评估镉对海胆Paracentrotus lividus氧化还原状态及代谢谱的影响

摘要

本方案重点介绍了从海胆Paracentrotus lividus（棘皮动物）中提取和表征生物活性化合物的方法，以及在镉暴露后氧化应激参数的测定。

摘要

镉（Cd）是对水生生物最有害的重金属之一，也是海洋生物群中广泛存在的污染物。由于其高生物可利用性、持久性以及生物累积能力，这种由矿山径流、工业排放和农业投入所释放的有毒重金属，已成为对水生生物最具危害性的污染物之一，并在海洋生物群中普遍存在。本研究评估了镉在不同浓度（0.0183、0.183 和 1.83 mg/L）下暴露 96 小时后，对紫海胆（Paracentrotus lividus）性腺中氧化应激生物标志物和代谢物谱的潜在毒性效应。结果显示，与对照组相比，镉通过提高丙二醛、过氧化氢和脂质氢过氧化物水平诱导了氧化应激，同时增强了抗氧化酶活性（还原型谷胱甘肽和过氧化氢酶）。此外，基于气相色谱-质谱分析，在处理组海胆和对照组海胆的性腺提取物中共鉴定出 74 种代谢物。偏最小二乘判别分析显示了明显的分类分离，并通过 VIP 评分鉴定了九种关键代谢物。热图分析进一步揭示了甾醇和脂肪酸类化合物（如胆甾-5-烯-3-醇(3β)-、去饱和胆固醇、(23S)-乙基胆甾-5-烯-3β-醇以及二十碳五烯酸（EPA））水平的扰动，以及视黄酸等抗氧化防御物质和孕-5-烯-20-酮,3-羟基-(3β)等类固醇调控物质的变化。总体而言，我们的数据表明，即使在相对较低浓度下，性腺对镉也表现出高度敏感性。

引言

海洋环境也可被视为多种有毒化学物质（如重金属）的重要汇。由于这些元素具有亲脂性，容易与悬浮颗粒物结合，并逐渐在海洋沉积物中累积，在沉积物中其迁移性和生物可利用性降低。因此，海洋沉积物是重金属的主要归宿¹。 在这些污染物中，镉（Cd）长期以来被认为是威胁生态系统及其相关生物群的主要全球性水污染物之一²。水生生态系统中约三分之一的镉来源于磷肥的生产和使用²。其他向环境中释放镉的来源包括采矿业、电镀行业以及地壳的自然过程³。由于镉易于通过水介质迁移，且与其他重金属相比具有较高的迁移能力，因此其分布极为广泛²。根据文献报道，波罗的海中镉的浓度在12至16 × 10⁻³ µg/L之间⁴，而在伊比利亚半岛西北部加利西亚沿岸严重污染区域，其浓度介于13.4 × 10⁻³ 至1.49 µg/L之间⁵。在地中海一些污染区域记录到更高浓度的镉，例如在西西里岛（意大利）附近海域浓度可达80.4 × 10^-3 µg/L⁶，而在突尼斯的加贝斯湾浓度甚至达到48 µg/L⁷。这种持久性、可生物累积且非必需的过渡金属因其对人类和水生生物造成严重健康危害的能力而受到关注⁸。镉可通过与蛋白质结合、抑制酶活性以及干扰钙稳态而直接发挥毒性作用⁹。它也可通过产生活性氧（ROS）间接发挥作用，导致脂质、蛋白质和DNA等生物分子发生氧化损伤¹⁰。多项科学研究表明，镉污染可能引发水生生物的结构和功能紊乱¹¹。

与其他海洋底栖无脊椎动物一样，海胆特别容易受到海洋污染的影响。尽管海胆具有积累高水平重金属的能力，但它们仍能耐受金属污染，并在受污染的环境中生存¹²。因此，海胆被普遍认为是指示生物，广泛用作生态毒理学和环境研究的模型¹³。已有大量研究探讨了镉（Cd）暴露对不同生活阶段的多种海胆物种的影响，包括成体、胚胎和幼虫¹³。研究发现，镉暴露可能导致多种不良效应，从卵子受精率降低、胚胎和幼虫发育异常、氧化应激，到细胞凋亡和自噬¹³。目前大多数文献集中在镉对海胆发育中胚胎的影响^13,14；然而，仅有少数研究¹⁵致力于探究该金属对成体海胆代谢谱的影响，且目前尚无关于脂质代谢的相关信息。

持续暴露于亚急性/亚致死浓度的镉环境中会导致Paracentrotus lividus（Lamarck, 1816） 胚胎发育异常，表现为骨骼伸长和模式形成缺陷，同时伴随总体蛋白质合成减少以及金属硫蛋白表达的差异性变化¹⁶。

该方法通过将生化检测与基于气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）的靶向和非靶向代谢组学分析相结合，改进了对海洋生物中镉（Cd）毒性和氧化应激的评估。与传统方法仅依赖单一生物标志物（如脂质过氧化或抗氧化酶活性，例如 SOD、CAT）相比，基于 GC-MS 的代谢物筛查可提供生物体生理状态的全面生化指纹图谱¹⁷。这种整合方法能够更灵敏、更系统地检测亚致死效应，即使在低浓度 Cd 暴露下也能识别出能量代谢、氨基酸周转及氧化通路的早期扰动，而这些变化往往发生在可观察到的毒理学损伤之前。尤为重要的是，该方法通过提供更高分辨率的数据，补充了现有的毒理学评估手段，并有助于发现传统检测方法可能遗漏的新生物标志物¹⁸。此外，通过通路水平的分析，该方法促进了对毒性机制的理解，从而增强了预测性生态毒理学模型的准确性¹⁹。本方法可检测 1–100 µg/L 范围内的镉暴露水平，适用于受污染的近岸和河口系统²⁰。该方法最适用于受控的实验室暴露实验或中等复杂程度的野外研究。然而，在高度污染的环境中，多种胁迫因子（如重金属、多环芳烃、新兴污染物）可能相互作用，干扰生物标志物的特异性，从而增加结果解读的难度。尽管如此，若实验设计得当，GC-MS 所具备的高稳健性和特异性，结合多变量数据分析方法（如 PCA、PLS-DA），仍能提供强大的分辨能力，以解析重叠的生物学效应。

这种整合的生化-代谢组学平台在哨兵物种监测和生态风险评估中尤为有用，适用于《海洋战略框架指令》（MSFD）等框架，并且与当前推进基于组学的环境监测工作的努力相一致²¹。

在本研究中，我们采用紫海胆P. lividus，该物种是大西洋和地中海沿岸最具经济价值且被广泛利用的物种之一²²，以评估镉污染对其性腺氧化还原状态及代谢组学特征的影响。

方案

1. 样品与实验设计

1. 2023年5月，由潜水员在突尼斯比塞大海岸（地中海，突尼斯）水深5-7米处采集共计40只成年紫海胆（P. lividus）样本（20只雄性与20只雌性，平均体长：45 ± 4 mm，平均年龄：2.0 ± 0.5年，平均体重：22.54 ± 2.50 g）。
2. 将采集的混合性别紫海胆（P. lividus）运回实验室，根据体型估算其年龄约为12-18个月，并在16 ± 1 °C、自然盐度约38 PSU、pH值为7.8-8.0、光周期为12:12的充气天然海水中饲养。在整个暴露期间每日监测环境参数，以确保环境稳定并尽量减少外部变量干扰。
3. 向围口区注射1 mL 0.5 M KCl溶液以诱导排精或排卵，并通过肉眼观察配子释放情况。用过滤海水冲洗个体后，在无食物供给的受控条件下驯养3天。
4. 将紫海胆随机分为四组，每组9只个体（每只水族箱3只，设三个重复），分别置于50 L玻璃水族箱中。样本量的确定依据先前已发表的研究^23,24 ，这些研究评估了海洋无脊椎动物中的氧化应激生物标志物和代谢组学响应，并采用了相似或更少的生物学重复数。
   注：该重复水平可确保较强的生物学代表性及统计学显著性结果。
5. 在完成驯养后，将动物暴露于不同浓度的氯化镉（CdCl₂）中，持续96小时，具体分组如下：第一组（对照组，Ctrl）：紫海胆饲养于不含CdCl₂的海水中；第二组（处理组1，Tr1）：紫海胆暴露于0.0183 mg/L CdCl₂浓度中；第三组（处理组2，Tr2）：紫海胆暴露于0.183 mg/L CdCl₂浓度中；第四组（处理组3，Tr3）：紫海胆暴露于1.83 mg/L CdCl₂浓度中。
6. 为维持实验期间水体的稳定性，每隔24小时更换50%的水体，使用虹吸法小心移除旧水，并补充新配制的含相应CdCl₂浓度的海水，以保持处理浓度恒定。

2. 组织制备

1. 按照 Telahigue 等人²³ 描述的方案，制备海胆组织匀浆。
2. 实验结束后，在冰上解剖各组海胆。使用无菌剪刀在口部周围进行环形切割以打开壳体。
3. 用刮勺小心取出五个生殖腺并保留用于进一步分析。用冷蒸馏水冲洗以去除碎屑和表面污染物。
4. 在低温条件下，将300 mg生殖腺组织片段与Tris-HCl缓冲液（20 mM，pH 7.4）混合，使用探头式超声波破碎仪以40%振幅进行3次10秒的脉冲处理，每次脉冲间隔20秒，进行匀浆。
5. 将每个生殖腺样品分为两部分：一部分用于生化分析（新鲜样品），另一部分用于代谢组学分析（冻干样品）。
6. 在10,000 × g 条件下离心20分钟。将上清液储存于-80 °C，用于生化参数分析。
7. 在进行GC-MS分析前，使用冷冻干燥机对其他生殖腺样品进行冻干处理。在真空度低于0.1 mbar的条件下，于-50 °C维持48小时，直至完全干燥。
8. 采用Lowry法测定各样品的总蛋白含量，以BSA作为标准品。在560 nm处测定LOOH水平，并以mmol/mg蛋白表示。
   注意：此定量步骤在所有生化检测之前完成，用于标准化生物标志物水平。

3. 还原型谷胱甘肽检测

1. 根据Ellman方法²⁵测定还原型谷胱甘肽（GSH）含量，该方法基于谷胱甘肽的巯基（SH）还原5,5'-二硫代双-2-硝基苯甲酸（DTNB）生成2-硝基-5-巯基苯甲酸，通过测定其吸光度进行定量。
2. 将组织匀浆液与磷酸盐缓冲液和磺基水杨酸（4%）的混合物在1600 × g 条件下离心15分钟。
3. 取500 µL上清液，加入0.025 mL Ellman试剂（DNTB），测定反应混合物在412 nm处的吸光度。
4. 以每克组织含GSH毫克数（mg/g组织）计算GSH含量，并以每毫克组织含GSH微克数（µg/mg组织）表示总GSH含量。根据已知浓度的还原型谷胱甘肽绘制的标准曲线计算GSH水平。
   注意：本实验旨在测定镉暴露后性腺匀浆中还原型谷胱甘肽（GSH）的含量，作为氧化应激的标志物。

4. 过氧化氢酶活性

1. 按照Aebi的方法进行反应体系的配制²⁶. 准备反应体系，包含2.9 mL 100 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.4）和20 µL性腺组织上清液。将反应体系预先平衡至室温。
2. 通过加入80 µL新配制的0.5 M过氧化氢（H₂O₂）启动反应₂O₂将溶液加入比色皿中。立即充分混匀，使用紫外-可见分光光度计在240 nm处以10秒为间隔记录1分钟内吸光度的下降情况。
3. 根据 H₂O₂ 消耗速率计算 CAT 活性₂O₂ 分解，通过监测240 nm处随时间变化的吸光度下降来确定。使用以下公式：CAT活性 = (ΔA/min × V) / (ε × l × C)
   其中：ΔA/min = 240 nm 处每分钟吸光度的变化值，V = 反应总体积（单位为 L），ε = H 的摩尔消光系数₂O₂(43.6 M^-1/cm），l = 比色皿光程（通常为 1 cm），C = 蛋白质浓度（单位：mg/mL）。
4. 使用摩尔消光系数 43.6 M/cm。将 CAT 活性表示为 nmol H₂O₂ 每分钟每毫克蛋白质分解的纳米摩尔数（nmol H₂O₂/分钟/毫克蛋白质
   注意：目的是定量测定性腺匀浆中的过氧化氢酶活性 P. lividus 作为衡量抗氧化酶对镉暴露反应的指标。

5. 过氧化氢生成量的测定

1. 根据Ou和Wolff所述方法²⁷，采用亚铁氧化-二甲酚橙法测定P. lividus性腺中的过氧化氢（H₂O₂）水平。
2. 使用分光光度计在560 nm处测定上清液中H₂O₂的浓度，结果以每毫克蛋白质的nmol表示。

6. 丙二醛检测

1. 按照 Draper 和 Hadley 方法所述制备样品²⁸。将 500 µL 性腺匀浆液与 1 mL 10% 三氯乙酸（TCA）混合。在 4 °C 条件下，以 2500 x g 离心 10 分钟。
2. 取 1 mL 上清液转移至新试管中，加入 1 mL 0.67% 硫代巴比妥酸（TBA）溶液。将混合物置于 100 °C 水浴中孵育 15 分钟。
3. 将样品冷却至室温。使用分光光度计在 532 nm 处测定吸光度。
4. 使用试剂空白（不含组织提取物的 TBA + TCA）扣除背景吸光度。利用 1,1,3,3-四乙氧基丙烷（TEP）绘制标准曲线，并将 MDA 浓度表示为 nmol/mg 蛋白质。

7. 脂质氢过氧化物测定

1. 采用Jiang等²⁹所述的二甲酚橙铁氧化法测定性腺组织中的脂质氢过氧化物（LOOH）。
   注：目的是通过定量丙二醛（MDA）——氧化性膜损伤的副产物——来评估性腺组织中的脂质过氧化水平。

8. 性腺中生物活性化合物的提取与分析筛选

1. 将各组干燥的性腺组织中的亲脂性化合物进行甲醇提取，每组重复三次。具体操作为：将组织材料置于分析纯甲醇（≥99.8%；1:25 w/v）中，在150转/分钟的旋转摇床上于室温下浸泡提取。
2. 将甲醇提取液在40 °C水浴、转速100 rpm条件下通过旋转蒸发除去溶剂后，于700 × g、4 °C离心15分钟。将粗提物重新悬浮于1 mL甲醇（MeOH）中，密封后于4 °C保存。

9. 性腺提取物的气相色谱-质谱分析

1. 使用已储存的甲醇提取物，在样品瓶中制备500 µL的等分试样。
2. 采用与质谱仪联用的气相色谱仪进行气相色谱-质谱（GC-MS）分析。所用气相色谱柱为5%苯基-甲基聚硅氧烷：30 m × 0.25 mm × 0.25 µm 膜厚。
3. 以氦气为载气，恒定流速为1 mL/min。进样体积设为1 µL，分流模式下分流比为100:1。程序升温设置为从4°C升至280°C，升温速率为5°C/min。
4. 质谱仪采用电子轰击（EI）电离模式，电离能量为72 eV，离子源温度为250°C，扫描时间为1 s，质量扫描范围为45–550 amu。
5. 通过将各化合物的质谱图与NIST98MS谱库和Willy Library275数据库中的质谱图进行比对，完成化合物的鉴定。

10. 统计分析

1. 首先使用Shapiro-Wilk检验评估数据集的正态性，并使用Levene检验评估方差齐性。
2. 使用MetaboAnalyst 6.0³⁰对数据进行预处理，采用标准归一化方法、对数转换和Pareto缩放，以满足方差分析（ANOVA）的假设条件，如正态分布和方差齐性。
3. 使用MetaboAnalyst进行多变量统计分析，采用Benjamini-Hochberg错误发现率（FDR）方法进行多重检验校正，以校正因大量生化比较而产生的Ⅰ类错误，确保统计结果的稳健性。
4. 采用单因素方差分析（ANOVA）比较组间差异。当p <0.05时，认为均值之间的差异具有统计学意义。
5. 使用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）对相似组别进行区分，并计算所有化合物在投影中的变量重要性（VIP）值。
6. 对标准化变量采用配对样本t检验进行单维统计分析，并计算p值。

结果

通过使用生物学重复和技术重复，确保了本方法的有效性和可靠性，从而实现了稳定且可重复的测量结果。各项检测表现出较低的变异性，标准偏差通常小于10%，表明具有高度的可重复性。为确保代谢物定量的准确性，气相色谱-质谱（GC-MS）分析中包含了校准曲线和内标物。所采用的全部技术均基于广泛认可的实验方案，这些方案此前已在海洋生态毒理学和环境代谢组学研究中得到验证，如论文中所述。

生物标志物反应
结果表明，与对照组相比，暴露于镉的P. lividus性腺中的GSH水平在所有处理组（Tr1、Tr2和Tr3）中均显著升高（p < 0.05）（图 1）。

讨论

本研究旨在通过分析生化生物标志物和活性代谢物，评估镉（Cd）对中国海胆 P. lividus 性腺的毒性作用。P. lividus 暴露于不同浓度的镉后，产生了氧化应激反应。这些结果与先前的研究报告相似，表明海胆栖息地中抗氧化水平的升高与污染物浓度之间存在密切关联¹³。

我们的结果表明，在暴露于不同浓度的 Tr1、Tr2 和 Tr3 后，GSH 水平显著升高（图 1A）。我们的研究结果与 Telahigue 等人²³ 关于汞暴露对海参 Holothuria forskali 影响的研究结果一致。已知 GSH 是一种主要的非蛋白巯基化合物，在半胱氨酸的储存和转运中具有重要作用，同时在细胞防御自由基和过氧化物方面也发挥着关键作用²³。GSH 既可以与活性氧（ROS）直接反应，也可作...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
冷冻干燥机	Biobase	BK-FD12PT 冷冻干燥机	冻干
气相色谱仪	Agilent Technologies	HP 6890 气相色谱仪	火焰离子化检测器（FID）
气相色谱柱	Agilent Technologies	HP-5 (5%-苯基)-甲基硅氧烷柱	非极性 色谱柱 ，在多种应用中表现出优异性能
质谱仪	Agilent Technologies	HP 5973 质谱仪	四极杆 质谱