丝状真菌通过固态发酵系统生产聚合物水解胞外酶的设计

摘要

本方案利用麦麸在旋转式固态发酵系统中提高酶的产量。该底物添加了壳聚糖等诱导剂，在受控条件下促进真菌生长。实验结果表明，与液体深层发酵相比，酶的产量提高了4至6倍，显示出该方法在多种生物技术应用中的适应性和高效性。

摘要

固态发酵（SSF）是一种利用不溶于水相介质的固体基质的生物转化过程。微生物在基质表面生长，并穿透其固相基质以获取生长所需的营养物质。SSF 的特征是游离水含量极低，基质含水量维持在 70% 以上，包含气相、液相和固相三个相互关联的相态。本实验方案描述了在旋转系统中使用农业工业副产物麦麸作为产酶基础基质的方法。通过添加诱导剂（如几丁质、壳聚糖、淀粉或纤维素）以促进水解蛋白的合成。该系统具有高度适应性，可使用不同形态的真菌，包括菌丝体、孢子或菌粒。在所述方法中，诱导剂与基质按 1:100（w/w）的比例混合后进行灭菌 通过 高压灭菌后，用无菌水调节至所需含水量。随后加入真菌接种物，旋转系统以10 rpm运转，以确保充分混合和供氧。系统在中温或嗜热/耐热性真菌的最佳生长条件下培养6–8天，从而提高其适用性。培养完成后，使用适当的冷缓冲液（如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐缓冲液）提取酶，具体选择取决于酶的类型。提取液通过离心和过滤澄清，获得无细胞上清液。根据需要可进一步浓缩或纯化酶。实验结果表明，与液体深层发酵（SmF）相比，酶活性提高了4–6倍，凸显了该系统的高效性。该系统可适应不同底物、诱导物及真菌种类，因而在多种生物技术应用中具有重要价值。

引言

固态发酵（SSF）作为一种有前景且可持续的生物转化技术，已逐渐兴起，用于生产高价值的酶、生物活性化合物和次级代谢产物。该技术利用微生物在几乎无自由水的固体基质上生长，模拟其自然环境，从而实现高效的代谢活性¹。本实验方案的主要目标是通过旋转式固态发酵系统优化酶的生产，该系统可提高基质利用率、氧气扩散效率以及工艺的可扩展性。以小麦麸皮——一种丰富的农业工业副产物——作为基础基质，有助于农业废弃物的高值化利用，并推动循环生物经济实践²。

与液体深层发酵（SmF）相比，固态发酵（SSF）具有显著优势，包括更低的能耗和水耗、更高的产物浓度，以及能够兼容多种廉价的农业废弃物，如麦麸、稻壳和甘蔗渣³。与需要大量水和昂贵营养培养基的SmF不同，SSF系统利用固体基质，这些基质不仅为微生物生长提供表面，还提供微生物活性所必需的营养物质。此外，SSF中游离水含量有限，可显著降低污染风险，使其在工业酶生产中成为更稳健的选择⁴。除了操作上的优势外，SSF相较于液体深层发酵（SmF）还具有显著的环境和经济效益。研究表明，由于无需大量水进行持续搅拌和通气，SSF可减少50%–70%的水耗，并降低30%以上的能源成本。此外，利用农业工业残留物作为底物可显著降低原材料成本，并通过再利用农业副产物促进循环经济实践

方案

本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。

1. 底物制备

注意：使用市售品牌的麦麸，以尽量减少底物特性的显著差异。由于多种因素的影响，每批麦麸的特性均存在差异，使其成为一种难以标准化的异质性材料，导致其组分含量出现波动。如果需要标准化的材料，可选择其他基质，或对每批麦麸进行近似化学分析，并根据需要进行调整。

1. 用无菌蒸馏水清洗麦麸三次，以去除有机物残留、碎屑和灰尘。此步骤还可去除可能干扰发酵的简单糖类。
2. 将清洗后的麦麸铺在铝制托盘上，于60 °C烘箱中干燥24小时。
3. 干燥后，将麦麸放入无菌的50 mL锥形管中。

2. 接种物的制备

注意：本方案描述了三种接种物制备方法：孢子悬浮液、菌丝片直接接种以及细胞悬浮液。需确定初始接种浓度，并定量蛋白质水平以准确计算产量。

1. 孢子悬液的制备
   1. 将一个直径为5 mm、已接种满菌丝的琼脂块转移至新鲜的马铃薯葡萄糖琼脂平板上。在28 °C下培养5–7天，或直至菌丝完全覆盖培养基。某些真菌可能需要更长的培养时间。
   2. 向平板中加入....

结果

图1A展示了本系统中使用的旋转混合器的示意图，该混合器可容纳六个50 mL的锥形管。图2B描述了小麦麸皮在进入固态发酵过程前的调质过程中发生的变化。如图所示，未观察到明显的结构变化。

图2 显示了在此系统中利用商业壳聚糖作为诱导剂，通过Trichoderma harzianum真菌进行固态发酵6天后小麦麸皮的饱和状态。图2A展示了发酵过程前的原始材料。显微照片证实了真菌对底物的利用，这也反映在底物因与真菌相互作用而发生的结构改变，其原有的分形样结构消失。

结果如图3所示，与液体深层发酵（SmF）系统相比，T. harzianum产生的几丁质酶活性（图3A<.......

讨论

本研究概述了一种通过固态发酵（SSF）系统优化酶生产的相关方案，该方案专为丝状真菌设计。下文讨论了该方法的关键环节，以及其重要性、局限性和潜在应用。

该实验方案的成功高度依赖于关键步骤，例如底物和接种物的制备。对麦麸进行适当的清洗和干燥，对于去除可能干扰真菌生长或酶产生的杂质至关重要。此外，仔细调节底物含水量以维持相对湿度在90%以上，可确保真菌的最佳定植与活性¹³。旋转系统以10 rpm运行是另一个关键参数，因为它可促进底物均匀混合和充分供氧，防止底物结块，并确保真菌生长的均一性¹⁴。

本方案的适应性体现在其适用于多种真菌物种和诱导剂。例如，尽管本研究中使用了市售的几丁质和淀粉作为诱导剂，但可根据目标酶的不同，替换为木质素、纤维素或壳聚糖等其他底物。针对底物定植不均等常见问题，可通过优化混合参数或调整接种物浓度来解决²。此外，在底物制备和接种过程中确保无菌操作至关重要，特别是在工业规.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
125 mL 锥形瓶	Sigma-Aldrich	CLS431684	用于在液体培养基中培养菌丝体。
50 mL 离心管	Sigma-Aldrich	CLS430921	用于储存和制备底物及接种物。
乙酸盐缓冲液，pH 5.6	Sigma-Aldrich	320866	用于几丁质酶的提取。
Centricon 滤器	Millipore	UFC905024	用于酶的进一步纯化。
血细胞计数板	Sigma-Aldrich	Z359629	用于在显微镜下计数孢子。
滤纸	Whatman	1001-110	用于过滤酶提取液。
湿度计	Todomicro	-	用于测量底物的相对湿度。
诱导剂（例如，商用几丁质）	Sigma-Aldrich	C9752	用于在发酵过程中增强酶的产生。
磷酸盐缓冲液，pH 6.9	Sigma-Aldrich	P5379	用于淀粉酶的提取。
马铃薯葡萄糖琼脂	Sigma-Aldrich	P2182	用于真菌菌丝体生长的培养基。
马铃薯葡萄糖肉汤	Sigma-Aldrich	P6685	用于真菌菌丝体生长的液体培养基。
旋转混合仪	Thermo-Fisher Scientific	88-861-051	用于在发酵过程中保持底物持续运动。
盐溶液组分（例如，KH2PO4, Na2SO4, KCl 等）	Sigma-Aldrich	多种	用于配制无菌盐溶液，详细配方见实验方案。
麦麸	市售	-	用于固态发酵的底物。