结膜活检与直接免疫荧光技术用于诊断黏膜类天疱疮

摘要

本文介绍了一种采集和处理结膜活检样本以鉴定黏膜类天疱疮的实验方案。

摘要

眼黏膜类天疱疮（MMP）表现为慢性瘢痕性结膜炎，若不及时治疗，可导致失明。及时诊断并进行免疫抑制治疗可防止疾病进展。对结膜活检组织进行直接免疫荧光染色（DIF），检测基底膜区免疫复合物沉积，是诊断MMP的依据。活检阳性率取决于活检特征、双眼受累情况、高龄及疾病活动性。本文详细描述了获取结膜活检标本的技术，以及使用预填充低温恒温切割介质（OCT）的 cartridges 进行样本转运和组织包埋的方法。活检应取自双眼未瘢痕化、未受累或相对受累较轻的结膜区域。常规活检标本大小为长4–5 mm、宽2–3 mm，并应包含少量下方的结膜下组织，以确保不遗漏基底膜。我们建议进行过碘酸-希夫（PAS）染色以确认基底膜的存在。按照特定方案，将活检组织的冷冻切片用荧光标记的抗体IgG、IgM、IgA以及补体成分C3c和C4c进行染色。阳性活检表现为基底膜处出现绿色荧光信号，只要其中一种抗体呈阳性，即可判定为MMP阳性。阴性活检结果不能排除类天疱疮，但阳性结果可确诊MMP，并将其与药物诱导的瘢痕性结膜炎或假性类天疱疮相鉴别。

引言

黏膜类天疱疮（MMP）是一种慢性瘢痕性结膜病，具有自身免疫病因，可累及全身的黏膜组织^1,2。慢性瘢痕性结膜炎的病因多样，需将MMP与Stevens-Johnson综合征（SJS）、结节病、眼表鳞状细胞新生物及假性类天疱疮相鉴别，因为前者需要系统性免疫抑制治疗^3,4。此外，MMP是一种可能导致失明的疾病，患者常就诊较晚，且初期易被误诊^1,2,5。在27.4%的眼部MMP患者中，可仅表现为眼部受累而无全身表现⁶。MMP的诊断需通过结膜活检以显示基底膜区存在自身抗体^2,5。直接免疫荧光（DIF）是识别影响结膜的自身免疫性疾病（如MMP）的关键诊断工具。DIF有助于检测免疫球蛋白和补体成分在基底膜区（BMZ）的原位沉积，这是MMP的特征性表现。DIF阳性率在30%至80%之间^1,5。然而，部分患者活检结果可能为阴性，尤其是仅累及眼部的MMP患者，但若临床记录显示疾病进展，则其治疗方式与活检阳性的眼部MMP病例相同^7,8。因此，Dart等人强调有必要为仅累及眼部的MMP制定独立的诊断标准⁸。

多项研究中阳性率较低的原因可能包括：疾病进展至晚期导致眼表广泛瘢痕化、组织处理或染色技术不充分，以及存在活检阴性的疾病亚型^8,9,10,11。一项针对27例疑似眼黏膜类天疱疮（ocular MMP）患者的活检回顾性分析显示，阳性率仅为30%，其中63.7%的患者仅有眼部受累¹²。直接免疫荧光（DIF）检测需要特定的操作流程，并非所有诊断实验室均具备相应条件。目前在活检部位的选择、是否进行单眼或双眼活检，以及样本转运液的使用方面仍存在差异^13,14,15。在我中心对结膜活检样本的回顾性分析中，DIF阳性率为54.1%，而双侧活检时阳性率更高（59% vs. 45%）⁸。尽管活检至关重要，但临床表现及进行性眼表瘢痕化仍有助于确诊MMP。当出现眼外受累时更易诊断，例如口腔或皮肤受累，分别在40%和18%的患者中有报道⁵。

现有文献中存在一些差异，本文所述方案可作为参考指南，并进行了修改以减少对特殊转运介质的需求¹⁴。活检样本被置于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并在同一转运盒内于病理科快速冷冻，从而无需额外的转运介质。本文详细阐述了结膜组织直接免疫荧光（DIF）染色、组织采集及样本转运的实验方法。

方案

该方案遵循 LV Prasad 眼科研究所人类研究伦理委员会的指导方针。

1. 结膜活检技术

1. 在局部或表面麻醉及手术显微镜下，计划对疑似天疱疮患者的双眼进行活检。
2. 获取患者的知情同意，并告知可能的副作用，包括出血、瘢痕形成，以及术后需开始使用局部糖皮质激素。
3. 在双眼内各滴入1-2滴0.5%丙美卡因，等待5分钟后开始操作。
4. 使用精细镊子触碰结膜时，确认患者无疼痛感。若滴用表面丙美卡因后患者仍有疼痛，可使用1 mL结核菌素注射器在结膜下注射0.2 mL 2%利多卡因。
5. 将开睑器置入右眼或左眼（根据首先选择的眼别）。
6. 检查眼表是否存在瘢痕和角化区域，选择未受累、无瘢痕或角化的部位作为活检区域。
   注：本研究中优先选择远离角膜缘的上方球结膜作为活检部位，其次为下方球结膜。
7. 使用Lim镊提起巩膜与结膜，用Westcott剪刀线性切除大小约为4-5 mm长、2-3 mm宽的组织。
8. 立即将整个活检组织转移至最佳切割温度介质（OCT）中。
   注：也可将活检组织转移至生理盐水或Michel运输介质中。
9. 取一个包埋盒和一个中央带孔的塑料组织模具，用生理盐水清洗后自然晾干。
10. 分别将右眼和左眼的活检组织放入装有OCT介质的包埋盒中，使切除的结膜组织完全浸没于OCT介质内，并送至病理科。
11. 对对侧眼重复相同的步骤。

2. 转移组织

1. 若结膜活检标本接收时使用的是Michel运输液或生理盐水，则应将其包埋于OCT包埋剂中，以保存组织结构和抗原性。
2. 使用液氮或干冰对包埋后的样本进行速冻，并于-80 °C保存过夜。

3. 组织制备与切片

1. 使用冷冻切片机在 -20 °C 至 -25 °C 条件下将冷冻组织切成 4-6 µm 厚的切片，共 7 片。
2. 将切片贴附于带正电荷的多聚赖氨酸包被的载玻片上以确保粘附性，并用铝箔包裹后于 -80 °C 保存，直至染色。

4. 免疫荧光染色

1. 将切片在室温下解冻 10 分钟，然后用冷丙酮（100%）固定 10 分钟，以保存抗原并防止组织损伤。
2. 用 1× PBS 漂洗三次，每次 5 分钟，以去除多余的 OCT 包埋剂和丙酮。
3. 在切片上加入标记的抗体，包括抗 IgG、抗 IgA、抗 IgM 和抗 C3 抗体，按指定比例稀释（纤维蛋白原-1:10 [阳性对照]，IgG-1:10，IgA-1:10，IgM-1:10，C3-1:5，C4-1:10）。
   注意：抗体使用 1× PBS 进行稀释。
4. 对于阴性对照，跳过标记抗体的步骤，继续执行下述其余步骤。
5. 根据制造商的说明稀释抗体，并使用已知的阳性和阴性对照进行标准化。
6. 将切片置于湿化盒中，在 37 °C 下孵育 45–60 分钟。
7. 用 PBS 洗涤切片（每次 5 分钟，共 3 次），以去除未结合的抗体。
8. 使用含 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）的封片剂进行复染，以显示细胞核。
9. 在切片上加盖盖玻片，并静置 20 分钟使其固化。
10. 使用配备适当滤光片的荧光显微镜观察切片（488 nm 激发使用绿色激发滤光片）。
11. 使用数字显微图像记录结果。

5. 快速过碘酸-希夫染色

1. 过碘酸雪夫（PAS）试剂的制备
   1. 将1 g碱性品红溶解于100 mL热蒸馏水中。
   2. 加入10 mL盐酸和2 g焦亚硫酸钾，以脱色染料。
   3. 冷却后，加入0.5 g活性炭，搅拌并过滤溶液，得到澄清的过碘酸雪夫试剂。储存于棕色瓶中。
      注意：检测雪夫试剂时，将10 mL 37%甲醛溶液倒入表面皿中，加入数滴待测雪夫试剂。良好的雪夫试剂会迅速变为紫红色；劣化的雪夫试剂反应延迟，产物呈深蓝紫色。
2. PAS染色技术
   1. 将切片用蒸馏水水化。
   2. 在0.5%过碘酸溶液中氧化5分钟。
   3. 用蒸馏水冲洗。
   4. 放入雪夫试剂中染色15分钟（此步骤中组织呈淡粉色）。
   5. 用温自来水冲洗5分钟（组织变为深粉色）。
   6. 用Mayer苏木精复染1分钟。
   7. 用自来水冲洗5分钟。
   8. 依次以下列溶液脱水：80%乙醇中1次，每次1分钟；90%乙醇中2次，每次1分钟；100%乙醇中2次，每次1分钟。
   9. 在二甲苯中脱水3次，每次1分钟。
   10. 使用合成封片介质（如DPX封片剂）加盖盖玻片。
   11. 在明场显微镜下观察PAS染色结果。

结果

DIF 结果的判读需要确认组织切片中基底膜的存在（图1）。在 PAS 染色的切片中，基底膜表现为结膜上皮基底层位置的一条亮粉色膜状结构（图1C）。应同时对基底膜的连续性及结构进行描述。DIF 阳性表现为明亮的绿色基底膜荧光（图1B），提示存在 IgM（图2A）、IgA（图2B）、IgG（图1B）、C3 或 C4 的沉积。在这五种抗体中，只要有一种抗体呈阳性，即判定为 DIF 阳性。若 PAS 染色中未见基底膜，则应重复进行结膜活检。使用纤维蛋白原作为阳性对照时，可在基底膜处观察到明亮的绿色荧光（图2C）。阴性活检结果则显示无荧光信号（图2D）。

讨论

本文所述的结膜活检技术采用OCT包埋介质作为转运介质，从而无需额外的转运液，并避免了将活检样本转移至OCT介质过程中对组织的额外操作。将装有介质和活检组织的塑料模具直接冷冻，制成组织块后再进行切片。OCT介质的优点在于其冷冻迅速，可最大限度减少冰晶形成造成的损伤，同时能有效包埋组织标本。直接免疫荧光检测（DIF）中最关键的步骤是样本的转运。结膜活检样本不应送检于福尔马林中。然而，有研究评估了经福尔马林固定、石蜡包埋的标本通过免疫组织化学方法检测时的阳性率¹⁶，结果显示所有活检样本中IgG或IgA均呈阴性，仅有56%的样本C3d或C4d呈阳性。对于将检测外包的医疗机构，生理盐水也曾被用作运输介质¹³。在25例皮肤活检样本中，使用生理盐水运输24小时后，92%的DIF结果明确，而运输48小时后该比例下降至83%。我们接收来自其他医疗中心、在OCT介质中保存并经24小时运输的结膜活检样本，大多数样本均可获得明确的DIF结果。我们推荐使用OCT介质或Michel介质运送样本。OCT介质可在不引起化学交联的情况下保持组织完整性和抗原性，从而避免干扰抗体...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 N 盐酸	Finar  chemical Limited	7647-01-0
丙酮	Qualigens	Q33517
白蛋白	DAKO	F0117
碱性品红	Qualigens	Q39402
C3c	Diagnostic Biosystems	F003
C4c	Diagnostic Biosystems	F005
切片盒	Polysciences	25376-500
活性炭	Sigma	C-5260
冷冻切片机	Leica	CM1860UV
冷冻切片刀片	Leica	818
DAPI	Abcam	Ab104139
纤维蛋白原	Diagnostic Biosystems	F006
荧光显微镜	Olympus	CX43
镊子	Joja surgical	JS1528A
湿盒	Diagnostic Biosystems	SM365
IgA	Diagnostic Biosystems	F007
IgG	Diagnostic Biosystems	F008
IgM	Diagnostic Biosystems	F009
免疫组化粘附载玻片	Tomo	33140455
Lim 镊子	Speedway	S-7223
Michel 运输介质	Fisher Scinitics	NC0253304
显微镜盖玻片	Blue star	https://www.bluestarslides.com
OCT 包埋介质	Cryomatrix	6769006
PBS	DAKO	dm831
过碘酸	Sigma	375810-25G
焦亚硫酸钾	Sigma	P2522-500G
丙美卡因 0.5%	Sunway Private	G/1118A
Westcott 剪刀	Pillig Gurgical Intruments	423480