本文介绍了一种采集和处理结膜活检样本以鉴定黏膜类天疱疮的实验方案。
方法文章
本文介绍了一种采集和处理结膜活检样本以鉴定黏膜类天疱疮的实验方案。
眼黏膜类天疱疮(MMP)表现为慢性瘢痕性结膜炎,若不及时治疗,可导致失明。及时诊断并进行免疫抑制治疗可防止疾病进展。对结膜活检组织进行直接免疫荧光染色(DIF),检测基底膜区免疫复合物沉积,是诊断MMP的依据。活检阳性率取决于活检特征、双眼受累情况、高龄及疾病活动性。本文详细描述了获取结膜活检标本的技术,以及使用预填充低温恒温切割介质(OCT)的 cartridges 进行样本转运和组织包埋的方法。活检应取自双眼未瘢痕化、未受累或相对受累较轻的结膜区域。常规活检标本大小为长4–5 mm、宽2–3 mm,并应包含少量下方的结膜下组织,以确保不遗漏基底膜。我们建议进行过碘酸-希夫(PAS)染色以确认基底膜的存在。按照特定方案,将活检组织的冷冻切片用荧光标记的抗体IgG、IgM、IgA以及补体成分C3c和C4c进行染色。阳性活检表现为基底膜处出现绿色荧光信号,只要其中一种抗体呈阳性,即可判定为MMP阳性。阴性活检结果不能排除类天疱疮,但阳性结果可确诊MMP,并将其与药物诱导的瘢痕性结膜炎或假性类天疱疮相鉴别。
黏膜类天疱疮(MMP)是一种慢性瘢痕性结膜病,具有自身免疫病因,可累及全身的黏膜组织1,2。慢性瘢痕性结膜炎的病因多样,需将MMP与Stevens-Johnson综合征(SJS)、结节病、眼表鳞状细胞新生物及假性类天疱疮相鉴别,因为前者需要系统性免疫抑制治疗3,4。此外,MMP是一种可能导致失明的疾病,患者常就诊较晚,且初期易被误诊1,2,5。在27.4%的眼部MMP患者中,可仅表现为眼部受累而无全身表现6。MMP的诊断需通过结膜活检以显示基底膜区存在自身抗体2,5。直接免疫荧光(DIF)是识别影响结膜的自身免疫性疾病(如MMP)的关键诊断工具。DIF有助于检测免疫球蛋白和补体成分在基底膜区(BMZ)的原位沉积,这是MMP的特征性表现。DIF阳性率在30%至80%之间1,5。然而,部分患者活检结果可能为阴性,尤其是仅累及眼部的MMP患者,但若临床记录显示疾病进展,则其治疗方式与活检阳性的眼部MMP病例相同7,8。因此,Dart等人强调有必要为仅累及眼部的MMP制定独立的诊断标准8。
多项研究中阳性率较低的原因可能包括:疾病进展至晚期导致眼表广泛瘢痕化、组织处理或染色技术不充分,以及存在活检阴性的疾病亚型8,9,10,11。一项针对27例疑似眼黏膜类天疱疮(ocular MMP)患者的活检回顾性分析显示,阳性率仅为30%,其中63.7%的患者仅有眼部受累12。直接免疫荧光(DIF)检测需要特定的操作流程,并非所有诊断实验室均具备相应条件。目前在活检部位的选择、是否进行单眼或双眼活检,以及样本转运液的使用方面仍存在差异13,14,15。在我中心对结膜活检样本的回顾性分析中,DIF阳性率为54.1%,而双侧活检时阳性率更高(59% vs. 45%)8。尽管活检至关重要,但临床表现及进行性眼表瘢痕化仍有助于确诊MMP。当出现眼外受累时更易诊断,例如口腔或皮肤受累,分别在40%和18%的患者中有报道5。
现有文献中存在一些差异,本文所述方案可作为参考指南,并进行了修改以减少对特殊转运介质的需求14。活检样本被置于最佳切割温度(OCT)包埋剂中,并在同一转运盒内于病理科快速冷冻,从而无需额外的转运介质。本文详细阐述了结膜组织直接免疫荧光(DIF)染色、组织采集及样本转运的实验方法。
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该方案遵循 LV Prasad 眼科研究所人类研究伦理委员会的指导方针。
1. 结膜活检技术
2. 转移组织
3. 组织制备与切片
4. 免疫荧光染色
5. 快速过碘酸-希夫染色
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DIF 结果的判读需要确认组织切片中基底膜的存在(图1)。在 PAS 染色的切片中,基底膜表现为结膜上皮基底层位置的一条亮粉色膜状结构(图1C)。应同时对基底膜的连续性及结构进行描述。DIF 阳性表现为明亮的绿色基底膜荧光(图1B),提示存在 IgM(图2A)、IgA(图2B)、IgG(图1B)、C3 或 C4 的沉积。在这五种抗体中,只要有一种抗体呈阳性,即判定为 DIF 阳性。若 PAS 染色中未见基底膜,则应重复进行结膜活检。使用纤维蛋白原作为阳性对照时,可在基底膜处观察到明亮的绿色荧光(图2C)。阴性活检结果则显示无荧光信号(图2D)。
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本文所述的结膜活检技术采用OCT包埋介质作为转运介质,从而无需额外的转运液,并避免了将活检样本转移至OCT介质过程中对组织的额外操作。将装有介质和活检组织的塑料模具直接冷冻,制成组织块后再进行切片。OCT介质的优点在于其冷冻迅速,可最大限度减少冰晶形成造成的损伤,同时能有效包埋组织标本。直接免疫荧光检测(DIF)中最关键的步骤是样本的转运。结膜活检样本不应送检于福尔马林中。然而,有研究评估了经福尔马林固定、石蜡包埋的标本通过免疫组织化学方法检测时的阳性率16,结果显示所有活检样本中IgG或IgA均呈阴性,仅有56%的样本C3d或C4d呈阳性。对于将检测外包的医疗机构,生理盐水也曾被用作运输介质13。在25例皮肤活检样本中,使用生理盐水运输24小时后,92%的DIF结果明确,而运输48小时后该比例下降至83%。我们接收来自其他医疗中心、在OCT介质中保存并经24小时运输的结膜活检样本,大多数样本均可获得明确的DIF结果。我们推荐使用OCT介质或Michel介质运送样本。OCT介质可在不引起化学交联的情况下保持组织完整性和抗原性,从而避免干扰抗体...
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作者无任何利益冲突需要披露。
我们感谢印度海得拉巴眼科研究基金会对本研究的支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 N 盐酸 | Finar chemical Limited | 7647-01-0 | |
| 丙酮 | Qualigens | Q33517 | |
| 白蛋白 | DAKO | F0117 | |
| 碱性品红 | Qualigens | Q39402 | |
| C3c | Diagnostic Biosystems | F003 | |
| C4c | Diagnostic Biosystems | F005 | |
| 切片盒 | Polysciences | 25376-500 | |
| 活性炭 | Sigma | C-5260 | |
| 冷冻切片机 | Leica | CM1860UV | |
| 冷冻切片刀片 | Leica | 818 | |
| DAPI | Abcam | Ab104139 | |
| 纤维蛋白原 | Diagnostic Biosystems | F006 | |
| 荧光显微镜 | Olympus | CX43 | |
| 镊子 | Joja surgical | JS1528A | |
| 湿盒 | Diagnostic Biosystems | SM365 | |
| IgA | Diagnostic Biosystems | F007 | |
| IgG | Diagnostic Biosystems | F008 | |
| IgM | Diagnostic Biosystems | F009 | |
| 免疫组化粘附载玻片 | Tomo | 33140455 | |
| Lim 镊子 | Speedway | S-7223 | |
| Michel 运输介质 | Fisher Scinitics | NC0253304 | |
| 显微镜盖玻片 | Blue star | https://www.bluestarslides.com | |
| OCT 包埋介质 | Cryomatrix | 6769006 | |
| PBS | DAKO | dm831 | |
| 过碘酸 | Sigma | 375810-25G | |
| 焦亚硫酸钾 | Sigma | P2522-500G | |
| 丙美卡因 0.5% | Sunway Private | G/1118A | |
| Westcott 剪刀 | Pillig Gurgical Intruments | 423480 |
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