方法文章

结膜活检与直接免疫荧光技术用于诊断黏膜类天疱疮

DOI：

10.3791/68303

⸱

2025年6月17日

 ,  , 
1Prof. Krothapalli Ravindranath Ophthalmic Research Biorepository, LV Prasad Eye Institute, 2Brien Holden Centre for Eye Research (BHERC), LV Prasad Eye Institute

本文内容

摘要

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本文介绍了一种采集和处理结膜活检样本以鉴定黏膜类天疱疮的实验方案。

摘要

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眼黏膜类天疱疮（MMP）表现为慢性瘢痕性结膜炎，若不及时治疗，可导致失明。及时诊断并进行免疫抑制治疗可防止疾病进展。对结膜活检组织进行直接免疫荧光染色（DIF），检测基底膜区免疫复合物沉积，是诊断MMP的依据。活检阳性率取决于活检特征、双眼受累情况、高龄及疾病活动性。本文详细描述了获取结膜活检标本的技术，以及使用预填充低温恒温切割介质（OCT）的 cartridges 进行样本转运和组织包埋的方法。活检应取自双眼未瘢痕化、未受累或相对受累较轻的结膜区域。常规活检标本大小为长4–5 mm、宽2–3 mm，并应包含少量下方的结膜下组织，以确保不遗漏基底膜。我们建议进行过碘酸-希夫（PAS）染色以确认基底膜的存在。按照特定方案，将活检组织的冷冻切片用荧光标记的抗体IgG、IgM、IgA以及补体成分C3c和C4c进行染色。阳性活检表现为基底膜处出现绿色荧光信号，只要其中一种抗体呈阳性，即可判定为MMP阳性。阴性活检结果不能排除类天疱疮，但阳性结果可确诊MMP，并将其与药物诱导的瘢痕性结膜炎或假性类天疱疮相鉴别。

引言

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黏膜类天疱疮（MMP）是一种慢性瘢痕性结膜病，具有自身免疫病因，可累及全身的黏膜组织1,2。慢性瘢痕性结膜炎的病因多样，需将MMP与Stevens-Johnson综合征（SJS）、结节病、眼表鳞状细胞新生物及假性类天疱疮相鉴别，因为前者需要系统性免疫抑制治疗3,4。此外，MMP是一种可能导致失明的疾病，患者常就诊较晚，且初期易被误诊1,2,5。在27.4%的眼部MMP患者中，可仅表现为眼部受累而无全身表现6。MMP的诊断需通过结膜活检以显示基底膜区存在自身抗体2,5。直接免疫荧光（DIF）是识别影响结膜的自身免疫性疾病（如MMP）的关键诊断工具。DIF有助于检测免疫球蛋白和补体成分在基底膜区（BMZ）的原位沉积，这是MMP的特征性表现。DIF阳性率在30%至80%之间1,

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方案

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该方案遵循 LV Prasad 眼科研究所人类研究伦理委员会的指导方针。

1. 结膜活检技术

  1. 在局部或表面麻醉及手术显微镜下，计划对疑似天疱疮患者的双眼进行活检。
  2. 获取患者的知情同意，并告知可能的副作用，包括出血、瘢痕形成，以及术后需开始使用局部糖皮质激素。
  3. 在双眼内各滴入1-2滴0.5%丙美卡因，等待5分钟后开始操作。
  4. 使用精细镊子触碰结膜时，确认患者无疼痛感。若滴用表面丙美卡因后患者仍有疼痛，可使用1 mL结核菌素注射器在结膜下注射0.2 mL 2%利多卡因。
  5. 将开睑器置入右眼或左眼（根据首先选择的眼别）。
  6. 检查眼表是否存在瘢痕和角化区域，选择未受累、无瘢痕或角化的部位作为活检区域。
    注：本研究中优先选择远离角膜缘的上方球结膜作为活检部位，其次为下方球结膜。
  7. 使用Lim镊提起巩膜与结膜，用Westcott剪刀线性切除大小约为4-5 mm长、2-3 mm宽的组织。
  8. 立即将整个活检组织转移至最佳切割温度介质（OCT）中。
    注：也可将活检组织转移至生理盐水或Michel运输介质中。
  9. 取一个包埋盒和一个中央带孔的塑料组织模具，用生理盐水清洗后自然晾干。
  10. 分别将右眼和左眼的活检组织放入装有OCT介质的包埋盒中，使切除的结....

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结果

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DIF 结果的判读需要确认组织切片中基底膜的存在（图1）。在 PAS 染色的切片中，基底膜表现为结膜上皮基底层位置的一条亮粉色膜状结构（图1C）。应同时对基底膜的连续性及结构进行描述。DIF 阳性表现为明亮的绿色基底膜荧光（图1B），提示存在 IgM（图2A）、IgA（图2B）、IgG（图1B）、C3 或 C4 的沉积。在这五种抗体中，只要有一种抗体呈阳性，即判定为 DIF 阳性。若 PAS 染色中未见基底膜，则应重复进行结膜活检。使用纤维蛋白原作为阳性对照时，可在基底膜处观察到明亮的绿色荧光（图2C）。阴性活检结果则显示无荧光信号（图2D）。

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讨论

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本文所述的结膜活检技术采用OCT包埋介质作为转运介质，从而无需额外的转运液，并避免了将活检样本转移至OCT介质过程中对组织的额外操作。将装有介质和活检组织的塑料模具直接冷冻，制成组织块后再进行切片。OCT介质的优点在于其冷冻迅速，可最大限度减少冰晶形成造成的损伤，同时能有效包埋组织标本。直接免疫荧光检测（DIF）中最关键的步骤是样本的转运。结膜活检样本不应送检于福尔马林中。然而，有研究评估了经福尔马林固定、石蜡包埋的标本通过免疫组织化学方法检测时的阳性率16，结果显示所有活检样本中IgG或IgA均呈阴性，仅有56%的样本C3d或C4d呈阳性。对于将检测外包的医疗机构，生理盐水也曾被用作运输介质13。在25例皮肤活检样本中，使用生理盐水运输24小时后，92%的DIF结果明确，而运输48小时后该比例下降至83%。我们接收来自其他医疗中心、在OCT介质中保存并经24小时运输的结膜活检样本，大多数样本均可获得明确的DIF结果。我们推荐使用OCT介质或Michel介质运送样本。OCT介质可在不引起化学交联的情况下保持组织完整性和抗原性，从而避免干扰抗体.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢印度海得拉巴眼科研究基金会对本研究的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 N 盐酸 Finar  chemical Limited 7647-01-0
丙酮 QualigensQ33517
白蛋白DAKOF0117
碱性品红QualigensQ39402
C3cDiagnostic Biosystems F003
C4cDiagnostic Biosystems F005
切片盒Polysciences25376-500
活性炭 SigmaC-5260
冷冻切片机 Leica CM1860UV 
冷冻切片刀片 Leica 818
DAPIAbcam Ab104139
纤维蛋白原 Diagnostic Biosystems F006
荧光显微镜OlympusCX43
镊子 Joja surgicalJS1528A
湿盒 Diagnostic Biosystems SM365
IgADiagnostic Biosystems F007
IgGDiagnostic Biosystems F008
IgMDiagnostic Biosystems F009
免疫组化粘附载玻片 Tomo 33140455
Lim 镊子Speedway S-7223
Michel 运输介质Fisher Scinitics NC0253304
显微镜盖玻片Blue starhttps://www.bluestarslides.com
OCT 包埋介质 Cryomatrix 6769006
PBS DAKOdm831
过碘酸 Sigma375810-25G
焦亚硫酸钾SigmaP2522-500G
丙美卡因 0.5%Sunway Private G/1118A
Westcott 剪刀Pillig Gurgical Intruments 423480

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jain, N., Jakati, S., Shanbhag, S. S., Basu, S. Direct immunofluorescence findings and factors affecting conjunctival biopsy positivity in ocular mucous membrane pemphigoid. Cornea. 43 (2), 159-165 (2024).
  2. Vazirani, J., et al.

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PAS

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