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方法文章

丝状真菌通过固态发酵系统生产聚合物水解胞外酶的设计

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DOI：

10.3791/68296

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2025年6月6日

 ,  ,  ,  , 
1Instituto Politécnico Nacional, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Departamento de Microbiología, Laboratorio de Bioquímica y Biotecnología de Hongos, Carpio y plan de Ayala s/n, Col. Santo Tomás

本文内容

摘要

本方案利用麦麸在旋转式固态发酵系统中提高酶的产量。该底物添加了壳聚糖等诱导剂，在受控条件下促进真菌生长。实验结果表明，与液体深层发酵相比，酶的产量提高了4至6倍，显示出该方法在多种生物技术应用中的适应性和高效性。

摘要

固态发酵（SSF）是一种利用不溶于水相介质的固体基质的生物转化过程。微生物在基质表面生长，并穿透其固相基质以获取生长所需的营养物质。SSF 的特征是游离水含量极低，基质含水量维持在 70% 以上，包含气相、液相和固相三个相互关联的相态。本实验方案描述了在旋转系统中使用农业工业副产物麦麸作为产酶基础基质的方法。通过添加诱导剂（如几丁质、壳聚糖、淀粉或纤维素）以促进水解蛋白的合成。该系统具有高度适应性，可使用不同形态的真菌，包括菌丝体、孢子或菌粒。在所述方法中，诱导剂与基质按 1:100（w/w）的比例混合后进行灭菌 通过 高压灭菌后，用无菌水调节至所需含水量。随后加入真菌接种物，旋转系统以10 rpm运转，以确保充分混合和供氧。系统在中温或嗜热/耐热性真菌的最佳生长条件下培养6–8天，从而提高其适用性。培养完成后，使用适当的冷缓冲液（如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐缓冲液）提取酶，具体选择取决于酶的类型。提取液通过离心和过滤澄清，获得无细胞上清液。根据需要可进一步浓缩或纯化酶。实验结果表明，与液体深层发酵（SmF）相比，酶活性提高了4–6倍，凸显了该系统的高效性。该系统可适应不同底物、诱导物及真菌种类，因而在多种生物技术应用中具有重要价值。

引言

固态发酵（SSF）作为一种有前景且可持续的生物转化技术，已逐渐兴起，用于生产高价值的酶、生物活性化合物和次级代谢产物。该技术利用微生物在几乎无自由水的固体基质上生长，模拟其自然环境，从而实现高效的代谢活性1。本实验方案的主要目标是通过旋转式固态发酵系统优化酶的生产，该系统可提高基质利用率、氧气扩散效率以及工艺的可扩展性。以小麦麸皮——一种丰富的农业工业副产物——作为基础基质，有助于农业废弃物的高值化利用，并推动循环生物经济实践2。

与液体深层发酵（SmF）相比，固态发酵（SSF）具有显著优势，包括更低的能耗和水耗、更高的产物浓度，以及能够兼容多种廉价的农业废弃物，如麦麸、稻壳和甘蔗渣3。与需要大量水和昂贵营养培养基的SmF不同，SSF系统利用固体基质，这些基质不仅为微生物生长提供表面，还提供微生物活性所必需的营养物质。此外，SSF中游离水含量有限，可显著降低污染风险，使其在工业酶生产中成为更稳健的选择4。除了操作上的优势外，SSF相较于液体深层发酵（SmF）还具有显著的环境和经济效益。研究表明，由于无需大量水进行持续搅拌和通气，SSF可减少50%–70%的水耗，并降低30%以上的能源成本。此外，利用农业工业残留物作为底物可显著降低原材料成本，并通过再利用农业副产物促进循环经济实践2,4。

SSF 在其效率和可扩展性方面已得到广泛验证。例如，已有研究报道，与 SmF 相比，使用 SSF 可使酶活性提高 4–6 倍，凸显了该技术在经济和环境方面的优势2,5。此外，下游工艺也得以简化，因为酶的提取通常需要更少的水和更少的纯化步骤。这使得 SSF 对致力于降低运营成本和环境影响的行业尤为具有吸引力6。

本方案所述的旋转式固态发酵（SSF）系统相较于传统的静态SSF方法具有多项改进。尽管静态系统常面临底物定植不均和氧气供应受限等挑战，旋转式设计可实现充分的混合与通气，促进微生物均匀生长7,8,9。例如，该系统已成功用于利用Aspergillus和Trichoderma等真菌产生水解酶，如几丁质酶、淀粉酶和蛋白酶2。

该SSF系统的一个关键特征是其适应性。以麦麸作为基础底物，展示了农业工业废弃物在低成本生物转化中的潜力3。此外，通过在底物中添加几丁质、壳聚糖和淀粉等诱导剂，可进一步刺激特定的代谢途径，从而增强酶的合成2,10。该系统还可兼容不同的真菌形态，包括孢子、菌丝和菌球，使用户能够根据具体需求定制工艺流程2。

固态发酵在食品生物技术、生物燃料生产和环境修复等多个领域具有广泛的应用前景11。其通过结合低成本底物、极高的酶产量以及高度灵活的工艺，使固态发酵成为实现工业化规模生物技术创新的关键方法。

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方案

本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。

1. 底物制备

注意：使用市售品牌的麦麸，以尽量减少底物特性的显著差异。由于多种因素的影响，每批麦麸的特性均存在差异，使其成为一种难以标准化的异质性材料，导致其组分含量出现波动。如果需要标准化的材料，可选择其他基质，或对每批麦麸进行近似化学分析，并根据需要进行调整。

  1. 用无菌蒸馏水清洗麦麸三次，以去除有机物残留、碎屑和灰尘。此步骤还可去除可能干扰发酵的简单糖类。
  2. 将清洗后的麦麸铺在铝制托盘上，于60 °C烘箱中干燥24小时。
  3. 干燥后，将麦麸放入无菌的50 mL锥形管中。

2. 接种物的制备

注意：本方案描述了三种接种物制备方法：孢子悬浮液、菌丝片直接接种以及细胞悬浮液。需确定初始接种浓度，并定量蛋白质水平以准确计算产量。

  1. 孢子悬液的制备
    1. 将一个直径为5 mm、已接种满菌丝的琼脂块转移至新鲜的马铃薯葡萄糖琼脂平板上。在28 °C下培养5–7天，或直至菌丝完全覆盖培养基。某些真菌可能需要更长的培养时间。
    2. 向平板中加入5 mL无菌蒸馏水，使用无菌接种环机械性地刮下孢子。
    3. 将孢子悬液进行1:100稀释。取10 µL稀释液滴加至血球计数板中央，在显微镜下计数孢子。根据计数板的校正系数和稀释倍数计算孢子浓度（孢子/mL）。
  2. 液体培养基中菌丝体的培养
    1. 将一个直径为5 mm、已接种满菌丝的琼脂块转移至新鲜的马铃薯葡萄糖琼脂平板上，在28 °C下培养至菌丝长满。
    2. 在无菌的125 mL三角瓶中加入25 mL马铃薯葡萄糖液体培养基，并进行高压灭菌。
    3. 从已长满菌丝的平板上取一个直径为5 mm的菌丝块，转移至无菌液体培养基中。
    4. 将三角瓶置于摇床中，在125 rpm条件下振荡培养24–48小时，具体时间根据真菌菌株而定。对于生长缓慢的真菌，可适当延长培养时间。
    5. 取2 mL培养物用于接种，另取2 mL用于干重测定。
  3. 菌丝块的直接接种
    1. 将一个直径为5 mm、已接种满菌丝的琼脂块放置于新鲜的马铃薯葡萄糖琼脂平板上，在28 °C下培养至菌丝长满。
    2. 取一个菌丝块作为接种物，另一个用于干重测定。

3. 固态发酵系统的准备

注意：诱导剂可以是天然的或商业化的。建议使用经过纯化的商业诱导剂，以尽量减少可能影响发酵效率的杂质。调整加水量，以维持至少90%的相对湿度。

  1. 在无菌的 50 mL 锥形管中加入以下组分：5 g 干小麦麸；0.2 g 诱导剂（例如市售壳聚糖）；5.5 mL 水（根据诱导剂的吸水能力进行调整）；5 mL 无菌盐溶液，其中包含 16 g/L 磷酸二氢钾、4 g/L 硫酸钠、2 g/L 氯化钾、1 g/L 氯化钙、400 mg/L 氯化锌、60 mg/L 硼酸、40 mg/L 钼酸钠、150 mg/L 氯化镁、100 mg/L 三氯化铁和 400 mg/L 硫酸铜。
  2. 使用基于电极的湿度计测量相对湿度，确保湿度不低于 90%。将电极探头直接插入反应器内不同深度，以获得具有代表性的水分分布测量值。
    1. 若湿度低于 90%，请按以下步骤调节：
      1. 每 10 g 基质逐步添加 1 mL 无菌蒸馏水。每次添加后充分混匀，以确保水分均匀分布。
      2. 让基质平衡 10–15 分钟，重新测量湿度水平。
      3. 重复上述步骤，直至达到 90% 的目标湿度。整个过程中避免过度湿润基质。
    2. 若湿度高于 90%，请按以下步骤调节：
      1. 在无菌环境中将基质薄层铺开。通过以下方式去除多余水分：(1) 将基质暴露于层流气流中，或 (2) 将其置于 30 °C 干燥室中 10–15 分钟。
      2. 或者，可轻轻搅拌基质以促进水分均匀再分布。处理后重新评估湿度水平。
      3. 根据需要重复干燥或搅拌步骤，直至湿度降至 90%。仅在达到目标湿度后方可进行发酵。
  3. 在 15 psi 条件下对锥形管进行 15 分钟高压灭菌。
  4. 冷却后，使用以下任一方式接种基质：1 mL 孢子悬液（1 × 106–1 × 107 个孢子/mL）、2 mL 细胞悬液，或一个直径 5 mm 的菌丝体圆片。

4. 固态发酵（SSF）操作步骤

注意：对于不同时间点的动力学研究或参数评估，应为每个时间点分别准备试管，以确保代表性。

  1. 为防止底物结块，以最大转速涡旋振荡试管，每次1分钟，共5个循环。
  2. 将试管置于水平轴旋转混合仪中，确保底物在试管内自由移动。将混合仪转速设为10 rpm。
  3. 将混合仪放入培养箱中，在微生物最适生长温度下进行孵育。若使用热敏感诱导剂，则应维持文献报道的最适酶活性温度。

5. 酶的提取

注意：提取的基本原理基于胞外酶的溶解度及其最适pH活性。由于固态发酵（SSF）避免了水相介质，胞外酶存在于固体基质周围的水环境中，这意味着其浓度高于液体深层发酵（SmF）。在此背景下，最佳提取缓冲液的选择取决于对目标酶活性的了解。提取过程的优化则依赖于最终酶的浓度以及所用提取缓冲液的类型。

  1. 在完成所需的发酵时间后，将底物重悬于20 mL预冷的缓冲液中。示例包括：用于几丁质酶提取的0.1 M乙酸盐缓冲液（pH 5.6）；用于淀粉酶提取的0.02 M磷酸盐缓冲液（pH 6.9）。
  2. 以涡旋混合器进行循环操作：最高速度涡旋1分钟，随后置于冰上1分钟，重复10次。
  3. 使用滤纸过滤悬浮液，并通过加压机械提取上清液。
  4. 通过在 3000 x g 条件下离心澄清上清液 g 4 °C下离心15分钟。
  5. 直接使用粗提物，或对酶进行进一步纯化 通过 柱层析或离心过滤。还建议进行动力学研究，以确定米氏常数（Km）和酶促反应的最大速率（Vmax）12.

6. 优化过程

注意：通过评估和调整诱导剂的质量与浓度，以及接种物的类型和浓度，来优化本实验方案。

  1. 确定最佳发酵时间，并优化提取步骤以提高效率。
  2. 控制并精细调节环境条件，包括温度、pH 和通气。
  3. 测试不同缓冲液及提取条件，以提高酶的产率和稳定性。
  4. 进行统计分析（如响应面法），以确定最具影响的变量，实现酶的最优生产。

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结果

图1A展示了本系统中使用的旋转混合器的示意图，该混合器可容纳六个50 mL的锥形管。图2B描述了小麦麸皮在进入固态发酵过程前的调质过程中发生的变化。如图所示，未观察到明显的结构变化。

图2 显示了在此系统中利用商业壳聚糖作为诱导剂，通过Trichoderma harzianum真菌进行固态发酵6天后小麦麸皮的饱和状态。图2A展示了发酵过程前的原始材料。显微照片证实了真菌对底物的利用，这也反映在底物因与真菌相互作用而发生的结构改变，其原有的分形样结构消失。

结果如图3所示，与液体深层发酵（SmF）系统相比，T. harzianum产生的几丁质酶活性（图3A<...

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讨论

本研究概述了一种通过固态发酵（SSF）系统优化酶生产的相关方案，该方案专为丝状真菌设计。下文讨论了该方法的关键环节，以及其重要性、局限性和潜在应用。

该实验方案的成功高度依赖于关键步骤，例如底物和接种物的制备。对麦麸进行适当的清洗和干燥，对于去除可能干扰真菌生长或酶产生的杂质至关重要。此外，仔细调节底物含水量以维持相对湿度在90%以上，可确保真菌的最佳定植与活性13。旋转系统以10 rpm运行是另一个关键参数，因为它可促进底物均匀混合和充分供氧，防止底物结块，并确保真菌生长的均一性14。

本方案的适应性体现在其适用于多种真菌物种和诱导剂。例如，尽管本研究中使用了市售的几丁质和淀粉作为诱导剂，但可根据目标酶的不同，替换为木质素、纤维素或壳聚糖等其他底物。针对底物定植不均等常见问题，可通过优化混合参数或调整接种物浓度来解决2。此外，在底物制备和接种过程中确保无菌操作至关重要，特别是在工业规...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本工作由墨西哥国立理工学院研究与研究生事务秘书处（Secretaría de Investigación y Posgrado del Instituto Politécnico Nacional，SIP-IPN）资助，项目编号分别为授予GGS的20220487、20230676、20240793和20251269，以及授予DROH的20220492、20230427、20240335和20251139。作者谨向ENCB-IPN、墨西哥科学、人文、技术与创新秘书处（Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación de México，Secihti，前身为国家科学、人文与技术委员会CONAHCyT）、BEIFI项目以及墨西哥国立理工学院纳米科学与微纳技术中心（Centro de Nanociencias y Micro y Nanotecnologías del Instituto Politécnico Nacional）提供的宝贵支持表示感谢。López-García感谢Secihti（原CONAHCyT）提供的硕士奖学金，以及IPN提供的SIP-BEIFI奖学金。Legorreta-Castañeda是该机构资助的博士后奖学金获得者 "墨西哥博士后驻留项目" Secihti 项目，此前称为 CONAHCyT。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
125 mL 锥形瓶Sigma-AldrichCLS431684用于在液体培养基中培养菌丝体。
50 mL 离心管Sigma-AldrichCLS430921用于储存和制备底物及接种物。
乙酸盐缓冲液，pH 5.6Sigma-Aldrich320866用于几丁质酶的提取。
Centricon 滤器MilliporeUFC905024用于酶的进一步纯化。
血细胞计数板Sigma-AldrichZ359629用于在显微镜下计数孢子。
滤纸Whatman1001-110用于过滤酶提取液。
湿度计Todomicro-用于测量底物的相对湿度。
诱导剂（例如，商用几丁质）Sigma-AldrichC9752用于在发酵过程中增强酶的产生。
磷酸盐缓冲液，pH 6.9Sigma-AldrichP5379用于淀粉酶的提取。
马铃薯葡萄糖琼脂Sigma-AldrichP2182用于真菌菌丝体生长的培养基。
马铃薯葡萄糖肉汤Sigma-AldrichP6685用于真菌菌丝体生长的液体培养基。
旋转混合仪Thermo-Fisher Scientific88-861-051用于在发酵过程中保持底物持续运动。
盐溶液组分（例如，KH2PO4, Na2SO4, KCl 等）Sigma-Aldrich多种用于配制无菌盐溶液，详细配方见实验方案。
麦麸市售 -用于固态发酵的底物。

参考文献

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