倍率 ，以聚焦在视场中心选定的方形区域。
6. 根据需要重复步骤 4.4 和 4.5，直到 SEM 聚焦在可区分的图案上，例如破碎碳膜的锋利边缘。
7. 打开荧光显微镜并调整x，y，z坐标以匹配SEM视图。
8. 用 FIB 铣削一个小图案，例如，一个小矩形或圆形。
9. 确认该图案在 FIB 和荧光显微镜视图中都可见。如有必要，请按照步骤 4.3-4.7 调整对齐方式。
   注意：光学显微镜和离子显微镜的对准和配准已完成。

5. 目标定位和铣削

注：本节改编自王³⁹。

1. 转到光学显微镜软件中的 “定位” 选项卡，并通过激活适当的激发和过滤条件来设置荧光通道。将每个荧光团分配为单独的通道，并包括一个用于透射光（或明场）的附加通道。
2. 通过调整每个荧光通道的 LED 功率和曝光时间来识别感兴趣的目标。作为参考，在对SiR-微管蛋白进行成像时，使用1.2 s曝光和30 mW的恒定LED功率设置。
   注意：荧光团之间的参数可能有所不同。样品的光学强度应保持在 ~25-50 W/cm² 以下。比这更大的强度会导致样品^37,40的显着加热和脱硝。
3. 一旦对参数感到满意，即可获得通过轴向步进的预铣削荧光 z 堆栈。然后，将目标标记为 ROI。
4. 切换到 FIB-SEM 软件以在 ROI 处绘制薄片。
5. 进行粗铣削以去除 ROI 上方和下方约 3 μm 的大部分材料。同时，在铣削过程中保持荧光显微镜打开，以监测荧光信号的任何下降。
6. 使用清洁横截面模式将 ROI 减薄至 ~2 μm。
7. 从终端打开基于Python的干涉工具包，在减薄薄片（https://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite）³⁶的同时监测荧光信号。
8. 对于后续的铣削和抛光，请按照下面步骤 5.9 或 5.10 中描述的两种方法之一，根据所选目标的尺寸进行直接铣削。
   1. 目标轴向范围> 300 nm
      注意：在这里，我们将使用半破坏性方法进行直接铣削。
      1. 在 Python-GUI 中，在荧光显微照片中选择感兴趣的目标。软件将自动开始绘制每个新帧的亮度作为时间的函数。
      2. 通过 Python 工具包监测荧光强度。从下方以清洁横截面模式铣削样品，以去除任何残留的支撑膜材料（如果适用）。
         注意：当去除支撑膜时，应观察到荧光增强。
      3. 使用荧光强度的快速下降（表明荧光材料的损失）作为何时切换铣削方向的提示。例如，如果从下往上铣削，并且观察到荧光急剧下降，则停止铣削并切换到自上而下的铣削。
         注意：如果去除结构太快，请降低 FIB-SEM 软件中的铣削电流以减慢目标的去除速度。
   2. 目标轴向范围≤ 300 nm
      注意：在这里，我们将使用干涉效应来指导铣削³⁶。
      1. 在 Python-GUI 中，在荧光显微照片中选择感兴趣的目标。软件将自动开始绘制每个新帧的亮度作为时间的函数。
      2. 首先从上到下铣削测试目标。在通过荧光强度铣削目标之前监测条纹对比度。荧光目标与 2D 高斯连续拟合，拟合用于获得积分强度，然后绘制该强度。
      3. 铣削目标后，使用 Python-GUI 将强度轨迹中的振荡拟合到以下模型函数：
         
         其中 A 是振荡的幅度，λ 是激发的波长， k 是表示光源相干长度的阻尼项，相位因子 Φ，d 是到捕获对象的距离。 从测试目标中，可以在合理范围内预测所有项，因此距离 d 是唯一用于告诉用户荧光物体相对于其铣削位置的自由变量。有关更多详细信息，请参见 Sica 等人³⁶.
         注意：对于后续目标，工具包将使用相同的模型函数实时拟合强度迹线，并从上到下估计停止铣削的位置。所有配件都与铣削同时完成。目标是当目标位于顶面以下所需薄片厚度的一半的深度时停止铣削。
      4. 自上而下的铣削完成后，在清洁横截面模式下从下往上铣削，直到达到所需的厚度，最终确定薄片。
9. 拍摄铣削后荧光图像。

6. 相关光学显微镜和倾斜系列采集

1. 将样品转移到冷冻透射电镜后，以182倍收集网格的图集概览，以允许充分覆盖整个网格。
2. 在 6,500 倍到 11,000 倍的适当中间放大倍率下，收集 0° 倾斜处最终薄片的一系列蒙太奇图像。
3. 将铣削后多通道荧光图像和步骤 6.2 中的投影图像读取到自定义投影变换软件中，用于 ROI 配准 （https://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git）。
4. 总共选择 8-10 对参考点来精确计算射影图像变换。
   注意：这些点可能是明场光学显微镜和电子显微镜中都存在的明显特征（例如，薄片边缘，可见的冰污染或开放的网格孔）。

7.高倍率倾斜系列采集

1. 以此叠加荧光透射电镜图像为参考，供用户在相机框架尺寸限制范围内选择成像区域，进行高倍率倾斜系列采集。
2. 根据生物学问题选择倾斜系列的放大倍数和参数。
   注意：为了演示，我们以 3.5 Å 41,42,43 的像素大小以 2° 增量从 54° 收集数据。

结果

我们在冷冻前用微管蛋白标记物SiR-微管蛋白标记分化的巨噬细胞。按照协议，我们在荧光显微镜下将MTOC鉴定为单个~1μm直径的荧光点（图1A）。此外，我们观察到从MTOC辐射到细胞外围的原纤维样荧光结构，与微管网络一致（图1A）。不同试样厚度的逐步铣削快照如 图1B所示。值得注意的是，当薄片达到约 800 nm 的厚度时，单个 MTOC 点分解成两个相邻的斑点，每个斑点的直径约为 700 nm。随后的分析证实，每个斑点对应于一个单独的中心粒。

同时成像和铣削使我们能够实时监测荧光强度的变化。值得注意的是，我们观察到在去除块状非荧光材料和吸收支撑膜后荧光增加（图1B-D）。随着薄片从 2 μm 变薄到 800 nm，荧光强度急剧下降，反映出标记结构的逐渐去除。随着薄片在200 nm以下进一步变薄，这种下降仍在继续（图1B-D）。相关的荧光图像和电子显微镜图谱表明，我们的工作流程能够精确定位铣削（图2A）。重建的断层扫描和分割模型显示，中心粒由微管三联体组成，与之前的报告42,43,44,45一致（图2A，B）。在最终薄片中仅保留一个荧光斑点的情况下，我们在相应的断层扫描中观察到单个中心粒（图2B）。

图 1：用于精确定位微管组织中心的三重合 CryoFM-FIB-SEM 的工作流程。 （A）（ 左） 活细胞显微镜和 （右） MTOC的冷冻FM。比例尺 = 10 μm。（B） 用于靶向铣削的 CryoFM 和 CryoFIB 的逐步快照。特写 FM 视图表示为黄色虚线框。中心粒标记为黄色箭头。比例尺 = 5 μm。（C）冷冻FIB铣削过程中MTOC的荧光强度。（D）在CryoFIB铣削过程中不同阶段拍摄的MTOC上的荧光线轮廓。缩写：CryoFM-FIB-SEM = 具有聚焦离子束铣削和扫描电子显微镜的低温荧光显微镜;MTOC = 微管组织中心;ROI = 感兴趣区域。这个图改编自王³⁹。 请点击此处查看此图的大图。

图 2：通过三重合 CryoFM-FIB-SEM 工作流程揭示的 MTOC 的分子细节。 （A） MTOC 的相关 FM、EM 和分割模型。（a） 铣后调频图像。这与 图1B 最后一格中的图像相同，标记为180 nm，但旋转以匹配CryoET重建和分割。比例尺 = 5 μm;（b） （a） 黄色虚线区域的放大视图。（c）（2）所示的青色虚线区域的相关FM和TEM投影。比例尺 = 1 μm。（d） 感兴趣区域（黄色，中心粒;绿色，微管）断层扫描重建的分段模型。比例尺 = 100 nm。（B）呈现不同中心粒方向的两个不同薄片的代表性FM图像和断层扫描切片。FM：比例尺 = 5 μm。断层扫描切片：比例尺 = 200 nm。缩写：CryoFM-FIB-SEM = 扫描电子显微镜低温聚焦离子束铣削;MTOC = 微管组织中心;FM = 荧光显微镜;ET = 电子传输;TEM = 透射电子显微镜。这个图改编自王³⁹。 请点击此处查看此图的大图。

讨论

我们的结果强调了三重合成像平台的实用性，该平台可以同时进行荧光成像和铣削。利用这种反馈，我们展示了两种荧光引导的铣削策略——半破坏性和干涉法——避免了需要繁琐的基于配准的方法，这些方法在铣削过程中面临与折射率失配和运动相关的基本精度限制12,33,46.此外，由于精确引导依赖于荧光显微镜而不是SEM，因此只要强度保持在导致脱硝的阈值以下，光辐射就不会导致可检测到的损伤^37,47。这里展示的功能扩展了可访问的生物样品，包括稀有和小（轴向范围<300 nm）感兴趣的靶标，同时简化了工作流程。

该协议中的关键步骤是根据感兴趣目标的荧光亮度变化确定何时停止铣削。目前，这涉及快速手动干预，以便在所需时间停止铣削。该方法已被证明足以满足当前已探索的目标，但未来的修改可以进一步将 Python 工具包集成到 FIB 系统中，以直接停止铣削。如果需要更快的铣削速率，则可能需要进行此修改，因为这将减少人工干预的时间。或者，如果可以忍受较慢的研磨速度，这将在需要时为人工干预提供更多时间。

在生成感兴趣的含有薄片的生物结构后，我们定制的图像转换软件可以在冷冻透射电镜水平上实现相关性，使用薄片的图集概览来指导冷冻ET数据收集。总体而言，此处介绍的方案对于通过低温电子断层扫描在厚真核细胞样品中对荧光标记的、小的和稀有的生物靶标进行成像至关重要。与现有的非重合 Cryo-FIB 系统（例如带有 iFLM 的 Aquilos 2）相比，我们的工作流程在针对这些特征方面取得了更高的成功率。

这种高定位精度确实是以牺牲效率为代价的。由于铣削是手动的而不是自动的，因此薄片生成的吞吐量受到限制。在 8 小时的研磨过程中，我们通常会产生 6-8 个薄片，其中大约 5 个包含感兴趣的靶标。但是，我们相信这种工作流程将来可以自动化以提高吞吐量。自动化需要自定义脚本来持续监控 FIB 图像中的活动铣削区域并实时跟踪荧光强度以确保目标保留。关键挑战仍然存在，包括在所有自定义脚本和 CryoFIB-SEM 和荧光显微镜的控制软件之间建立有效的通信。

展望未来，还有很多工作要做，以结合前面讨论的其他先进荧光显微镜技术，包括荧光生物传感器、超分辨率成像和共聚焦显微镜。尽管如此，我们预计三重合几何形状将成为未来仪器的标准，并且铣削过程中的同步荧光成像将成为常规。如果是这样，该协议可以作为旨在捕获小型和罕见生物结构的分子尺度细节的研究人员的宝贵指南，尽管它们的大小和丰度很大，但对细胞生物学至关重要。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Aquilos 2 冷冻FIB	热飞世科学		https://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/dualbeam-fib-sem-microscopes/aquilos-cryo-fib.html?cid=msd_ls_xseg_xmkt_sdb-aquilos_285811_na_pso_gaw_pei90m &gad_source=1&gad_campaignid=12 764255901&gbraid=0AAAAADxi_GS s7OvZmg4cgCUm0PjSiq9X9&gclid= Cj0KCQjwh5vFBhCyARIsAHBx2w xlIfYHMvqY3sSWu6oEAdUynCSf9 KRg9Jhjp7l0Dot9qTl6GyQaEo8aAiy 2EALw_wcB
兼容Autogrid的冷冻网格盒	电子显微镜科学		https://www.emsdiasum.com/autogrid -compatible-cryo-grid-box？srsltid= AfmBOorQAd3esD8fLmnDDO2TvrNk cj4UINXFnPSMgrpEmkWd0H7ImUq7
自格圈环和C型卡	纳米软		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/100-pack-autogrid-rings-c-clips
CLEM 软件套件	斯坦福/SLAC的达尔伯格研究组		https://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git
蜻蜓2022.1	对象研究系统		https://dragonfly.comet.tech/
恩泽尔	德尔米克·B·V.		ENZEL系统是定制的仪器，目前尚未商业化
IMOD 4.12	科罗拉多大学		https://bio3d.colorado.edu/imod/
LD4液氮杜瓦	纳米软		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/ld4-liquid-dewar-4-liters
MATLAB 2023	数学作品		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
针盖操作工具	纳米软		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/pin-lid-manipulator-tool
Python 工具包	斯坦福/SLAC的达尔伯格研究组		https://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite
量形叶 R2/2，LF，200 网格，金电磁网格	电子显微镜科学		https://www.emsdiasum.com/quantifoil-r-22-lf-200-mesh-gold
串联EM	科罗拉多大学博尔德分校		https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
Spearlab标准船（转移杜瓦尔）	纳米软		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/spearlab-standard-vessel
镊子	电子显微镜科学		https://www.emsdiasum.com/style-3sa