本文介绍了利用两种全细胞生物传感器（Mer-Blue和Mer-RFP）检测离子态汞的实验方案。通过提供其操作和输出分析的详细步骤，本研究旨在促进这些技术在特定污染物监测中的更广泛应用和进一步发展。
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摘要
摘要
全细胞生物传感器（WCBs）是发现和表征调控元件以及推动生物工程发展的重要平台，同时在环境与食品安全监测方面也具有巨大应用前景。尽管已有大量研究致力于提升其灵敏度和便携性，但在操作流程和数据分析的标准化方面仍相对滞后。本文提供了一套完整的操作指南，用于使用两种近期开发的WCBs——Mer-Blue和Mer-RFP，这两种传感器已被证实能够检测低于世界卫生组织饮用水限值的离子汞浓度。文中详述的实验方案包括微生物培养制备、传感器校准、数据采集与分析。对于荧光检测型Mer-RFP生物传感器，采用了一种新型生物合成分配定理，以确定可靠且准确的剂量-响应测量时间窗口；对于比色型Mer-Blue生物传感器，则通过低成本相机装置实现在缺乏昂贵分光光度计和荧光计的条件下进行严谨测量，从而支持污染监测的去中心化。本文还描述了对淡水样品的检测流程，并讨论了这些生物传感器在不同样品类型应用中的局限性。通过共享这些操作与分析技术，我们鼓励更广泛的研究团队采纳并改进这些生物装置，以开发高效的环境监测解决方案。最终，本研究旨在促进生物传感器技术在环境科学领域的广泛应用，助力对各类生态系统中痕量元素污染进行更有效、更高效的监测。
引言
随着人们对环境污染以及水和食品供应安全的担忧日益增加，生物传感器已成为传统分析化学方法的一种具有吸引力且经济实惠的替代方案。重金属是毒性很高的污染物，由于人类活动的影响，其在环境中的含量正逐渐升高1,2,3,4。然而，传统的检测方法5往往成本高昂且难以普及。
对汞敏感的全细胞生物传感器（WCBs）利用了MerR转录因子卓越的特异性和灵敏度6,7,8。在天然功能中，MerR调控效应蛋白的表达，这些蛋白的解毒活性赋予细胞对汞的抗性9。MerR能够以依赖汞的方式调控基因表达，这一特性已被重新用于汞检测系统中报告蛋白的调控10,11,12,13,14,15,16。尽管相关研究前景良好，但这些全细胞生物传感器尚未被应用于实际环境监测中。生物稳定性差、需要特殊操作条件，以及缺乏标准化的操作流程和认证的参考物质等因素，限制了其实际应用17,18,19,20。
已开发出一种利用MerR与两种不同报告蛋白偶联的WCB系统用于检测离子态汞。Mer-Blue表达一种显色蛋白，作为比色生物传感器，可实现肉眼或基于相机的检测。Mer-RFP是一种荧光生物传感器，可对信号积累进行连续监测。通过在细胞生长阶段精确控制样品暴露的时间，两个系统均实现了良好的可重复性15。
本文介绍了 Mer-Blue 和 Mer-RFP 两种系统的详细操作方案，并对其信号输出进行了全面分析。对于 Mer-RFP，分析基于近期提出的一种蛋白质生物合成资源分配定理21。对于 Mer-Blue，可使用 ImageJ 等图像处理软件对显色反应进行数字化分析。为确保图像采集参数的一致性，本文还提供了一种低成本、可自行组装的相机装置 PelletCam。在两种情况下，均提供了自动化软件以辅助操作。通过共享易于获取且标准化的实验方法与数据分析技术，旨在推动全细胞生物传感器（WCBs）的广泛应用，从而开发出可靠且经济高效的基于生物传感器的监测解决方案。
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方案
本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
1. 准备离子汞溶液
- 使用适当的防护手套和口罩称取少量 HgBr2 粉末（通常在 0.1 至 0.2 g 之间），以防止吸入和皮肤接触。
- 通过将称量好的固体粉末溶解于 ddH2O 中，并使用以下公式计算获得 4 mM 溶液所需的水量：
注意：预期体积接近 100 mL；可使用简化公式：
- 若使用 HgCl2，则应用以下公式：
- 若使用 HgCl2，则应用以下公式：
- 将储备液储存于密封容器中，并置于冷藏环境（4 °C）以防止蒸发。
- 在每次滴定分析前制备系列稀释液，起始浓度为 1 mL 的 2 mM Hg2+，逐步稀释至 40 nM，如表 1所示。
注意：离子汞的浓度在储存过程中可能发生改变，可能由于汞离子的自发还原以及单质汞（Hg°）的挥发所致。尽管冷藏和使用高质量密封容器可减轻这些影响，但仍应避免使用储存超过 6 周的溶液——特别是 Hg2+ 浓度等于或低于 250 nM 的溶液。
2. 准备M9培养基
- 使用超纯水在不同的烧瓶中分别溶解试剂粉末，配制以下储备液：M9 5×、1 M MgSO4、1 M CaCl2、20% (w/v) 葡萄糖和 20% (w/v) 酪蛋白氨基酸。
- 在 500 mL 或 1 L 的玻璃瓶中，加入 50 mL M9 5× 溶液和 2.5 mL 20% (w/v) 酪蛋白氨基酸溶液，再加入超纯水至总体积为 246.475 mL。
- 将上述混合液及储备液在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。
- 让所有溶液完全冷却，以避免 CaCl2 析出沉淀。
- 向冷却后的混合液中加入：25 µL 1 M CaCl2、500 µL 1 M MgSO4 和 3 mL 20% (w/v) 葡萄糖。
注意：由此得到一种营养成分丰富的 M9 培养基，其最终浓度如下：0.24% (w/v) 葡萄糖、0.2% (w/v) 酪蛋白氨基酸、2 mM MgSO4、1 mM CaCl2、3 g/L KH2PO4、0.5 g/L NaCl、6.78 g/L Na2HPO4、1 g/L NH4Cl。
3. 激活 Mer-Blue / Mer-RFP 生物传感器
- 使用含有 pUC-Mer-RFP 或 pUC-Mer-Blue 质粒的 Escherichia coli DH5α 细胞（参见材料表）。
- 制备含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB-琼脂培养皿。
- 采用划线法将冻存甘油菌种中的细胞接种至 LB-琼脂平板上。
- 在 37 °C 条件下孵育过夜。
- 次日，从 LB-琼脂平板上挑取单菌落，接种于 10 mL M9 培养基中进行培养（图 1A）。
- 在 37 °C、220 rpm 持续振荡条件下培养过夜（约 16 小时）（图 1B）。
使用 Mer-RFP 进行滴定实验
- 测定过夜培养的细菌在 600 nm 处的光密度（OD600）。
- 使用以下公式计算所需过夜培养物体积，以在 10 mL 新鲜 M9 培养基中达到 OD600 为 0.05 的终浓度：
其中 C1 为过夜培养物的 OD600，V1 为需取用的体积。 - 将 V1 mL 的预接种培养物在 3500 × g 条件下离心 5 分钟。弃去旧的 M9 培养基，并将菌体沉淀重悬于 10 mL 新鲜 M9 培养基中（图 1C）。
- 将重悬后的培养物各取 195 µL 加入 96 孔微孔板的每孔中。确保每个微培养体系设置三个重复，以获得准确测量结果。
- 按步骤 1 所述，向各孔加入 5 µL 浓度为 40 nM 至 40 µM 的离子汞溶液，使终浓度范围为 1 nM 至 1 µM（图 1D）。
- 将微孔板放入具有温度控制功能的多功能微孔板读板仪中，并设置以下参数（图 1E）— 温度：37 °C，振荡：持续振荡（60 rpm），时间间隔：每 15 分钟读数一次，持续 16 小时，光密度检测：在 600 nm 处读数，荧光检测：激发波长 570 nm，发射波长 615 nm。
- 完成 16 小时培养后，从微孔板读板仪中收集数据（图 1F）。
5. Mer-RFP 结果的数据分析
- 使用首选的电子表格软件或数据管理工具对原始OD值进行可视化处理600 所有单个培养物随时间变化的数值（图1G）。验证在每种汞浓度条件下，各重复组的对数生长期结束和稳定期开始的时间是否大致相同。剔除与平均时间相差超过1小时的培养物。
- 计算平均 OD600 针对每种汞浓度条件下所有重复样本的每个时间点。对于每个三重复的培养条件，取单个平均的OD600 生长曲线及三种荧光强度输出将在不同时间点获得。
- 绘制平均 OD 值600 与. 无汞培养的时间。通过肉眼观察确定并选择生长速率为正的时间区间（参见 图2）。从所有培养物的数据中排除剩余的数据点。
- 对于每次培养，通过计算每个时间点的OD变化值来确定比生长速率600 与前一时间点相比的变化值除以OD600 该时间点的值，使用以下公式：
- 类似地，通过计算每个培养物在前一时间点之后的荧光强度变化值，并将该变化值除以OD，来确定其特异性荧光生成速率600 使用以下公式计算该时间点的值：
- 对于每种培养物，绘制比生长速率与荧光蛋白产生速率的关系图（参见 图3）。在较晚的时间点中确定一个线性范围。排除早期时间点，直至获得具有最高 R 的线性回归2，基于至少12个时间点（约3小时）完成。
注意：该线性回归的斜率代表表达分数，即分配给报告蛋白的总蛋白质合成比例21. - 对于所有培养物，从大致相同的时间区间内提取线性趋势，并记录每种条件下的斜率值。
注意：实现尽可能高的 R2 在使用相同时间间隔的情况下，若要在所有文化中获得一致的数值，可能需要进行多次尝试。对于自动化分析，可使用以下 Jupyter Notebook（Google Colab 框架），网址为 https://github.com/frank-britto/Mer_RFP。该 Notebook 可作为提取线性趋势并进一步进行剂量-反应分析的优化模板。 - 取每个汞浓度下重复实验的平均斜率。
- 将平均斜率值对汞浓度作图（参见 图4A）。将数据拟合到Hill函数：
其中：fRFP 是红色荧光蛋白的表达比例，H 表示该电路可能达到的最大表达量，[Hg2+] 是离子汞浓度，kHg 与离子汞的亲和力相关，n 是表示对 Hg 响应协同性的 Hill 系数2+.
使用 Mer-Blue 生物传感器进行滴定实验
- 将按步骤3所述方法获得的过夜浓培养物在3,500 × g 条件下离心10分钟。
- 弃去用过的M9培养基，并将细菌沉淀用新鲜M9培养基重悬至OD600为1.0。确保获得至少5 mL该密度的培养物（图1C）。
注意：若无分光光度计，可通过将细菌沉淀重悬于体积为原浓培养物体积两倍的新鲜M9培养基中，以近似达到初始条件。 - 向灭菌的玻璃培养管中加入9.5 mL M9培养基和10 µL浓度为100 mg/mL的氨苄青霉素储备液（图1H）。
- 用步骤6.2制备的生物传感器培养物（OD600 = 1.0）接种500 µL至上述添加物的M9培养基中。
- 加入10 µL已配制的离子汞溶液（见步骤1），使最终浓度分别为0 nM、1 nM、2 nM、5 nM、10 nM、25 nM、50 nM、100 nM、125 nM和250 nM。
- 将培养物在37 °C、220 rpm剧烈振荡条件下培养16小时（图1I）。
7. Mer-Blue 结果的数据采集与分析
- 将每种培养物约 1.3 mL 转移至 1.5 mL 微管中（图 1J）。
- 以最大转速离心微管 3 分钟，以获得紧密的沉淀。弃去上清液。
- （可选）为获得更大的沉淀，可重复离心和去除上清液操作，最多六次。
- 对每个微管底部进行拍照，聚焦于沉淀部分（图 1K）。使用微管架和三脚架或 PelletCam（见步骤 8）以确保所有图像的方位、照明和颜色设置一致且可重复（见 图 5）。
- 测定每个沉淀图像在红、绿、蓝（RGB）通道中的颜色强度值。
- 若使用 ImageJ：加载图像并导航至 图像 > 类型 > RGB 堆栈，以创建三切片堆栈（红、绿、蓝通道）。使用选择工具在沉淀区域周围绘制感兴趣区域（ROI）。导航至 分析 > 测量，以获取所选区域在各通道中的平均强度值。
- 若使用 PelletCam：打开包含沉淀图像代表性九像素区域平均颜色强度值的 .csv 文件。
- 通过计算相对于白色参考沉淀图像（未转化的 E. coli）在 RGB 空间中的欧几里得距离，得出每个样品的生物传感器响应值，如先前所述22，使用以下公式：
其中，Rsample、Gsample 和 Bsample 表示生物传感器样品沉淀图像选定区域在各 RGB 通道中的平均颜色强度，而 Rref、Gref 和 Bref 表示未转化 E. coli 参考沉淀的相应值。 - 将计算得到的欧几里得距离对相应的离子汞浓度作图（见 图 6）。使用以下公式对数据拟合 Hill 函数（见 图 4B）：
其中，E 表示欧几里得距离，H 表示该电路可能达到的最大显色程度，[Hg2+] 表示离子汞浓度，kHg 与对离子汞的亲和力相关，n 为 Hill 系数，表示对 Hg2+ 响应的协同性。
8. 构建 PelletCam
- 从网站（https://github.com/EhbAIGit/PelletCam-OPENBIOLAB-AI）下载文件，以构建用于细菌菌体颜色测量的封闭式微控制器系统。
注意：具备激光切割、3D打印、ESP32和Arduino的基础知识将有所帮助。ESP32-CAM的入门指南可参见（https://lastminuteengineers.com/getting-started-with-esp32-cam/?utm_content=cmp-true）。建议购买ESP32-CAM时同时配备MB适配器，以便更方便地进行编程。对于不熟悉ESP32的用户，建议首先参考教程https://lastminuteengineers.com/esp32-arduino-ide-tutorial/。 - 使用 LasercutterBox.ai 用于使用激光切割机切割和雕刻3 mm多层板的文件。
- 从文件构建部件 ESP32SET.stl 使用3D打印机打印文件。这 .stl 该文件可被几乎所有3D打印软件直接导入；例如，Bambu Studio（https://bambulab.com/en/download/studio）。
- 安装ESP32（ESP32-CAM-MB 2640 WiFi蓝牙相机模块），通过将 .cpp 和 . 和 .ino 将文件放入单个文件夹中。然后，打开 .ino 使用 Arduino IDE 软件打开文件并点击 >上传上传完成后，ESP32 将自动启动。
- 此时，用户应能够连接到名为 >沉淀物 和密码 >PELLETCAM，如所述的 .ino ESP32 的文件。PelletCam 的 IP 地址将显示在 Arduino IDE 的串行监视器中。打开网页浏览器，访问地址：http://192.168.4.1。
注意：这将允许查看图像或拍摄新图像（>拍摄照片），旋转图像（>旋转），或设置LED灯带的亮度（>LED). - 将 ESP32 Arduino 与 LED 灯带（NeoPixel Stick - 8 x 5050 RGB LED 带集成驱动器）及 5V USB 电缆按照文件中的示意图连接 安装手册.pptx.
- 使用热熔胶枪将 ESP32 和 LED 灯带粘接到 3D 打印支架上。
- 将带有彩色底部的微量离心管（或细菌沉淀）放入PelletCam的3D打印前端。将ESP32-LED支架置于约5 cm远处，拍摄图像 通过 网页。如果获得清晰且照明良好的图像，则将ESP32-LED支架粘在木盒底部；否则，调整前端与ESP32-LED支架之间的距离，并重复该步骤，直至获得满意距离为止。
- 使用美纹纸胶带和木工胶将盒子的所有部件粘合组装在一起。
- 通过 USB 线缆将 PelletCam 连接到可提供至少 1 A 电流的 USB 电源。
注意：请确保已安装 Python 3.9 或更高版本。 - 打开命令提示符或终端窗口。导航至包含该目录的 pellet.py 文件。使用以下命令执行脚本 >python pellet.py.
- 如果 pellet.py 脚本无法运行，可能是由于缺少 Python 库。请使用以下命令安装所需的库 >pip install pillow tkinter pathlib statistics. 若要搭建您自己的系统以获得额外指导，请参阅该文档 PelletCam 示例.docx.
9. 环境水样的测定
- 从河流或池塘等环境来源采集样品，并将其储存在密闭容器中，置于低温条件下以最大限度减少蒸发。详情请参见讨论部分。
- 以 3,500 × g 离心 10 分钟，使沙粒和有机碎屑沉淀，从而分离出水相组分。
- 使用 0.22 µm 注射式滤器对澄清样品进行灭菌。
注意：避免采用热灭菌，因为汞具有挥发性，可能在加热过程中蒸发。 - （可选）通过加入 5% HCl 制备一份独立的酸化等分试样，用于标准分析化学技术的独立测定。生物传感器检测仅使用非酸化样品。
- 将 5 mL 经无菌滤膜过滤的环境样品与 4.5 mL 的 2× M9 培养基混合，使样品稀释至原浓度的 1:2。
- 向稀释后的样品-培养基混合液中接种 0.5 mL 过夜培养物（按步骤 5.4 所述方法制备）。该接种量相当于将培养物稀释 20 倍，使起始 OD600 达到 0.05，以启动检测。
- 若使用 Mer-RFP：将 200 µL 样品-培养基混合液转移至微孔板孔中，并按照步骤 3.6 所述方法使用微孔板读板仪开始检测。
- 若使用 Mer-Blue：将 10 mL 样品-培养基混合液在 37 °C 下孵育 16 小时，同时以 220 rpm 剧烈振荡，具体操作如步骤 5.6 所述。
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结果
在无汞条件下，这两种生物传感器均未表现出其相应报告蛋白的可检测基础表达水平。在HgBr2浓度为25 nM及以上时，Mer-Blue菌株通常在接种后6–8小时开始出现肉眼可见的颜色变化。若实验操作正确，使用Mer-RFP或Mer-Blue进行的滴定实验所获得的响应曲线可拟合为Hill函数，其Hill系数接近1，表明为非协同结合行为23。
Mer-RFP 对 HgBr2 的可靠检测范围为 1 nM 至 1 µM。在 2 µM 时，细胞生长和报告信号均显著减弱。相比之下，Mer-Blue 的工作范围较窄，仅在 2 nM 至 125 nM 的 HgBr2 浓度范围内可检测到响应。在较高浓度（≥250 nM）下，可见颜色明显减弱，这可能是由于 10 mL 过夜培养物的生长受到抑制所致。
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讨论
此处使用的生物传感器回路完全相同，仅报告蛋白不同。两者均完全编码于高拷贝质粒上，可在多种菌株的Escherichia coli细胞中表达。尽管在E. coli B菌株细胞中具有功能，但在K-12菌株（特别是DH5α和化学感受态的E. coli细胞）中，Mer-Blue产生的显色信号更强15。
我们观察到，在离子汞暴露时，要获得可靠的输出结果，需要达到较高的细胞密度。这可以通过将培养物的初始 OD600 设为 0.05 或 0.1，或使用过夜培养物按 1/20 比例稀释来实现，如本文所述。另一种方法是将培养物以极低密度起始，使其生长 1–2 小时，直至 OD600 达到 0.05–0.1。需注意的是，若在此情况下过早加入汞，可能导致无法检测到信号；反之，若加入过晚，则可能限制报告蛋白的积累，从而影响生物传感器的输出。重要的是，信号的积累不仅在诱导初期发生，而且持续贯穿于稳定期，表明延长孵育时间可能导致颜色加深。然而，过度延长孵育时间可能因蛋...
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致谢
本研究得益于国家科研与高级研究计划（PROCIENCIA）通过项目 EF-041-2024-01 "应用研究项目"提供的支持，资助合同编号为 PE501086520-2024-PROCIENCIA。汞生物传感器的开发由 VLIR-UOS 通过南半球倡议资助项目（编号 PE2020SIN292B122）提供资金支持。M.D. 感谢 VLIRUOS、比利时发展合作署（DGD）以及佛兰德应用科学与艺术大学理事会通过 Global Minds 项目（编号 BE2017GMHVLHC106）提供的 XREI 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3 mm厚的多层木材 | 多家供应商 | ||
| 5 V USB数据线 | 多家供应商 | ||
| 96孔透明平底聚苯乙烯TC处理微孔板 | Corning | 3599 | |
| 琼脂粉 | HiMedia | GRM026 | |
| 氨苄青霉素 | Gold Biotechnology, Inc. | A-301-100 | |
| CaCl2 | Millipore | 208290 | |
| 酪蛋白氨基酸 | Calbiochem | 2040OP | |
| D-(+)-葡萄糖 | Central Drug House (P) Ltd. | 506250 | |
| ESP32-CAM-MB 2640 蓝牙WiFi摄像头模块 USB转串口开发板 自动下载（Type C接口） | 多家供应商 | ||
| 玻璃培养管 | Corning | 9825 | |
| HgBr2，溴化汞(II) | Merck | 200085 | |
| HgCl2，氯化汞(II) | Merck | 21465 | |
| LB培养基（Miller配方） | Sigma-Aldrich | L3522 | |
| M9最小盐培养基 | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| MgSO4 | HiMedia | GRM684 | |
| NeoPixel棒状灯条 - 集成驱动的8 x 5050 RGB LED | Adafruit | 1426 | |
| 质粒：pUC-Mer-Blue | 本研究组 | - | 完整序列见 https://www.mdpi.com/article/10.3390/bios14050246/s1 |
| 质粒：pUC-Mer-RFP | 本研究组 | - | 完整序列见 https://www.mdpi.com/article/10.3390/bios14050246/s1 |
| 亲水性注射器滤器，孔径0.22微米 | Millipore | SLGV004SL | 用于环境样品的灭菌。 |
参考文献
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