评估镉对海胆Paracentrotus lividus氧化还原状态及代谢谱的影响

摘要

本方案重点介绍了从海胆Paracentrotus lividus（棘皮动物）中提取和表征生物活性化合物的方法，以及在镉暴露后氧化应激参数的测定。

摘要

镉（Cd）是对水生生物最有害的重金属之一，也是海洋生物群中广泛存在的污染物。由于其高生物可利用性、持久性以及生物累积能力，这种由矿山径流、工业排放和农业投入所释放的有毒重金属，已成为对水生生物最具危害性的污染物之一，并在海洋生物群中普遍存在。本研究评估了镉在不同浓度（0.0183、0.183 和 1.83 mg/L）下暴露 96 小时后，对紫海胆（Paracentrotus lividus）性腺中氧化应激生物标志物和代谢物谱的潜在毒性效应。结果显示，与对照组相比，镉通过提高丙二醛、过氧化氢和脂质氢过氧化物水平诱导了氧化应激，同时增强了抗氧化酶活性（还原型谷胱甘肽和过氧化氢酶）。此外，基于气相色谱-质谱分析，在处理组海胆和对照组海胆的性腺提取物中共鉴定出 74 种代谢物。偏最小二乘判别分析显示了明显的分类分离，并通过 VIP 评分鉴定了九种关键代谢物。热图分析进一步揭示了甾醇和脂肪酸类化合物（如胆甾-5-烯-3-醇(3β)-、去饱和胆固醇、(23S)-乙基胆甾-5-烯-3β-醇以及二十碳五烯酸（EPA））水平的扰动，以及视黄酸等抗氧化防御物质和孕-5-烯-20-酮,3-羟基-(3β)等类固醇调控物质的变化。总体而言，我们的数据表明，即使在相对较低浓度下，性腺对镉也表现出高度敏感性。

引言

海洋环境也可被视为多种有毒化学物质（如重金属）的重要汇。由于这些元素具有亲脂性，容易与悬浮颗粒物结合，并逐渐在海洋沉积物中累积，在沉积物中其迁移性和生物可利用性降低。因此，海洋沉积物是重金属的主要归宿¹。 在这些污染物中，镉（Cd）长期以来被认为是威胁生态系统及其相关生物群的主要全球性水污染物之一²。水生生态系统中约三分之一的镉来源于磷肥的生产和使用²。其他向环境中释放镉的来源包括采矿业、电镀行业以及地壳的自然过程³。由于镉易于通过水介质迁移，且与其他重金属相比具有较高的迁移能力，因此其分布极为广泛²。根据文献报道，波罗的海中镉的浓度在12至16 × 10⁻³ µg/L之间⁴，而在伊比利亚半岛西北部加利西亚沿岸严重污染区域，其浓度介于13.4 × 10⁻³ 至1.49 µg/L之间⁵。在地中海一些污染区域记录到更高浓度的镉，例如在西西里岛（意大利）附近海域浓度可达80.4 × 10^-3 µg/L⁶，而在突尼斯的加贝斯湾浓度甚至达到48 µg/L

方案

1. 样品与实验设计

1. 2023年5月，由潜水员在突尼斯比塞大海岸（地中海，突尼斯）水深5-7米处采集共计40只成年紫海胆（P. lividus）样本（20只雄性与20只雌性，平均体长：45 ± 4 mm，平均年龄：2.0 ± 0.5年，平均体重：22.54 ± 2.50 g）。
2. 将采集的混合性别紫海胆（P. lividus）运回实验室，根据体型估算其年龄约为12-18个月，并在16 ± 1 °C、自然盐度约38 PSU、pH值为7.8-8.0、光周期为12:12的充气天然海水中饲养。在整个暴露期间每日监测环境参数，以确保环境稳定并尽量减少外部变量干扰。
3. 向围口区注射1 mL 0.5 M KCl溶液以诱导排精或排卵，并通过肉眼观察配子释放情况。用过滤海水冲洗个体后，在无食物供给的受控条件下驯养3天。
4. 将紫海胆随机分为四组，每组9只个体（每只水族箱3只，设三个重复），分别置于50 L玻璃水族箱中。样本量的确定依据先前已发表的研究^23,24 ，这些研究评估了海洋无脊椎动物中的氧化应激生物标志物和代谢组学响应，并采用了相似或更少的生物学重复数。
   注：该重复水平可确保较强的生物学代表性及统计学显著性结果。
5. 在完成驯养后，将动物暴露....

结果

通过使用生物学重复和技术重复，确保了本方法的有效性和可靠性，从而实现了稳定且可重复的测量结果。各项检测表现出较低的变异性，标准偏差通常小于10%，表明具有高度的可重复性。为确保代谢物定量的准确性，气相色谱-质谱（GC-MS）分析中包含了校准曲线和内标物。所采用的全部技术均基于广泛认可的实验方案，这些方案此前已在海洋生态毒理学和环境代谢组学研究中得到验证，如论文中所述。

生物标志物反应
结果表明，与对照组相比，暴露于镉的P. lividus性腺中的GSH水平在所有处理组（Tr1、Tr2和Tr3）中均显著升高（p < 0.05）（图 1）。

讨论

本研究旨在通过分析生化生物标志物和活性代谢物，评估镉（Cd）对中国海胆 P. lividus 性腺的毒性作用。P. lividus 暴露于不同浓度的镉后，产生了氧化应激反应。这些结果与先前的研究报告相似，表明海胆栖息地中抗氧化水平的升高与污染物浓度之间存在密切关联¹³。

我们的结果表明，在暴露于不同浓度的 Tr1、Tr2 和 Tr3 后，GSH 水平显著升高（图 1A）。我们的研究结果与 Telahigue 等人²³ 关于汞暴露对海参 Holothuria forskali 影响的研究结果一致。已知 GSH 是一种主要的非蛋白巯基化合物，在半胱氨酸的储存和转运中具有重要作用，同时在细胞防御自由基和过氧化物方面也发挥着关键作用²³。GSH 既可以与活性氧（ROS）直接反应，也可作.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
冷冻干燥机	Biobase	BK-FD12PT 冷冻干燥机	冻干
气相色谱仪	Agilent Technologies	HP 6890 气相色谱仪	火焰离子化检测器（FID）
气相色谱柱	Agilent Technologies	HP-5 (5%-苯基)-甲基硅氧烷柱	非极性 色谱柱 ，在多种应用中表现出优异性能
质谱仪	Agilent Technologies	HP 5973 质谱仪	四极杆 质谱