伴纤维化的代谢功能障碍相关脂肪性肝病小鼠模型

摘要

一种模拟代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）的小鼠模型，具有代谢功能障碍、肝脏基因表达改变以及肝组织病理学变化，且包含进展至晚期纤维化3期的纤维化特征，与人类MASLD相似。该模型可用于MASLD发病机制的研究以及新疗法的临床前研究。

摘要

肝纤维化是代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）不良结局的最重要预测指标。在MASLD的临床前研究中，小鼠是最常用的疾病模型。然而，在这些模型中，肝纤维化的诱导较为困难。本方案描述了一种MASLD小鼠模型，其中采用食欲亢进的Ay小鼠喂饲富含脂肪和果糖的饮食，该饮食类似于美国的平均饮食。这些小鼠会出现肝脂肪变性、肝损伤、炎症及纤维化。纤维化在16周时发展为围绕肝细胞的1期纤维化，至12个月时进展为桥接状3期纤维化。这些小鼠还表现出肥胖、高甘油三酯血症、葡萄糖耐受不良和高胰岛素血症。该疾病模型可重现人类MASLD的肝脏组织病理学特征、肝脏基因表达改变以及代谢功能障碍。本方案包括两种量化纤维化的方法：采用苦味酸-天狼星红对胶原进行组织学染色，以及定量肝脏中羟脯氨酸含量。这些方法可用于MASLD病理生理机制的研究以及潜在治疗手段的临床前研究。

引言

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是最常见的肝脏疾病，在美国的患病率为31%至40%，全球患病率为42%^1,2,3,4。MASLD患者可进展为代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH），即既往所称的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化及肝细胞癌^5,6。MASLD增加肝细胞癌的发生风险；随着近年来MASLD患病率的上升，MASLD已成为发生肝细胞癌患者中最常见的肝脏疾病^7,8。在MASLD中，肝纤维化是进展为肝硬化以及不良临床结局（包括肝脏相关发病率（肝失代偿、肝衰竭或肝癌）和肝脏相关死亡率）的主要预测因素^6,9,10,11。因此，美国食品药品监督管理局（FDA）鼓励研发针对伴有纤维化的MASH/NASH 的治疗药物，并提倡使用合适的动物模型¹²。

在药物的临床前研究和代谢相关脂肪性肝病（MASLD）的机制研究中，最常使用小鼠模型¹³。已有数千种MASLD小鼠模型被报道，表明目前尚无针对最佳模型的共识^13,14。建立理想模型面临多项挑战。尽管通过高脂饮食相对容易诱导小鼠产生肥胖和肝脂肪变性，但肝纤维化的诱导则更为困难^13,14,15,16。在以致肥胖饮食驱动的MASLD模型中，纤维化发展缓慢¹⁷。尽管这种缓慢进展可能更接近人类疾病的自然病程¹⁸，但它 延长了动物实验的周期并增加了成本。高胆固醇含量的饮食（例如2%）可促进纤维化的发展；然而，这类饮食会降低胆固醇的内源性合成，而这与人类疾病中观察到的胆固醇合成增加相反 ^15,16。一些MASLD模型使用突变型或基因修饰小鼠；但这些模型也存在局限性：ob/ob小鼠可发展出肥胖、脂肪变性和胰岛素抵抗，但缺乏作为纤维化介质的瘦素（leptin）；PTEN基因敲除小鼠可发展出脂肪变性，但不出现胰岛素抵抗^15,17。因此，MASLD小鼠模型通常需要较长的研究周期、高胆固醇饮食或基因操作，才能发展出显著的纤维化¹⁴。为解决其中部分问题，我们开发了一种小鼠模型，该模型可使动物发展出MASLD，并伴随纤维化从细胞周/窦周纤维化（1期）进展至桥接纤维化（3期）¹⁹。

本文的目的是描述伴有肝纤维化的MASLD模型，以及两种量化纤维化的方法：通过苦味酸-天狼星红进行胶原组织学染色，以及测定肝脏羟脯氨酸含量。

建立该模型的依据在于，最有用的动物模型应能在疾病驱动因素以及组织病理学和基因表达变化方面最好地模拟人类疾病。因此，我们采用了一种类似于美国人群平均饮食的饲料，其中包含中等偏高水平的脂肪和果糖^19,20。我们将这种饲料喂给携带刺鼠黄色（Agouti yellow，A^y）突变基因的小鼠，这类小鼠已被广泛用于肥胖研究模型²¹。这些小鼠普遍表达刺鼠蛋白，该蛋白是包括MC4R在内的黑皮质素受体的拮抗剂，可导致摄食过度，模拟人类肥胖中常见的食物摄入增加现象^21,22,23。该模型重现了代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）的关键特征性改变，包括肝脂肪变性、肝细胞损伤、炎症、纤维化以及代谢功能障碍。

该模型的主要优势在于其与人类疾病相似的特征。该模型采用西方饮食（Western-type diet），这种饮食旨在模拟典型的美国饮食，已被证明是复制人类MASLD表型最有效的饮食方案^14,20。小鼠出现的肝脏组织病理学改变与MASH患者肝脏中所描述的病变相似^19,24。小鼠还发展出代谢功能障碍，这是诊断MASLD的关键标准之一⁵。MASH小鼠肝脏中的基因表达变化与MASH/NASH患者体内的变化相一致¹⁹。最近一项研究对39种MASLD小鼠模型与人类疾病的相似性进行了比较，其中包括MC4R基因敲除小鼠，这类小鼠具有相同的 摄食过度机制，并接受与本研究描述模型相同的饮食方案¹⁴。该模型在表型、肝脏组织病理学和转录组学评估中，与人类MASLD的相似性在39个模型中排名第五¹⁴。

该模型的其他优势包括：Ay 小鼠可从杰克逊实验室（Jackson Laboratory）商业化获得，并且有常用于代谢研究的 C57BL/6J 品系^21,25；突变小鼠可通过毛色轻松识别；该模型可与其他基因功能获得或功能缺失模型联用，以研究特定基因在 MASLD 发生发展中的作用；最后，该模型不依赖营养缺乏（如胆碱或蛋氨酸缺乏）、非常规食物成分（胆酸、乙硫氨酸）、 特定营养素异常高含量（反式脂肪）或肝毒素（四氯化碳）等手段，这些因素并非 MASLD 的常见病因，且可能无法准确模拟人类疾病^13,14,17。

该方法适用于研究促进MASLD发生和发展的机制，以及评估其治疗或预防干预措施。该模型特别有用，因为动物不仅会发展为脂肪性肝炎和代谢功能障碍，还会出现进展至3期的纤维化。然而，该模型可能不适用于研究影响摄食行为的机制（例如GLP1R激动剂），因为这些小鼠存在摄食过度现象。

方案

本方案遵循布鲁克林学院的动物护理指南；IACUC方案编号318。

1. 伴有纤维化的MASLD小鼠模型

1. 繁育小鼠以获得 Ay 后代。将 Ay 小鼠（B6.Cg-Ay/J）配对交配，记录仔鼠出生日期。
2. 确保每窝仔鼠数量相近，以促进充分且均匀的哺乳和生长。每窝保留5至6只仔鼠为宜，此为C57BL/6J小鼠的平均窝产仔数。多余仔鼠可优先选择不需要性别的个体进行安乐死或寄养。
   注意：使用 Ay 雄性小鼠与野生型雌性小鼠（C57BL/6J Jax 000664）进行交配可能提高繁殖效率，因为野生型 C57BL/6J 雌性小鼠易于获得，且繁殖能力可能优于 Ay 雌性小鼠。
3. 按照下述说明设置实验用笼具。
   1. 通过小鼠的黄色毛色鉴定 Ay 小鼠。为每只小鼠分配唯一的编号，并进行标记或 tagging。
      注意：刺鼠基因（agouti gene）的黄毛等位基因（Ay）可导致小鼠呈现黄色毛色。该等位基因在杂合子中表现为半显性。纯合状态会导致胚胎致死。因此，具有黄色毛色的小鼠均为 Ay 基因的杂合子。
   2. 小鼠在21日龄时断奶。将研究期间同笼饲养的小鼠分组并放在一起。根据预期体重和机构指南，每笼饲养三至四只Ay小鼠。
   3. 喂食标准饲料并提供饮水。将小鼠饲养在标准温度（20–23 °C）和相对湿度（40%–60%）环境中，光照周期为12小时光照、12小时黑暗。
4. 从8周龄开始，给Ay小鼠喂食高脂肪高果糖饮食（High Fat and Fructose Diet, HFFD），具体方法如下所述。
   1. 为Ay小鼠提供高脂高蔗糖的西方饮食（调整热量的西方饮食 Inotiv TD.88137） 随意摄取.
   2. 配制含有果糖（23 g/L）和葡萄糖（19 g/L）的饮用水溶液。使用0.2 µm滤膜过滤除菌，并将溶液储存于无菌瓶中。开启后应冷藏保存。
   3. 为小鼠提供含有果糖和葡萄糖的溶液，置于无菌饮水瓶中供其饮用。每周至少更换一次溶液和饮水瓶，并检查是否有微生物生长。
   4. 使用无营养成分的笼具垫料（例如木屑）。
5. 对照组小鼠饲喂低脂低果糖饮食，具体如下所述。
   注意：对照小鼠的选择取决于研究设计：如果使用 Ay-HFFD 小鼠评估药物效果，对照组可采用给予安慰剂的 Ay-HFFD 小鼠；如果该模型用于研究基因修饰对纤维化发展的影响，可使用未进行基因修饰的 Ay-HFFD 小鼠作为对照；如果需要无 MASH 的对照组，可按照此处描述的步骤进行操作。
   1. 使用与 Ay 小鼠同窝出生的野生型小鼠。可通过其黑色毛色进行鉴别。
   2. 从小鼠相同年龄开始，喂食对照饮食（Inotiv TD.08485 低脂对照饮食；称为低脂高果糖饮食，LFFD），并提供普通饮用水。
6. 通过将清醒的小鼠放入已去皮的容器中，置于天平上称重，每周记录一次体重，以监测肥胖的发展情况。
7. 确保小鼠始终有充足的食物和饮用溶液。如有需要，监测并记录食物和饮用溶液的消耗量，以估算热量摄入。
8. 按照下述方法收集组织。
   1. 在高脂肪饲料（HFFD）饮食16周后进行组织采集。通过吸入二氧化碳（或机构IACUC批准的其他方法）处死小鼠。
      注意：饲喂高果糖高脂肪饮食（HFFD）16周后，Ay小鼠通常会出现1期纤维化；延长喂养时间将导致更严重的纤维化，9至12个月后进展至3期。
   2. 称量小鼠并记录体重¹⁹.
   3. 必要时采集血液。操作时，在打开腹腔后、解剖肝脏前，使用1 mL注射器和27G针头从下腔静脉采血（或采用其他 其他方法 经IACUC批准。
   4. 通过腹部正中切口打开腹腔，用镊子夹住肝脏的肝门部位，用剪刀剪断将肝脏与膈肌和后腹膜相连的韧带，分离肝脏。称量肝脏重量并记录。
   5. 用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗肝脏。拍摄肝脏照片并  在图像中包含一把尺子或其他物体作为尺寸参照。将肝脏置于放置在冰上的培养皿中。
   6. 解剖多个肝叶的样本（每个样本约100至150 mg），包括方叶、左叶和右叶。确保样本厚度不超过4 mm，以利于固定。将样本置于固定液（10%福尔马林或4%甲醛）中固定24小时，随后进行组织病理学分析（见下文）。
   7. 解剖多个叶的额外样本，将其放入离心管（1.5 或 2 mL）中，通过浸入液氮中速冻后，于 -80 °C 保存。这些样本将用于测定羟脯氨酸含量。
   8. 如有需要，可采集其他器官组织样本（如脂肪组织、肌肉等）

2. 胶原组织化学染色与形态计量学定量分析

注意：使用危险和/或挥发性化学品的步骤应在通风橱中进行。所有载玻片应使用染色缸和载玻片架平行处理。

1. 按以下方法制备肝组织切片。
   1. 将肝组织置于福尔马林（或甲醛）中固定24小时，室温保存。固定液体积应为组织体积的20倍。随后将组织转移至70%乙醇中。此步骤可作为暂停点。
      注意：组织可置于组织学包埋盒中，再将包埋盒放入含有固定液的容器内，也可直接将组织分别置于单独的容器或离心管中。
   2. 将组织包埋于石蜡中。此步骤通常由组织病理学核心实验室或服务机构完成。
   3. 获取厚度为0.5 µm并贴附于载玻片上的切片（非带电荷载玻片即可）。将切片置于室温下空气中自然干燥。此步骤通常由组织病理学核心设施或服务机构完成。此步骤可作为暂停点。
2. 脱蜡并按以下所述复水切片。
   1. 将切片浸入两种不同的脱蜡/透明溶液（二甲苯或Citrisolv）中进行脱蜡，每种溶液浸泡5-15分钟。
   2. 依次将切片浸入100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇和水中进行复水，每步5分钟。
3. 按照下述方法用苦味品红-天狼星红对切片进行染色。
   1. 将切片浸入含1 g/L Sirius红（直接红80）和1.3%苦味酸的溶液中染色1小时。染色时间不宜过长，以免直接红对胶原以外的结构（如细胞核）着色。如需复染，可在染色液中加入快速绿（1 g/L）²⁶或者，使用Weigert's苏木精染细胞核²⁷.
   2. 将苦味酸-天狼星红溶液倒回密闭的棕色玻璃瓶或塑料容器中保存。该溶液可多次重复使用（至少20年）²⁷).
4. 将样本浸入乙醇（100%）中5分钟以脱水。更换新的乙醇重复处理一次。
5. 浸入透明剂（二甲苯或Citrisolv）中，直至取出用于封片。
6. 一次从透明溶液中取出一张载玻片，用纸巾轻压以吸去多余液体。加入封片介质（约50至100 µL），将盖玻片覆盖于组织切片上，轻轻按压盖玻片以排除气泡。静置晾干。
   注意：本实验方案在此步骤可暂停。
7. 使用明场照明的光学显微镜，配合4x至20x物镜观察切片——胶原纤维呈红色，背景为浅黄橙色。根据相机使用说明，用彩色相机拍摄感兴趣区域的图像。
8. 使用偏振光显微镜进行成像，具体步骤如下所述。
   1. 将偏振器和分析器滤光片正交调节，以确保胶原纤维可见且背景信号最小。胶原纤维在深色背景下呈白色、黄色或橙色。在纤维化程度较低或无纤维化的切片中，可见血管壁中的胶原纤维。所有待比较样本的设置（包括照明强度）应保持一致。
   2. 使用黑白相机或彩色相机的黑白模式进行成像。采用4倍放大倍数的物镜。每个组织切片采集多张图像。若靠近肺门区域存在较大的血管，则应避开该区域。所有需要比较的图像均需使用相同的成像参数设置。
9. 使用 Photoshop（替代方案 a）进行形态计量学定量分析，具体步骤如下所述。
   1. 量化图像中对应于胶原的白色区域。在 Photoshop 中点击 选择 > 颜色范围, 然后 s电泳 亮点，调整“模糊度”和“范围”参数，以选择对应于胶原的白色像素。接下来，选择 窗口 > 直方图 > 扩展视图 并记录所选像素的数量，该数值显示在参数“Pixels”旁边. 所有待比较图像均需使用相同的参数。
   2. 量化图像的总面积。在 Photoshop 中，点击 选择 > 全部然后记录像素总数，方法与之前相同。
   3. 通过将白色像素数量除以总像素数量，计算图像中对应胶原的面积百分比。结果通常以面积百分比表示。
10. 使用 ImageJ（替代方案 b）进行形态计量学定量分析，具体步骤如下所述。
    1. 选择图像中对应于胶原的白色区域。通过点击打开阈值工具 图像 > 调节 > 阈值 （或按） Shift + T将阈值范围设置为仅使胶原蛋白染色区域（白色区域）以红色高亮显示（例如，最小阈值64；最大阈值：255），然后点击 应用这将对图像进行二值化处理，使胶原区域变为黑色，背景变为白色。
    2. 通过点击测量总图像面积 分析 > 设置测量参数检查 面积 和 显示标签点击 好的. 点击 分析 > 测量 （或按） M 在键盘上）。结果窗口将显示图像的总面积。
    3. 为测量胶原面积和百分比，首先通过点击启用“限制阈值” 分析 > 设置测量参数检查 面积，面积分数 （ImageJ 将自动计算胶原蛋白百分比）， 阈值限制，以及 显示标签. 点击 好的然后，单击 分析 > 测量 （或按） M结果窗口将显示：胶原面积（绝对像素数量）和面积分数（胶原占整个图像的百分比）。
    4. 通过选择保存结果 另存为 或复制到剪贴板，然后粘贴到电子表格中。

3. 肝脏羟脯氨酸定量分析

注意：使用强碱和强酸的步骤必须佩戴适当的个人防护装备进行操作。

1. 称取步骤1.8.7中制备的肝组织样品并记录重量。将组织等分试样放入适合均质化的试管中。按照每100 mg组织加入900 µL水的比例，加入去离子水。
2. 根据制造商说明书，通过珠击法或其他方法进行均质化，直至通过肉眼观察确认组织完全均质化。此步骤可暂停，均质液可在-20 °C下保存。
3. 按以下方法进行蛋白质沉淀。除特别注明温度外，以下所有步骤均在室温下进行。
   1. 将约500 µL至1000 µL的均质液转移至1.5 mL离心管中。所有样品应转移相同体积。
   2. 加入三氯乙酸，使其终浓度为12%（例如，向880 µL均质液中加入120 µL三氯乙酸）²⁸。短暂涡旋混匀。
   3. 将样品置于冰/水浴中孵育30分钟。在4 °C下以6,000 × g离心10分钟，形成含蛋白质的沉淀。用抽吸法去除上清液。将试管保持在冰上。
   4. 加入1 mL预冷的乙醇（100%）洗涤沉淀。通过超声处理（或其他方法）重悬沉淀，并通过肉眼确认物质已充分重悬。在4 °C下以 6,000 × g离心10分钟，抽吸去除上清液。根据设备说明书设置超声参数（例如，使用Branson SFX 150超声破碎仪配合直径3.2 mm的微尖探头，振幅70%，处理10秒，适用于大多数样品）。 重复洗涤2次。
   5. 让沉淀在空气中干燥10分钟，必要时可延长干燥时间。
4. 按以下方法进行蛋白质水解。
   1. 向含有蛋白质沉淀的试管中加入800 µL 6 N盐酸。使用与步骤3.3.4相同的参数，通过超声处理（或其他方法）重悬沉淀。
   2. 将蛋白质悬液转移至带螺旋盖的玻璃试管或小瓶中，盖紧。在110 °C烘箱中孵育22 ± 2小时²⁹。
   3. 以16,000 × g离心10分钟；颗粒物将形成沉淀。通常需要先将水解液从玻璃小瓶转移至离心管后再进行离心。
   4. 将含有羟脯氨酸的上清液转移至1.5 mL试管中。此步骤可暂停。水解液可在4 °C下保存。
5. 制备羟脯氨酸浓度的标准曲线。对于纤维化程度为1至3期的肝组织样品，使用本方案中指定的组织量时，标准品浓度最高达125 µg/mL即可满足需求（例如，依次稀释为125、62.5、31.3、15.6、7.81、3.91、1.95和0 µg/mL）。使用6 N盐酸稀释羟脯氨酸制备标准品。
6. 将每种样品和标准品各40 µL转移至已标记的1.5 mL离心管中。向每管加入10 µL 10 N氢氧化钠，短暂涡旋混匀。
7. 按以下方法进行羟脯氨酸的氧化反应。
   1. 在去离子水中配制乙酸-柠檬酸缓冲液，含乙酸1.2%（v/v）、柠檬酸46 g/L、三水合乙酸钠120 g/L和氢氧化钠34 g/L，并将缓冲液pH调节至6.5。
   2. 配制氯胺T水溶液，浓度为12.7 g/L，溶剂为水:n-丙醇:乙酸-柠檬酸缓冲液（1:1:8 v:v:v）。首先将氯胺T溶于水中并混匀，然后加入n-丙醇混匀，最后加入乙酸-柠檬酸缓冲液并混匀。
   3. 向样品和标准品管中各加入450 µL氯胺T溶液。涡旋混匀。室温孵育25分钟³⁰。
8. 配制Ehrlich试剂：将1 M 4-(二甲氨基)苯甲醛溶于高氯酸:丙醇（1:2 v/v）中。向样品和标准品中各加入500 µL Ehrlich试剂。涡旋混匀。
9. 在加热块、水浴或培养箱中于65 °C孵育20分钟。孵育结束后，让样品和标准品冷却至室温。
10. 使用分光光度计在550 nm波长下测定样品和标准品的吸光度。
11. 绘制吸光度与标准品含量的关系图，采用线性回归拟合标准曲线。利用标准曲线参数计算样品中羟脯氨酸的浓度。
12. 根据水解液的总体积（步骤3.4）计算肝组织样品中羟脯氨酸的总量，并以用于蛋白质沉淀的均质液体积所对应的组织质量进行归一化。结果以每毫克组织中含有的羟脯氨酸纳克数（ng/mg组织）表示。或者，也可测定均质液中的蛋白浓度，并将结果表示为每单位质量蛋白质中羟脯氨酸的质量。

结果

摄食高脂肪饲料（HFFD）的 Ay 小鼠比摄食低脂肪饲料（LFFD）的野生型小鼠体重增加更多，并出现肥胖（图1A）。在摄食 HFFD 的前4周内，它们体重增长更快，每周约增加 3–4 g。8 周后，其体重增长速率与对照组小鼠相似（每周约 0.6 g）¹⁹。16 周后，摄食 HFFD 的 Ay 小鼠体重约为 45 g 至 50 g（三次独立实验的平均值），比摄食 LFFD 的对照组野生型小鼠体重高出约 40% 至 80%（图1B、C）。

与对照组相比，Ay HFFD 小鼠的脂肪组织储存量更高，脂肪垫增大（图 1D、E）。体成分分析表明，其体重增加是由于脂肪质量增加所致，该结果通过核磁共振（NMR）测定得到证实¹⁹。这些小鼠还表现出葡萄糖耐受不良和...

讨论

本方案描述了一种伴有肝纤维化的MASLD小鼠模型，该模型可复制人类MASLD疾病^5，6。这些小鼠会出现肝脂肪变性，组织学上表现为微泡和大泡混合性脂肪变性，并伴有肝脏三酰甘油含量升高¹⁹。小鼠还表现出肥胖、高甘油三酯血症、葡萄糖耐受不良，且已有研究报道其存在高血压，这些特征与肝脂肪变性共同符合人类MASLD的诊断标准^19，32。除了脂肪变性外，小鼠还表现出MASH的其他典型病理改变¹⁹：这些小鼠存在肝细胞损伤，表现为苏木精-伊红染色肝组织切片中可见肝细胞气球样变，以及血浆转氨酶水平升高¹⁹。同时存在肝脏炎症，组织学可见小叶内炎症，CD45免疫组织化学染色阳性，且炎症标志基因的mRNA表达水平升高¹⁹。更重要的是，小鼠肝...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4-(二甲氨基)苯甲醛	Sigma-Aldrich	D2004
乙酸	Various	NA
调整热量的西方饮食	Inotiv	TD.88137	饮食含脂肪（42 %kcal）和蔗糖（34 %w/w）。其他供应商也提供相同成分的饮食
B6.Cg-Ay/J	杰克逊实验室	000021	该品系具有Agouti致死性黄色突变，背景为C57BL6/J。目前，杰克逊实验室已将该品系冷冻保存
C57BL/6J	杰克逊实验室	000664
离心机	Various	NA	配备适用于1.5 mL离心管的转子，带制冷功能，可达到16,000 ×g
离心机	Various	NA
氯胺-T水合物	Sigma-Aldrich	857319
柠檬酸	Various	NA
直接红80	Sigma	365548-5G
乙醇	Decon Laboratories	2701
中性缓冲福尔马林溶液	Sigma	HT501128
果糖	Sigma-Aldrich	F0127
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270
组织学处理设备	NA	NA	包埋和切片可在研究者实验室或外部设施完成
匀浆器	Various	NA	珠磨式匀浆器适用于处理多个样品，也可使用其他匀浆方法
盐酸	Various	NA
羟脯氨酸	Sigma	H5534
低脂对照饮食	Inotiv	TD.08485	对照饮食，低脂肪（13 %kcal）和低蔗糖（12 %w/w）
配备偏振光显微镜功能的显微镜	Various	NA
正丙醇	Various	NA
高氯酸	Various	NA
Permount封片介质	费希尔科技	SP15-100
苦味酸饱和水溶液，Spectrum	费希尔	18612375
三水合乙酸钠	Various	NA
氢氧化钠	Various	NA
超声破碎仪	Various	NA	超声破碎仪在步骤2.5中用于重悬沉淀，但并非绝对必要
三氯乙酸	Various	NA
VWR显微盖玻片，矩形	VWR	48393-081
VWR Premium Superfrost Plus显微载玻片 | VWR	VWR	48311-703
去离子水	Various	NA	来自水纯化系统的去离子水，或从供应商处购买
二甲苯	费希尔科技	X3F	Citrisolv透明剂 （费希尔 22-143-975）作为环境友好型替代品出售