本方案描述了 体内 完整三叉神经节（TG）神经元的GCaMP钙成像。该描述包括TG暴露手术， 体内 共聚焦显微镜成像三叉神经节神经元、在三叉神经节神经元显微成像期间施加体感刺激，以及分析 体内 GCaMP 钙成像数据
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摘要
摘要
钙成像是监测向细胞质内流入 Ca2+ 或从细胞内 Ca2+ 储存库中释放 Ca2+ 的信号机制的重要工具。利用 Pirt-GCaMP3 小鼠（其 Ca2+ 传感器 GCaMP3 插入在 Pirt 启动子区域下游，并在几乎所有（>95%）初级感觉神经元中表达），可通过三叉神经节（TG）初级感觉神经元的 Ca2+ 成像，同时监测超过 >3,000 个神经元的活动。这使得研究人员能够在活体（in vivo）条件下研究神经网络对有害刺激以及躯体感觉和激素反应的响应，而这些响应若采用其他方法则极难检测。
具体而言，能够分别监测支配面部及其他头部区域的三叉神经节（TG）区域，使得研究者可以在神经元信号进入后续处理阶段之前，监测由面部区域刺激激活的初级感觉神经元。同时还可以观察产生Ca2+瞬变的神经元数量以及Ca2+瞬变的幅度，这些指标反映了神经元对不同感觉模态的敏感性。此外，研究者还可以测量神经元的直径，这是判断被激活纤维类型（无害性机械感受纤维与有害性伤害感受纤维，Aβ、Aδ和C纤维）的重要依据。因此，利用Pirt-GCaMP3进行TG钙成像，将成为解析特定感觉模态和神经元细胞类型的有力工具，可用于研究三叉神经源性疼痛（口面部及颅面部疼痛、牙痛、头痛、偏头痛、颞下颌关节疼痛、三叉神经痛）、瘙痒、触觉以及其他任何躯体感觉，以及相关的激素反应。
引言
初级感觉神经元直接支配包括皮肤在内的各种组织，并将感觉信号传递至中枢神经系统（脊髓或脑干）。三叉神经节（TG）神经元支配头部区域，对感觉刺激产生反应，包括来自牙齿、眶周区域、口面部和颅面区域、颞下颌关节1,2以及脑膜3,4,5的疼痛刺激。TG神经元在大小、髓鞘化程度以及基因表达谱方面存在差异6,7,8,9。较小的神经元具有伤害感受功能，而较大的神经元通常对非疼痛性机械刺激作出反应10,11。三叉神经节神经元的功能障碍可导致这些神经元本身以及中枢神经系统（CNS）感觉神经元的敏化11,12。
在非病理条件下的正常生理环境中，放电的神经元 体内 对于疼痛是必需的，但在过去二十年之前，尚缺乏用于研究完整感觉神经节的工具 体内 仅限于同时监测数量较少的神经元13由于细胞质内钙离子浓度通常较低，动作电位期间存在钙离子内流，且钙离子被用作细胞质内的信号分子，因此钙动力学可作为监测动作电位或细胞活动的有力替代指标 体内 使用钙离子敏感的荧光指示剂。该方法的原理在于，荧光显微镜可同时在小鼠外周感觉神经节的数百至数千个神经元中同步监测这些指示剂13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 和大鼠25,26相较于只能监测数量有限神经元的方法，这是一项显著的优势 体内.
该方法的目的是直接观察细胞质中的Ca²⁺动态变化2+ 动力学 体内 在头痛疼痛模型中，三叉神经节（TG）对机械、温度、化学和激素刺激的反应19,23,24该方法可作为口面部区域疼痛或其他躯体感觉测试的补充。 体内 三叉神经 Ca2+ 成像已被用于表征热觉和感觉编码19,22，研究机械感受器的类型27发现一类新的机械敏感性神经元28监测三叉神经对脑膜正常机械应力的反应29研究激素对疼痛敏感性的影响24，表征口面部疼痛模型30以及研究酒精戒断所致疼痛的影响因素23.
Pirt-GCaMP3 小鼠可用于监测神经元活动 体内 因为它们含有 Ca2+ 将传感器 GCaMP3 插入到启动子区域 Pirt 基因，在所有（中均高度表达>95% 的初级感觉神经元12,18本文展示了一种用于执行的实验技术 体内 使用共聚焦激光扫描显微镜对Pirt-GCaMP3小鼠右侧三叉神经节（TG）进行手术暴露，并采集和分析钙指示剂显微成像数据。
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方案
本文所述所有操作均须在机构动物照护与使用委员会批准的协议下进行。该手术为非存活手术。操作步骤的第1和第2部分必须在开始后立即执行。第3部分可在之后的日期进行。
1. 小鼠右侧三叉神经节成像的固定与手术
注意：Pirt-GCaMP3 C57BL/6J 小鼠18需达到成年体型（通常为8周龄或以上），性别不限。可进行双侧三叉神经节成像。此处列出的时间为经验丰富的技术人员的估计值。如果出血量超过正常水平，每个步骤所需时间可能延长数分钟。
- 配制含有 40 mg/mL 氯胺酮和 6 mg/mL 噻拉嗪的无菌生理盐水溶液。根据手术及成像后安乐死所需，准备足够体积（每克小鼠体重至少 9 µL）。
注意：体内成像过程中已使用多种麻醉剂。警告：氯胺酮若注射、吞咽或接触眼睛可能有害，请小心操作。 - 将所有手术器械在玻璃珠灭菌器中灭菌，并用 70% 乙醇清洗。
注意：也可预先对器械进行高压蒸汽灭菌。 - 在手术前 15–25 分钟，按每克体重 2.25 µL 的剂量腹腔注射氯胺酮/噻拉嗪混合物（相当于氯胺酮 90 mg/kg 和噻拉嗪 13.5 mg/kg）至 Pirt-GCaMP3 小鼠体内。氯胺酮剂量不得超过 120 mg/kg。
- 麻醉注射后 15–25 分钟（步骤 1.3），用镊子夹捏小鼠后肢足垫，以确认小鼠已达到外科麻醉深度。
注意：夹捏力度应足以使清醒小鼠发出叫声，但不应造成损伤。此步骤停留时间不宜过长，以免小鼠体温下降。如条件允许，保持笼温温暖有助于维持体温。 - 将小鼠置于加热垫上，确保体温维持在 37 °C，并将小鼠头部放入立体定位面罩（图 1A、B），头部向左倾斜约 15°（图 1B）。
注意：此处描述的立体定位面罩既能固定头部，又可提供异氟烷给药通道。若实验不使用异氟烷或未使用立体定位面罩，则应采用其他方法固定头部以防止移动。 - 在小鼠双眼涂抹眼用软膏，防止角膜干燥和刺激，因为刺激可诱发三叉神经活动。
- 剃除小鼠头部右侧毛发。
注意：此步骤耗时约 90 秒。操作者可在剃毛时短暂将动物移离加热垫。 - 在右耳与右眼之间做一个 9 mm × 5 mm 的矩形切口（图 2A）。使用止血棉签或实验室擦拭纸控制出血。
注意：此步骤耗时约 2 分钟。操作者可使用止血钳或牵开器保持切口开放。本操作为非存活性手术，因此无需额外消毒。然而，操作者也可用聚维酮碘擦拭手术区域。此处给出的是允许的最大切口尺寸。若操作者技术足够熟练，建议采用较小切口以减少组织损伤，因为三叉神经（TG）支配该区域组织，可能受到损伤。 - 剪开眼睛正下方颅骨表面的组织（骨膜）（图 2B）。
- 使用牙科钻和锥形裂钻头 TNT bur 31p，在颅骨背侧以切口为中心钻出一个约 9 mm × 5 mm 的孔洞（图 2C）。钻头接触颅骨表面时应尽量轻柔。
注意：此步骤耗时约 2 分钟。若操作者技术足够熟练，建议采用较小孔洞以减少损伤。 - 倾斜头部，直至三叉神经节（TG）清晰可见（图 2C）。若 TG 上有出血，应吸除血液，或用止血棉签或实验室擦拭纸通过毛细作用清除。确保在不移除任何皮层组织的情况下清晰暴露 TG（图 2C）。
注意：我们常规对 TG 进行 3–6 小时或更长时间的成像，未观察到神经元出现应激迹象，但研究者也可选择放置盖玻片或其他覆盖物以防止 TG 干燥。 - 将动物连同加热垫移至显微镜载物台上，将小鼠鼻部插入立体定位鼻锥中。连接氧气/异氟烷管路，使小鼠持续接受异氟烷麻醉（图 3A）。
注意：此步骤耗时约 3 分钟。持续使用异氟烷需配备氧气瓶、气体输送管和麻醉蒸发器。也可通过定期注射麻醉剂来维持整个实验过程中的麻醉状态。 - 调整立体定位支架位置，使显微镜物镜位于颅骨开窗区域正上方 9 mm 处（图 3B）。
注意：精确距离取决于所用物镜、显微镜型号及小鼠个体差异。 - 插入直肠温度计。将电源线连接至直肠温度计和加热垫。将麻醉面罩连接至含 1% 异氟烷的氧气管路。
2. TG 成像
注意：使用绿色（FITC）设置，激发波长495 nm，发射波长519 nm，检测波长范围500-580 nm，成像设备为GaAsP-Pmt1，检测器为GaAsP-PMT，或采用显微镜推荐的设置。软件设置的汇总见表1。
- 使用5倍/0.25 M27物镜、显微镜制造商提供的软件以及垂直共聚焦激光扫描显微镜，定位三叉神经节（TG）表面。
注意：物镜的选择取决于显微镜型号及研究者偏好。 - 调整物镜和鼻锥，使TG表面尽可能平坦，并在焦平面上呈现尽可能大的表面积。
注意：较平坦的TG可提供更清晰的图像，有助于软件生成更清晰的动态影像，成像更多神经元，并相较于倾斜更明显的TG，简化分析过程并提高分析准确性。 - 通过麻醉面罩向氧气流中输送1-1.5%异氟烷，维持小鼠的麻醉状态。
注意：在整个实验过程中必须密切监测动物状态，每20-30分钟轻捏后肢足垫一次，以确认小鼠持续处于麻醉状态。维持麻醉所需的异氟烷浓度因个体小鼠而异。若测试刺激时动物出现移动，需增加异氟烷浓度；若呼吸变浅，则需降低异氟烷浓度。警告：吸入异氟烷有害，可能导致头晕或嗜睡。避免吸入，并确保工作区域通风良好。 - 加载显微镜高速扫描程序：体素尺寸 4.160 µm x 4.160 µm x 14 µm，512 x 512 像素，10层光学切片Z堆栈，1.02艾里单位（AU）/33 µm，488 nm激光功率15%/75 mW，像素时间1.52 µs，行扫描时间0.91 ms，帧时间465 ms，LSM扫描速度8，双向扫描，GaAsP-PMT探测器增益550 V，数字增益1。
注意：最佳设置可能因显微镜和动物个体差异而有所不同。 - 以6-8个周期的短脉冲方式扫描TG。对扫描数据创建正交投影（一次扫描生成一帧图像），生成动态影像，并检查图像清晰度及帧间一致性。如有必要，调整立体定位架位置和光学切片厚度，并重复此步骤，直至生成清晰且一致的动态影像。
注意：若小鼠头部发生移动，或研究者重新调整小鼠位置或焦平面，必须重复此步骤。 - 加载显微镜高分辨率扫描程序：体素尺寸 0.520 µm x 0.520 µm x 14 µm，4096 x 4096 像素，6层光学切片Z堆栈，1.02艾里单位（AU）/33 µm，488 nm激光功率20%/100 mW，像素时间0.52 µs，行扫描时间4.95 ms，帧时间20.26 s，LSM扫描速度6，双向扫描，GaAsP-PMT探测器增益550 V，数字增益1。
注意：最佳设置取决于显微镜和动物个体。若细胞标记为td-Tomato，需将显微镜设置为同时扫描红色通道（592 nm激发/614 nm发射，检测波长600-700 nm）和绿色通道。 - 获取TG的高分辨率图像。
注意：该图像可用于计数神经元、测量弱信号神经元的直径，或提供详细图像以判断是同一神经元对两种不同刺激产生反应，还是两个不同神经元分别响应。 - 加载显微镜高速扫描程序（见步骤2.4）。
- 记录80个周期的自发活动（约10分钟）。生成正交投影动态影像，并检查图像是否足够清晰和一致以进行分析。
注意：此数据量足以用于分析自发活动。可根据自发活动在特定实验中的重要性适当减少或增加周期数。 - 进行刺激时，将显微镜设置为扫描15-20个周期。
注意：施加刺激时需谨慎，避免移动小鼠头部。刺激期间即使TG移动数微米，也可能干扰成像。该扫描设置可用于建立基线、施加刺激，并在刺激结束后观察神经元反应。 - 等待第1-5个周期完成以建立基线，在第6-10个周期期间施加刺激。每次刺激后至少等待5分钟，以避免神经元脱敏。
注意：每种刺激均需独立进行一次15-20个周期的扫描。应先施加机械刺激，随后依次为冷刺激、热刺激和化学刺激。低强度刺激（如低机械力、接近室温的温度）应先于高强度刺激（高机械力、远离室温的温度）施加。施加刺激时需避免移动TG。若扫描声音清晰可辨，可在第5个周期结束后立即施加刺激。但任何能保证刺激时机一致的方法均可使用。参见关于刺激顺序的讨论。 - 对由TG的V2部分支配区域进行von Frey刺激时，手持纤维丝，在第5个周期结束之后立即开始，至第10个周期结束之后立即停止，反复刺激同侧眼下方、口上方区域。
- 对由TG的V3部分支配区域进行von Frey刺激时，手持纤维丝，在第5个周期结束之后立即开始，至第10个周期结束之后立即停止，反复刺激同侧耳下方区域。
- 对于冷热刺激，先将水杯中的水冷却（用于冷刺激）或加热（用于热刺激）至略低于或高于目标温度，然后使用塑料移液管开始扫描。在第5个周期结束后，立即使用移液管将刺激施加于同侧眼下方、口上方区域（V2支配区）或耳下方区域（V3支配区）。
注意：确保在第5个周期开始时，水温与目标温度相差不超过1 °C。为避免神经元脱敏，若水杯温度不准确则不应施加刺激，而应重新冷却或加热后再尝试。 - 实验结束时，在第6个周期开始，于V2或V3支配区域皮下注射50 mM氯化钾，以激活并识别所有有反应的神经元。
- 在所有刺激施加并记录完成后，通过过量注射氯胺酮/赛拉嗪（氯胺酮300 mg/kg，赛拉嗪30 mg/kg，或按步骤1.1配制的溶液5 µL/g）实施安乐死，随后进行断头处理。
3. 分析方案
- 使用拖放选项打开正交投影文件。在图像 | 类型 | RGB 颜色中选择图像类型。可选：在插件 | jars | StackReg下使用 StackReg31插件以校正运动伪影并进行图像对齐。
注意：研究者可根据个人偏好选择图像类型。RGB 模式可简化用于发表的彩色图像的生成。 - 通过分析 | 工具 | ROI 管理器打开 ROI 管理器。
- 使用工具栏中的椭圆或矩形工具绘制感兴趣区域（ROI），选择活跃神经元，然后点击 ROI 管理器窗口中的添加按钮，或按下"t"键，将该 ROI 添加至 ROI 文件中。
注意：请频繁保存 ROI 文件。可通过将 ROI 文件拖放到 ImageJ 中，并点击 ROI 管理器窗口底部的显示全部复选框来恢复 ROI。将 ROI 保存为 .zip 文件比保存为叠加图像更便于后续分析。在基线期出现波动的神经元应被视为自发活跃，而非对刺激产生反应，此类神经元应予以排除。 - 在分析 | 测量设置中，勾选平均灰度值（可选但推荐：取消勾选测量设置下的所有其他选项）。
- 在更多 | 多重测量的 ROI 窗口中进行荧光强度测量。
注意：有时相邻神经元距离过近，无法分别绘制独立的 ROI。此类神经元可计入活跃神经元总数，但不能用于瞬时强度测量。 - 多重测量将在一个新窗口中生成一个标记为"结果"的 CSV 文件。点击文件 | 另存为保存该 CSV 文件。使用电子表格软件打开该 .csv 文件，并将其保存为电子表格格式。
注意：分析模板请参见补充文件 1。 - 将 Ca2+ 瞬时强度计算为 ΔF/F0 = (Ft - F0)/F0，其中 Ft 为感兴趣时间点 ROI 内的像素强度，F0 为基线强度，由 Ca2+ 瞬变前 2–4 帧的平均强度确定（自发活动）或由刺激诱导 Ca2+ 瞬变的前 1–5 帧确定。排除所有在刺激前即产生 Ca2+ 峰值的神经元，并且不分析刺激后的活动。
- 在进行 Ca2+ 瞬时强度分析时，应从每个神经节中随机选取大致相同数量的神经元，以防止产生最多响应神经元的神经节在分析中占据主导地位。排除 ΔF/F0 < 0.15 的峰值。
注意：已有多种已发表的方法可用于神经元的分析、纳入与排除15,16,19,22,32,33,34,35。 - 使用工具栏中的直线工具，在 ImageJ 中沿神经元最长和最短直径分别绘制直线，计算其平均长度，以测量神经元直径。
注意：研究者也可通过测量 ROI 的面积和椭圆参数来估算直径。
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结果
通过共聚焦扫描 Pirt-GCaMP 三叉神经节实现大量神经元及特定三叉神经分支的成像
在 Pirt-GCaMP3 小鼠中手术暴露三叉神经节（TG）后，共聚焦显微镜可同时对超过 >3,000 个神经元进行成像（图 4）。该方法具有显著优势，能够在正常的生理环境中同时观察数千个 TG 神经元。在无刺激条件下可监测自发的 Ca2+ 瞬变信号（图 4A、B 和 视频 1）。可对 V2 支配区域施加刺激（图 4D、E 和 视频 2），也可对 V3 支配区域施加刺激（图 4G、H 和 视频 3）。可同时监测自发的 Ca2+
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讨论
颞下颌关节疼痛障碍和根尖周炎分别影响约5%36和30-70%37,38的普通人群。初级感觉神经元可检测皮肤、口腔黏膜、牙齿及眶周区域的有害刺激，其可塑性参与了持续性疼痛的发生。虽然可通过细胞培养和组织外植体研究神经元，但这些方法脱离了神经元正常的生理环境。通过手术暴露三叉神经节（TG）后，利用Pirt-GCaMP3进行钙成像，可使研究人员在正常生理环境下通过面部和头部刺激（包括三叉神经分支的刺激）来研究初级感觉神经元30。该钙成像方法的主要优势在于能够同时监测大量神经元。该方法可用于分析对照组和疼痛模型动物中神经元的直径及其对激素的反应19,22,23,24。
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院资助，资助编号为 R01NS0128574 和 R01DE031477（授予 Y.S.K.），以及德克萨斯大学系统的 Rising STAR 奖（Y.S.K.）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 阿法沙龙注射液（赛拉嗪） | Covetrus, Akorn | 33197 | |
| Flurar 5x/0.25 M27 物镜 | Cal Zeiss | 420130-9900-000 | |
| 棉签 | McKesson | 24-106-1S | |
| 弯止血钳 | Fine Science Tools | 13007-12 | |
| 直流温度控制器 | FHC | 40-90-8D | |
| 直流温度控制器加热垫 | FHC | 40-90-2-05 | |
| 杜蒙陶瓷涂层镊子 | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| FHC 直流温度控制器 | FHC | 40-90-8D | |
| 氟利安（异氟烷） | MWI Animal Health, Piramal Group | 501017 | |
| 弗里德曼-皮尔逊咬骨钳 | Fine Science Tools | 16221-14 | |
| 明胶海绵（GelFoam） | Pfizer | 09-0353-01 | |
| ImageJ | 美国国立卫生研究院（National Institutes of Health） | ij153 | |
| 氯胺酮注射液（氯胺酮） | Zoetis | KET-00002R2 | |
| 923-B 型小鼠气体麻醉头固定装置（成年小鼠） | Kopf Instruments | 923-B | |
| 发光绿色载物台胶带 | JSITON/ Amazon | B803YW8ZWL | |
| M35 紧凑型电动牙科手柄系统 | Buffalo Dental Manufacturing Co., Inc. | M35 | |
| Matrx VIP 3000 异氟烷蒸发器 | Midmark | 91305430 | |
| 显微解剖剪刀 | Roboz | RS-5882 | |
| 显微解剖弹簧剪刀 | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| 显微解剖弹簧剪刀 | Roboz | RS-5677 | |
| 微型直肠热敏电阻探头 | FHC | 40-90-5D-02 | |
| 手术剪刀 | Roboz | RS-6812 | |
| Pirt-GCaMP3 C57/BL/6J 小鼠 | 约翰斯·霍普金斯大学（Johns Hopkins University） | N/A | 两种性别的小鼠均可进行成像，成像效果相当。由于较年轻小鼠中 Pirt 启动子表达较弱或不稳定，因此小鼠年龄应至少为 8 周。 |
| 氯化钾 | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| 立体定位仪框架 | Kopf Model 923-B | 923-B | |
| 立体定位面罩（主动式），适用于体重 <30g 并带导管的小鼠 | RWD Life Sciences | 68663 | |
| 锥形裂钻（31P） | Buffalo Dental Manufacturing Co., Inc. | 31P-GOLD | |
| td-Tomato C57BL/6J 小鼠 | 杰克逊实验室（Jackson Laboratory） | 7909 | |
| 顶板，6 英寸 × 10 英寸 | Newport | 290-TP | |
| 移液管，3 mL | Cole Parmer | UX-06226-23 | |
| TrpV1-Cre C57BL/6J 小鼠 | 杰克逊实验室（Jackson Laboratory） | 17769 | |
| 蔡司 LSM 800 共聚焦显微镜 | Cal Zeiss | LSM800 | |
| 蔡司 Zen 2.6 蓝色版软件 | Cal Zeiss | Zen (Blue Edition) 2.6 |
参考文献
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