伴纤维化的代谢功能障碍相关脂肪性肝病小鼠模型

摘要

一种模拟代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）的小鼠模型，具有代谢功能障碍、肝脏基因表达改变以及肝组织病理学变化，且包含进展至晚期纤维化3期的纤维化特征，与人类MASLD相似。该模型可用于MASLD发病机制的研究以及新疗法的临床前研究。

摘要

肝纤维化是代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）不良结局的最重要预测指标。在MASLD的临床前研究中，小鼠是最常用的疾病模型。然而，在这些模型中，肝纤维化的诱导较为困难。本方案描述了一种MASLD小鼠模型，其中采用食欲亢进的Ay小鼠喂饲富含脂肪和果糖的饮食，该饮食类似于美国的平均饮食。这些小鼠会出现肝脂肪变性、肝损伤、炎症及纤维化。纤维化在16周时发展为围绕肝细胞的1期纤维化，至12个月时进展为桥接状3期纤维化。这些小鼠还表现出肥胖、高甘油三酯血症、葡萄糖耐受不良和高胰岛素血症。该疾病模型可重现人类MASLD的肝脏组织病理学特征、肝脏基因表达改变以及代谢功能障碍。本方案包括两种量化纤维化的方法：采用苦味酸-天狼星红对胶原进行组织学染色，以及定量肝脏中羟脯氨酸含量。这些方法可用于MASLD病理生理机制的研究以及潜在治疗手段的临床前研究。

引言

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是最常见的肝脏疾病，在美国的患病率为31%至40%，全球患病率为42%^1,2,3,4。MASLD患者可进展为代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH），即既往所称的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化及肝细胞癌^5,6。MASLD增加肝细胞癌的发生风险；随着近年来MASLD患病率的上升，MASLD已成为发生肝细胞癌患者中最常见的肝脏疾病^7,8。在MASLD中，肝纤维化是进展为肝硬化以及不良临床结局（包括肝脏相关发病率（肝失代偿、肝衰竭或肝癌）和肝脏相关死亡率）的主要预测因素^6,9,10,11。因此，美国食品药品监督管理局（FDA）鼓励研发针对伴有纤维化的MA....

方案

本方案遵循布鲁克林学院的动物护理指南；IACUC方案编号318。

1. 伴有纤维化的MASLD小鼠模型

1. 繁育小鼠以获得 Ay 后代。将 Ay 小鼠（B6.Cg-Ay/J）配对交配，记录仔鼠出生日期。
2. 确保每窝仔鼠数量相近，以促进充分且均匀的哺乳和生长。每窝保留5至6只仔鼠为宜，此为C57BL/6J小鼠的平均窝产仔数。多余仔鼠可优先选择不需要性别的个体进行安乐死或寄养。
   注意：使用 Ay 雄性小鼠与野生型雌性小鼠（C57BL/6J Jax 000664）进行交配可能提高繁殖效率，因为野生型 C57BL/6J 雌性小鼠易于获得，且繁殖能力可能优于 Ay 雌性小鼠。
3. 按照下述说明设置实验用笼具。
   1. 通过小鼠的黄色毛色鉴定 Ay 小鼠。为每只小鼠分配唯一的编号，并进行标记或 tagging。
      注意：刺鼠基因（agouti gene）的黄毛等位基因（Ay）可导致小鼠呈现黄色毛色。该等位基因在杂合子中表现为半显性。纯合状态会导致胚胎致死。因此，具有黄色毛色的小鼠均为 Ay 基因的杂合子。
   2. 小鼠在21日龄时断奶。将研究期间同笼饲养的小鼠分组并放在一起。根据预期体重和机构指南，每笼饲养三至四只Ay小鼠。
   3. 喂食标准饲料并提供饮水。将小鼠饲养在标准温度（20–23 °C）和相对湿度（40%–60%）环境中....

结果

摄食高脂肪饲料（HFFD）的 Ay 小鼠比摄食低脂肪饲料（LFFD）的野生型小鼠体重增加更多，并出现肥胖（图1A）。在摄食 HFFD 的前4周内，它们体重增长更快，每周约增加 3–4 g。8 周后，其体重增长速率与对照组小鼠相似（每周约 0.6 g）¹⁹。16 周后，摄食 HFFD 的 Ay 小鼠体重约为 45 g 至 50 g（三次独立实验的平均值），比摄食 LFFD 的对照组野生型小鼠体重高出约 40% 至 80%（图1B、C）。

与对照组相比，Ay HFFD 小鼠的脂肪组织储存量更高，脂肪垫增大（图 1D、E）。体成分分析表明，其体重增加是由于脂肪质量增加所致，该结果通过核磁共振（NMR）测定得到证实¹⁹。这些小鼠还表现出葡萄糖耐受不良和.......

讨论

本方案描述了一种伴有肝纤维化的MASLD小鼠模型，该模型可复制人类MASLD疾病^5，6。这些小鼠会出现肝脂肪变性，组织学上表现为微泡和大泡混合性脂肪变性，并伴有肝脏三酰甘油含量升高¹⁹。小鼠还表现出肥胖、高甘油三酯血症、葡萄糖耐受不良，且已有研究报道其存在高血压，这些特征与肝脂肪变性共同符合人类MASLD的诊断标准^19，32。除了脂肪变性外，小鼠还表现出MASH的其他典型病理改变¹⁹：这些小鼠存在肝细胞损伤，表现为苏木精-伊红染色肝组织切片中可见肝细胞气球样变，以及血浆转氨酶水平升高¹⁹。同时存在肝脏炎症，组织学可见小叶内炎症，CD45免疫组织化学染色阳性，且炎症标志基因的mRNA表达水平升高¹⁹。更重要的是，小鼠肝.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4-(二甲氨基)苯甲醛	Sigma-Aldrich	D2004
乙酸	Various	NA
调整热量的西方饮食	Inotiv	TD.88137	饮食含脂肪（42 %kcal）和蔗糖（34 %w/w）。其他供应商也提供相同成分的饮食
B6.Cg-Ay/J	杰克逊实验室	000021	该品系具有Agouti致死性黄色突变，背景为C57BL6/J。目前，杰克逊实验室已将该品系冷冻保存
C57BL/6J	杰克逊实验室	000664
离心机	Various	NA	配备适用于1.5 mL离心管的转子，带制冷功能，可达到16,000 ×g
离心机	Various	NA
氯胺-T水合物	Sigma-Aldrich	857319
柠檬酸	Various	NA
直接红80	Sigma	365548-5G
乙醇	Decon Laboratories	2701
中性缓冲福尔马林溶液	Sigma	HT501128
果糖	Sigma-Aldrich	F0127
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270
组织学处理设备	NA	NA	包埋和切片可在研究者实验室或外部设施完成
匀浆器	Various	NA	珠磨式匀浆器适用于处理多个样品，也可使用其他匀浆方法
盐酸	Various	NA
羟脯氨酸	Sigma	H5534
低脂对照饮食	Inotiv	TD.08485	对照饮食，低脂肪（13 %kcal）和低蔗糖（12 %w/w）
配备偏振光显微镜功能的显微镜	Various	NA
正丙醇	Various	NA
高氯酸	Various	NA
Permount封片介质	费希尔科技	SP15-100
苦味酸饱和水溶液，Spectrum	费希尔	18612375
三水合乙酸钠	Various	NA
氢氧化钠	Various	NA
超声破碎仪	Various	NA	超声破碎仪在步骤2.5中用于重悬沉淀，但并非绝对必要
三氯乙酸	Various	NA
VWR显微盖玻片，矩形	VWR	48393-081
VWR Premium Superfrost Plus显微载玻片 | VWR	VWR	48311-703
去离子水	Various	NA	来自水纯化系统的去离子水，或从供应商处购买
二甲苯	费希尔科技	X3F	Citrisolv透明剂 （费希尔 22-143-975）作为环境友好型替代品出售