方法文章

健康和缺血 离体 大鼠心脏中的双向电和光电接口

DOI：

10.3791/68305

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2025年7月18日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago, 2The James Franck Institute, The University of Chicago, 3Department of Chemistry, The University of Chicago, 4The Institute for Biophysical Dynamics, The University of Chicago

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该协议概述了用于光学和电双向生物接口的先进材料制造和 离体 大鼠心脏方法，为生物电子学研究提供精确的心脏刺激、记录和梗塞建模。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

电生理学研究对于探索材料和心脏生物界面之间的相互作用至关重要。最近的进展引入了各种新型导体和半导体材料，用于与心脏模型的双向接口，促进了低强度起搏以及高时空和高信噪比 （SNR） 记录。 离体 啮齿动物心脏模型是验证新材料和设备功能的有效平台，将 体外 发现与转化见解联系起来，同时最大限度地减少伦理和管理问题。在该协议中，我们详细介绍了使用 Langendorff 装置对成年大鼠心脏进行分离和 离体 灌注，使用高性能半导体和导体（包括纳米多孔硅、纳米多孔碳和柔性网状微电极阵列）建立精确的双向刺激和记录。此外，我们提出了一个由缺血再灌注 （I/R） 损伤诱导的心肌梗死模型，通过多通道记录和标测以及梗死染色进行评估，从而能够进行心脏病相关研究和潜在的治疗探索。该方法为材料-生物界面研究和下一代心脏生物电子学的开发提供了有价值的见解。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

心脏生物电子学领域正在迅速发展，因为需要开发能够与心脏进行精确和高效双向通信的材料和设备 1,2,3,4。电生理学研究在这项工作中发挥着关键作用，为材料如何通过调制和传感与心脏生物界面相互作用提供了重要见解。虽然体外模型（例如培养的 HL-1 细胞系和啮齿动物的原代心肌细胞）为初始评估提供了受控环境 5,6,7,8，但它们的简单性通常无法复制活心脏的复杂动态条件。这些模型缺乏心脏的 3D 结构，这对于协调的电传导和机械力的产生至关重要，并且无法模拟对氧气和营养输送至关重要的有节奏的收缩-舒张周期或灌注动力学9。相反，体内模型提供了最生理相关的见解，但带来了重大的伦理、管理和技术挑战，包括需要广泛的培训、复杂的手术设置以及遵守严格的监管框架10。

为了弥合这一差距，离体心脏模型，例如 Langendorff 灌注的成年大鼠心脏，为科学研究提供了一种引人注目的替代方案11,12。这些模型将体内系统的生理相关性与体外设置的可控性和可及性相结合。通过隔离心脏并将其维持在功能状态，Langendorff 装置使研究人员能够在精确控制的条件下对心脏电生理学进行高保真研究。没有神经输入和循环激素等全身变量简化了结果的解释，同时保留了心脏生理学的关键方面。此外，离体模型减轻了许多伦理问题并减轻了资源负担，使其成为转化研究的多功能和实用平台13。

除了其转化潜力外，该协议还为材料性能评估设定了基准。通过结合具有代表性的材料策略，例如用于无线光刺激的光电平台和用于有线刺激和记录的电子系统，它为比较研究建立了一个可重复的框架。这种标准化不仅促进了创新，还提高了研究小组研究结果的可重复性和可靠性。过去，许多高性能光电极和电极在生物电学研究中显示出巨大的前景，例如 PEDOT：PSS14、MXene15、氧化铱16、铂17、钼18、硅 19,20,21、量子点22、23、24 和有机半导体25.在这里，该协议展示了具有代表性和最先进的材料，包括纳米多孔硅26、纳米多孔碳27 和柔性网状金多电极阵列 （MEA）28,29，集成到协议中以展示它们在双向心脏接口中的能力。这些材料可实现低强度超阈值刺激、高时空分辨率和高 SNR 记录，展示了它们在推进心脏生物电子学方面的潜力。此外，由 I/R 损伤诱导的心肌梗死模型的纳入为疾病相关研究和治疗探索提供了一个强大的框架。

这项工作介绍了制造和应用用于无铅光刺激和电刺激和离体大鼠心脏传感的先进材料的详细方法（图 1A）。纳米多孔硅膜通过光刻图案化、反应离子蚀刻 （RIE） 和缓冲氢氟酸 （HF） 从具有 5 μm 器件层的绝缘体上硅 （SOI） 晶片中释放，然后染色蚀刻并转移到柔软的聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 膜上26。对于电刺激和记录，纳米多孔碳是通过盐孵育纤维素基材的激光烧蚀，然后是水相转移和热层压开发的，与传统的金电极相比，提供了更好的电荷存储和注入能力27。此外，使用光刻、电子束金属化、蚀刻、封装和释放工艺在聚酰亚胺涂层的硅晶片上制造了柔性 MEA，以实现空间分辨的心外膜记录和映射28,29。

除了制造之外，该协议还为成年大鼠心脏隔离、灌注、监测以及与光学和电气设备的接口提供了分步协议。这些设备在离体心脏上进行了测试，在用于电生理评估的起搏和记录方面显示出代表性结果。该协议还介绍了一种通过 I/R 创建心肌梗死模型的方法，并通过生理记录、染色和形态学评估进行验证。这种全面的方法为评估心脏生物界面中的材料和设备建立了一个可重复的框架。图 1B-D 概述了在该离体心脏模型中进行评估的材料制造工作流程。图 2A-C 在制造器件的图片中展示了预期结果。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有动物程序均已获得芝加哥大学机构动物护理和使用委员会的批准（方案编号 72378）。

1. 纳米多孔硅膜制造（图 1B、 图 2A、 图 3）

  1. 在 AutoCAD 软件中设计光掩模图案（图 3）。确保设备尺寸与生物靶标的长度尺度相匹配。对于大鼠心脏，请使用 2 - 10 mm 的设备尺寸。在设计中，添加直径为 20 - 100 μm 的小孔阵列，以促进在缓冲 HF 中释放 Si 器件层。制作三个直径为 200 - 1000 μm 的大孔，形成一个手性字母 L，以帮助识别膜的正确一侧。
  2. 在超声波浴中用丙酮和异丙醇 （IPA） 清洁 SOI 晶片 3 分钟。在热板上于 200 °C 进行脱水烘烤 20 分钟。
  3. 以 3000 rpm 的速度旋转涂覆厚的正性光刻胶 AZ40XT-11D 45 秒，在 115 °C 下烘烤 3 分钟。小心不要在晶圆上倒入过多的光刻胶。旋涂后，使用丙酮棉签清理晶片背面的残留物。
    注意：AZ40XT-11D 是一种非常粘稠的正性光刻胶。
  4. 使用 Heidelberg MLA150 直接写入器在 375 nm 处曝光光刻胶图案，剂量为 800 mJ/cm2。在 110 °C 下进行曝光后烘烤 2 分钟。
  5. 在 AZ 300MIF 显影剂中开发模式，持续 2 分钟。用去离子 （DI） 水冲洗晶片 60 秒，然后用 N2 空气干燥。
  6. 使用 SF6/CHF3 （20 sccm：50 sccm） RIE 工艺，使用 600 W 和 60 W 射频的电感耦合等离子体在腔室压力为 10 mT 的电感耦合等离子体氟化物蚀刻机中蚀刻未覆盖的 SOI 12 分钟，得到约 660 nm/min 的蚀刻速率。
  7. 使用 AZ NMP 在 80 °C 超声波浴中剥离光刻胶 10 分钟，然后在超声波浴中用丙酮清洁晶片 3 分钟，然后在 IPA 中清洗 3 分钟，并使用压缩氮气干燥。
  8. 在室温下将样品浸入缓冲的 HF 中，以消除埋藏的氧化层。该设备在 4 - 8 小时内释放。略微提高溶液温度 （40 °C） 以促进释放。
  9. 用 1 cm x 1 cm 滤纸小心地将释放的膜依次转移到两个单独的去离子水浴中，以去除任何残留的 HF。
    注意：实验可以在此处暂停。将膜浸泡在 IPA 浴中，以便在 4 °C 下储存。
  10. 使用滤纸将膜转移到装有去离子 （DI） 水的培养皿中。由于疏水性和表面张力，膜会漂浮在水面上。
    注：由于马兰戈尼效应30，硅膜可以从 IPA 严格地移动到水中。
  11. 在单独的培养皿中，制备含有 100：1 体积比的浓 HF 和浓硝酸的染色蚀刻溶液（例如，10 mL HF 和 0.1 mL HNO3）。蚀刻前将其充分混合。
  12. 用滤纸将膜转移到染色蚀刻溶液中并蚀刻 30 秒。注意 Si 膜的侧面，注意由三个主要孔形成的字母 L 方向。Si 膜应漂浮在蚀刻剂上，其中只有一侧蚀刻膜。
  13. 用滤纸将膜转移到两个单独的去离子水皿中，以洗去残留的 HF。
    注意：实验可以在此处暂停。将膜转移到 IPA 中，在 4 °C 下储存。
  14. 用薄 PDMS 制作支撑基板。以 10：1 的重量比混合 A 组分（基础聚合物）和 B 组分（固化剂），然后脱气 30 分钟。
  15. 载玻片上的旋涂 PMMA （495 A6） 牺牲层以 2,000 rpm 的速度持续 45 秒。在 180 °C 下烘烤 60 秒。
  16. 在 PMMA 涂层玻璃上以 4,500 rpm 的速度旋涂 PDMS 45 秒，这应产生 10 - 20 μm 的厚度。在 80 °C 的烤箱或热板中固化 2 小时。
    注意：为了减轻机械损伤，PDMS 被用作容纳纳米多孔硅膜的软基材，防止使用镊子直接处理的潜在损坏。
  17. 将染色蚀刻的 Si 膜从 IPA 转移到 PDMS。使用干净的组织去除多余的 IPA，IPA 蒸发后 Si 膜将牢固地附着在 PDMS 上。通过识别三个主要孔形成的字母 L 方向来注意 Si 膜的侧面。刻蚀的多孔 Si 应朝外，未蚀刻的 Si 应与 PDMS 接口。
  18. 使用含有 Si 膜的剃须刀片圆周切割 PDMS。留出足够的空间，注意不要损坏 Si 膜。
  19. 将器件浸泡在丙酮中，直到 Si/PDMS 释放。避免浸泡太久，因为这可能会导致 PDMS 肿胀。用去离子水冲洗，然后用 N2 干燥。以 400 W 进行 O2 等离子体处理 10 分钟。

2. 柔性微电极阵列制造（图 1C、 图 2B、 图 4）

  1. 在 AutoCAD 中设计柔性 MEA 的结构（图 4）。我们介绍了两种不同的设计，它们具有相同的电极投影面积，但具有不同的衬底结构（图 2B、 图 4）。
  2. 在超声波浴中用丙酮和 IPA 清洁硅晶片衬底 3 分钟。
    注：该协议不需要额外的表面处理来增强聚酰亚胺 （PI） 和 Si 晶片之间的附着力，以促进器件释放。如果需要，可以使用氧气等离子体处理来增强附着力。
  3. 将 4 mL 聚（吡咯酸二酐-co-4,4′-氧基二苯胺）的 PI 前体溶液倒在晶片上。以 1,500 rpm 的速度旋转涂覆晶圆 45 秒。使用 NMP 或丙酮去除晶片背面的前驱体。
  4. 在 110 °C 下预烤 3 分钟，然后在 180 °C 下预烤 3 分钟。在光刻胶烘箱中以轮廓模式固化 PI 涂层的晶圆。从室温开始，以 4 °C/min 的升温速率加热至 250 °C，并保持 30 分钟。然后以 2.5 °C/min 的升温速率将晶圆加热至 350 °C，并在 350 °C 下保持 60 分钟，然后缓慢冷却至 RT。结果是厚度约为 5 μm 的 PI 膜。
  5. 用 AZ nlof 2020 以 2,000 rpm 的速度旋涂 PI 涂层的晶圆 45 秒。将晶片在 110 °C 下烘烤 2 分钟。使用 Heidelberg MLA150 直接写入器在 375 nm 处曝光光刻胶图案，剂量为 200 mJ/cm2。
  6. 在 110 °C 下进行曝光后烘烤 2 分钟。在 AZ 300MIF Developer 中开发模式，时长 1 分钟。用去离子水冲洗晶片 60 秒，然后用 N2 空气干燥。
  7. 使用电子束蒸发器沉积 10 nm 的钛和 200 nm 的金。使用 AZ NMP 在 80 °C 浴中剥离光刻胶 3 小时，然后在超声浴中用丙酮清洁晶片 3 分钟，然后在 IPA 中 3 分钟，并使用压缩氮气干燥。
  8. 以 3,000 rpm 的速度旋转涂覆厚的正性光刻胶 AZ40XT-11D，持续 45 秒。使用丙酮清洁晶圆背面的光刻胶。将晶片在 115 °C 下烘烤 3 分钟。
  9. 使用 Heidelberg MLA150 直接写入器在 375 nm 处曝光光刻胶图案，剂量为 800 mJ/cm2。在 110 °C 下进行曝光后烘烤 2 分钟。
  10. 在 AZ 300MIF Developer 中开发模式，时间为 3 分钟。用去离子水冲洗晶片 60 秒，然后用 N2 空气干燥。
  11. 使用 SF6/CHF3 （20 sccm：50 sccm） RIE 工艺，在 600 W 和 60 W 射频的电感耦合等离子体氟化物蚀刻机中，在腔室压力为 10 mT 的电感耦合等离子体氟化物蚀刻机中蚀刻未覆盖的 PI 20 分钟。
  12. 使用 AZ NMP 在 80 °C 浴中剥离光刻胶 10 分钟，然后在丙酮中温和超声处理清洁晶片 3 分钟，然后在 IPA 中 3 分钟并使用压缩氮气干燥。
    注意：使用低功率超声波以避免设备分离。如果 PI 出现脱落迹象，请避免超声处理。
  13. 在六甲基二硅氮烷 （HMDS） 烘箱中加工晶片以应用 HMDS 处理。纺丝涂层 SU-8 2002 以 2,000 rpm 的速度运行 45 秒。这导致 SU8 厚度约为 2.5 μm。
  14. 将晶片在 95 °C 下烘烤 20 分钟。使用 Heidelberg MLA150 直接写入器在 375 nm 处曝光光刻胶图案，剂量为 950 mJ/cm2。
  15. 在 SU-8 Developer 中开发模式，时长 1 分钟。用 IPA 和 DI 水冲洗，然后用 N2 气体干燥。如果在 IPA 冲洗过程中晶片上出现白色污渍，请将晶片浸泡在 SU8 显影液中，直到白色污渍消失。
  16. 在 160 °C 下进行硬烘烤过夜。对于急性实验，使用较短的烘烤时间（~30 分钟）。请勿在 150 °C 以下或超过 200 °C 烘烤。 从基材上剥离柔性 PI 支持的柔性 MEA。

3. 纳米多孔碳制造（图 1D、 图 2C、 图 5）

  1. 在设计软件中设计碳膜图案（图 5）。
    注意：该方法包含两种电极的制造方案：纳米多孔碳基刺激电极和传感电极。
  2. 将滤纸浸渍在硼酸钠（0.15 M，pH 9.4）的水溶液中 1 小时，然后在 60 °C 下干燥过夜（图 1D）。
    注：1 级 Whatman 滤纸主要用作代表性的纤维基多孔基材。硼酸钠在浸渍和干燥过程后掺入纤维素纤维中。盐在激光合成下充当促进光化学碳化的催化剂27。
  3. 使用具有预先设计图案的 CO2 激光器进行激光合成（图 5A）。使用优化参数在光栅模式下进行图案化：功率 = 1.8 W;速度 = 1.6 cm/s;每英寸点数 = 1000。
  4. 制备厚度为 50 μm 的聚对苯二甲酸乙二醇酯 （PET） 薄膜，并在超声波浴中用丙酮和异丙醇 （IPA） 清洁薄膜 3 分钟。
  5. 使用电子束蒸发器沉积 5 nm 的钛和 100 nm 的金。应用水相转移程序将 MEA 转移到 PET 薄膜 （12.5 μm） 上。
    注：水相转移使用两个连续的过程进行：水相分离和毛细管转移。
  6. 在水相分离过程中，将纸质基材逐渐浸入去离子水中，以便分层。
    注：纤维素溶胀引起的应变能有助于在不到一秒的时间内将碳膜与支撑基材分离，使其漂浮在水面上。
  7. 在毛细管转移过程中，使用支撑基材（例如 PET 薄膜）在水介质中转移图案。将基材浸入水中，使其与所需碳膜的一端接触，形成接触线（转移前沿）。然后，用手握住基板，以低速向倾斜或垂直方向移动。
    注：对于疏水性支撑基材，可以应用外力或 O2 等离子体处理来帮助形成接触线。
  8. 转印后，将大约 20 μL 全氟磺酸 （PFSA） 聚合物溶液（在低级脂肪醇和水的混合物中浓度为 ~5%）涂在碳模型上，并在室温 （23 °C） 和压力 （1 atm） 条件下干燥以进行固定。
  9. 通过使用导电银粘合剂将纳米多孔碳基刺激电极连接到铜丝来固定纳米多孔碳基刺激电极。用硅胶将 Cu 线与电极之间的裸露结点封装起来，以确保绝缘和稳定性。在室温下固化 3 小时后，刺激电极即可使用。实验可以在此处暂停。
  10. 在 AutoCAD 中设计碳和 MEA 图案（图 5B）。如步骤 2 中所述，使用标准光刻程序在 25 μm PI 薄膜上制造 4 x 4 微电极阵列。
    注：PI 薄膜可以通过 PI 前驱体或使用 AZ2020 光刻胶将商业 PI 薄膜层压在 Si 晶片上来创建。光刻和金属沉积的方案与步骤 2 相同。
  11. 盐浸渍和激光写入后，在纸基材上创建一个整体碳膜 （2 cm x 2 cm），如步骤 3.1-3.3 所示。使用标准水相转移方法将碳图案转移到预先设计的 PET 支撑膜上，如步骤 3.6-3.9 所示。
  12. 将 10 wt% 聚乙烯-共聚乙烯酯 （EVA） 的己烷溶液涂在碳模型上，并在室温 （23°C） 和压力 （1 atm） 条件下等待干燥。设计并激光切割一个 10 μm 厚的 PET 模板（底部带有 EVA 涂层），其中 16 个孔与 MEA 图案对齐，用作封装层。
  13. 将 MEA、PET 封装层和碳膜对准 PET 支架。使用商用热层压机在 120 °C 的加工温度下压制组件，以进行转移和封装。
  14. 将纳米多孔碳传感电极冷却至室温，去除残留物，并在使用前用乙醇和水冲洗 3 次。

4. 大鼠心脏分离、灌注和监测（图 6）

  1. 在心脏提取前准备大鼠（图 6A）。该方案使用从 Charles River 获得的 3 至 4 个月大的雄性 CD/SD 大鼠。
  2. 根据 表 2 溶解化学品，制备 N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸 （HEPES） Tyrode 溶液。用 2M NaOH 将 pH 调节至 7.2-7.4。通过鼓泡氧气 0.5-1 小时进行预氧，并继续充氧直至实验结束。
  3. 将三管 Hanks 平衡盐溶液（HBSS，无钙、无镁）置于冰上。准备干净的手术器械（锋利的剪刀、弯曲的剪刀、两个止血钳、锋利的镊子、两对小镊子）。
    注意：手术不是为了生存，因此不需要无菌。
  4. 从动物设施中挑选体重在 400 至 500 克之间的成年 CD/SD 雄性大鼠。腹膜内注射 0.5 mL 肝素 （1000 IU/kg） 到下腹部。用厚手套抱住老鼠以保护老鼠。
  5. 抓住老鼠的上背部，使腹部露出来。牢牢抓住老鼠，但不要用力过猛，以免伤害动物。快速准确地注射肝素溶液。等待 20-30 分钟。同时准备 Langendorff 装置。
    注意：可以提前麻醉大鼠，以确保正确的外科手术准备步骤。
  6. 在重新填充 HEPES Tyrode 溶液之前，请用水清洗静脉治疗 （IV） 袋并完全干燥，以确保最终成分正确。用预充氧的 HEPES Tyrode 溶液填充袋子。
  7. 在 37 °C 下打开 Langendorff 装置中的恒温器和水循环（图 6A）。准备套管，缝合，并将培养皿放在冷袋上进行组织切片。切片前用冰冷的 HBSS 灌注套管。
  8. 准备进行大鼠开胸术（图 6B）。用钟罩配置的异氟醚麻醉动物。将 8 至 10 mL 异氟醚放入装满纱布垫的 50 mL 试管中。用开口管（含异氟醚）将动物封闭在容器中。
  9. 通过测试脚趾捏反射来观察麻醉的进展。动物将被麻醉并在 2-3 分钟内失去知觉。仔细监测大鼠的状况，并在它失去知觉后立即将其转移到手术板上。长时间麻醉会导致大鼠死亡。
  10. 将动物转移到作板上。将其仰卧，将 5 mL 异氟醚放入装满纱布垫的 50 mL 管中，盖在大鼠的嘴上。通过捏住其中一只爪子来确认全身麻醉。仅当未注意到响应时才继续。
  11. 用针将上臂和下臂固定到手术板上。切开一个切口（~ 5 cm），打开大鼠胸部下方的胸腔。小心切开横膈膜，露出心脏和肺。
  12. 切开两侧的肋骨，使胸腔完全打开，以提供完全的通道。使用止血钳将胸腔固定在胸骨处。使用止血钳从心脏下方握住腔静脉。用弯曲的钝剪刀在止血器下方切割，尽可能靠近胸腔底部，取出心脏。
  13. 将心脏转移到冰冷的 HBSS 中。尽量减少步骤的持续时间，以防止收缩心脏的氧气供应长时间中断。
  14. 准备进行 Langendorff 灌注和监测。用冰冷的 HBSS 完全填充套管和培养皿。确保系统中不存在气泡。
  15. 将心脏转移到预装有 HBSS 的培养皿中进行切片。使用镊子和剪刀去除肺和其他结缔组织（图 6C）。
    注意：建议在切片手术中使用钝性解剖，以防止对心脏造成任何潜在损伤。对于邻近组织的切片，请使用两把剪刀并小心地将组织撕开。
  16. 通过按压心脏并追踪血液流出时的路径来定位主动脉。如果在拔牙过程中保留了主动脉弓，则在第一升动脉下切开并插管主动脉（图 6D）。用双结将主动脉固定在套管上。
    注意： 避免将套管插入太深，以确保阀门保持关闭状态。不要将缝线位置太低，因为这可能会阻塞冠状动脉。
  17. 用预氧工作溶液灌注 Langendorff 装置。打开缓冲液流并将套管连接到装置上（图 6E）。确保没有气泡。心脏在这一步开始收缩。
    注意：最初，一些缓冲液可能会从心室飞溅，但预计不会过度泄漏。根据需要调整缝合线以防止缓冲液泄漏。如果手术和准备进行得当，在此步骤中不会观察到心脏颤动。
  18. 切断心房。在将球囊插入左心室之前给球囊放气，然后使用连接的注射器将其注满水。
  19. 将 BP-100 探针连接到灌注管和充满水的球囊，以分别监测灌注和左心室压力 （LVP）（图 6F）。
    注意：BP-100 探头在使用前需要校准。需要排出气球中的气泡，以确保精确的压力感应。
  20. 监测 HEPES Tyrode 的缓冲压力和 LVP 基线。确保缓冲压力保持在 80-100 mmHg 的最佳范围内。通过修改注入球囊的水量，将基线 LVP 调整为约 20 mmHg（图 6F）。
  21. 连接 ECG 电极。将套管接地并根据喜好将电极放置在侧面、顶部或顶点（图 6F）。
  22. 使用 IA-400D 放大器放大所有信号（灌注、左心室压力和心电图），并使用带有 Clampex 软件的数字化仪与计算机连接（图 6F）。

5. 使用 IR 过程创建心肌梗塞（图 6G、 图 7）

  1. 用预热的 37 °C HEPES Tyrode 缓冲液填充加热室。将心脏浸入加热室内的缓冲液中，并调整旋塞以停止缓冲液流，从而诱导整体缺血。根据实验的具体目标调整缺血的持续时间。
  2. 缺血 30 分钟后转动旋塞阀以恢复缓冲液流入心脏，开始再灌注。在终止实验进行染色以评估梗塞大小之前，允许心脏再灌注 45 分钟（图 6G）。
    注意：缺血或再灌注时间是根据实验目标确定的。
  3. 通过观察心率降低和不规则的心电图模式来验证缺血诱导是否成功（图 7A）。将观察到心律失常或心室颤动。
  4. 通过旋塞阀的侧端口缓慢施用 10 mL 4 °C HBSS 以停止心脏。从灌注柱中取出心脏，修剪掉任何剩余的心房组织，并将心脏置于组织切片基质中。
  5. 用透明薄膜覆盖基质，并将心脏在 -80 °C 下冷冻约 8 分钟或直到达到棉花糖般的稠度。从冰箱中取出组织切片基质，插入剃须刀片，将心脏切成 2 毫米厚的切片。
  6. 从切片基质中逐一取出组织切片，并将其储存在 -80 °C，直到需要用于生化实验。
  7. 进行梗塞染色（图 7B）。将心脏切片在 10 mL 的 1% w/v 氯化三苯基四唑 （TTC） 中于 37 °C 孵育 30 分钟。
  8. 将组织切片转移到 10% 缓冲福尔马林中，并使其在室温下固定过夜。为获得最佳效果，请从福尔马林中取出心脏并在 24 小时内对组织进行成像。在此步骤中尽量减少光照，以防止污渍降解。
  9. 拍摄染色切片并使用 ImageJ 等软件估计梗塞大小。

6. 在设备和心脏组织之间建立双向光电接口（图 8、 图 9）

  1. 将硅光电膜放在所需的刺激位置。硅膜在毛细管作用下自附着到心外膜上（图 8A）。如果附着困难，请使用湿组织粘合剂来帮助附着。
    注意：降低灌注速率可以减少心脏表面的水量，从而促进附着。一旦连接到心脏表面，硅膜通常会在手术过程中连接到预定位置。
  2. 将电极连接到 RHD 系统或其他电生理平台以进行数据记录。MEA 具有 16 通道 I/O 焊盘，一端间距为 0.5 mm，通过零插入力 （ZIF） 连接器连接到适配器板。然后，适配器板通过 Omnetics 连接器连接到头部。
  3. 将柔性 MEA 放在离体大鼠心脏的心室表面（图 8A）。如果使用窗口形硅膜，请将 MEA 放在窗口内（图 8B）。
  4. 使用晶体管-晶体管逻辑 （TTL） 信号以所需的频率（例如 4 Hz）和占空比（例如 0.4%、1 ms 脉冲持续时间）对 635 nm 激光源进行编程。将激光光斑聚焦在硅膜上，光斑尺寸约为 1 mm。佩戴防护性激光护目镜。从低强度开始进行聚焦。
  5. 启动记录和刺激协议。逐渐增加激光强度，直到观察到不间断的覆盖起搏（图 8C）。
    注意：在本协议的标准中，它定义了激光实现 10 秒不间断起搏的阈值强度。
  6. 使用不同的脉冲持续时间对激光轮廓进行编程，以获得强度与持续时间曲线，以对设备性能进行基准测试（图 8D）。该设置允许多通道记录 ECG、TTL 和 LVP（图 8E）。
  7. 更改硅膜或光点位置的位置，并重复步骤 6.3-6.6 以研究不同的起搏位置如何影响起搏波形和心脏传导（图 9A）。
  8. 确定来自每个记录位点的起搏 QRS 峰，以构建等时线或激活延迟图。确定最早的 QRS 峰值并将该位置设置为零延迟以绘制激活延迟图（图 9B-C）。
    注意：虽然窦性心律（无起搏）中的激活延迟图可以作为参考，但其模式可能会因心脏状况和 MEA 放置而显着变化18,30。当存在明确的刺激源（例如外部起搏）时，结果更有意义。

7. 在设备和心脏组织之间建立双向电接口（图 10）

  1. 以双电极配置连接刺激电极 （0.5 cm x 0.5 cm），将工作电极放在左心室壁上，而对电极放在右心室壁上。
  2. 通过恒电位仪提供方流波形（例如，1 mA、1 ms 脉冲持续时间），直到成功起搏（图 10A-B）。进行测试以获得刺激电流与脉冲持续时间和刺激电压与脉冲持续时间的关系图，以评估材料刺激效果（图 10C-D）。
  3. 使用 4 x 4 微电极阵列（电极间距为 2 mm）进行电气记录，并使用 RHD USB 接口板和 RHD 16 通道输入记录头级进行记录。在 0.1-100 Hz 带宽内以 10 kS/s 的速度记录信号。
  4. 测量每个记录电极的噪声（图 10E）。使用以下公式计算 SNR（图 10F）：
    figure-protocol-1或figure-protocol-2
    其中 Signal 是信号幅度，stdnoise 是噪声电平的标准差。在录制过程中，60 Hz 陷波滤波器处于关闭状态，以反映原始结果。
  5. 使用 Python 执行其他分析并绘制电传播的等时图。
  6. 确定每次收缩的峰值偏转时间戳（起搏 QRS 波群），并计算多个信号的平均值。使用 Gaussian 插值进行贴图渲染以提高可读性。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

使用 离体 心脏系统可以有效地验证各种光电和电子材料的刺激电生理学，该系统提供了方便且受控的设置（图 1A）。多孔硅和多孔碳等高电荷注入材料有助于以低光强度和低电压刺激进行生物电调制，确保安全和电荷平衡的电容作。

与传统硅结构（如 p-n 或 p-i-n 结）相比，纳米多孔硅表现出明显更高的光电流产生量（图 11A），因为它具有孔隙率的异质结20、增强的电荷存储容量、降低的阻抗和改进的光吸收。这些主要是电容性光电流实现生物安全、电荷平衡刺激31（图 12A-B），以 240 bpm 的速度实现离体大鼠心脏的光起搏，光强度为 0.51 mW/mm2，脉冲持续时间为 1 ms（图 8C），或低至 0.167 mW/mm2，脉冲持续时间为 10 ms（图 11B）——值与光遗传学方法相当或更低，远低于激光安全阈值31，32.低于这些强度时，可能会出现部分或不捕获光脉冲。相比之下，其他材料，例如 p-i-n 硅膜或金装饰的 p-i-n 硅膜，需要明显更高的光强度才能引发起搏（图 11B）。使用纳米多孔硅连续起搏会增加机械收缩，如 LVP 升高所示（图 8E）。此外，该设备以其整体形式展示了局部光脉冲下的高空间分辨率光电流注入，从而支持多站点和潜在的随机访问刺激研究26。

在双向、窗口形硅膜研究中（图 3D、 图 8B），多位点刺激产生不同的多电极记录曲线和心脏传导模式，验证每个刺激点的波传播原创性（图 9）。此功能突出了该系统高精度分析复杂心脏传导通路的能力，以及诊断心肌梗塞等异常心脏状况的能力。

制造的 MEA 厚度约为 10 μm，采用大孔结构或蛇形互连，以最大限度地降低弯曲刚度并提高柔韧性或可拉伸性（图 4）33,34。阵列由 16 个独立的记录站点组成，以 4 x 4 配置排列，覆盖 6 mm x 6 mm 的区域。这些芯片能够在心脏表面的多个部位直接记录心外膜信号。图 13 显示了一个具有代表性的 16 通道录音。根据记录构建的等时线图可视化了心脏表面的电传导，无论有没有局部刺激。局部刺激通常会诱导传导延迟，从而覆盖离体心脏的内在窦性节律和传导通路（图 9B）。

纳米结构碳材料具有高电荷存储容量和低阻抗，因此为提高生物电子器件性能提供了一种有效的解决方案（图 14）。我们的盐辅助激光转移方法能够轻松地将纳米多孔碳器件图案化和即时转移到柔性基板或传统 Au 电极上，以提高生物电子学性能。阻抗表征进一步证实，在与心电图信号相关的 100 Hz 频率下，碳涂层将 Au 电极的阻抗大大降低了大约 2 个数量级，从 7244.4 Ω 降低到 63.1 Ω（图 14A-B）。碳涂层后，Au 电极的亥姆霍兹电容显着增加，从 0.025 mF/cm2 增加到 1.98 mF/cm2（图 14C）。与传统的 Au 电极相比，使用这种微电容器涂层策略增加电容可以有效降低极化电压（图 14D）。

该协议建立了一个纳米多孔碳基平台，用于对心脏系统的电调制或传感进行有效的生物界面（图 10）。为了评估纳米多孔碳电子器件用于心脏刺激的性能，将 Au 或 Au-C 电极放置在左心室 （LV） 壁上，以双相方电流波形35 进行电荷注入（图 10A）。在 4 Hz 刺激 （1 mA） 下，Au 和 Au-C 电极都实现了有效的超速起搏（图 10B）。然而，在 Au-C 组中观察到明显较高的心电图振幅，表明收缩强度。两个电极都表现出刺激的阈值电流随脉冲持续时间呈指数级下降。还在各种脉冲宽度上测量了表示有效频率调制的最低电压的刺激阈值（图 10C-D）。强度-持续时间曲线使用以下公式建模：

figure-results-1

其中 I（t） 是指脉冲持续时间 （t） 下的刺激电流，Irheobase 是无限长脉冲持续时间 （rheobase） 的阈值电流，τ 是膜时间常数36。该计算利用了在 chronaxie 成功刺激所需的最低电荷，如 figure-results-2。Q分钟Au 和 Au-C 电极的值分别确定为 0.79 和 0.71 μC（图 10C）。在 4 mA/cm2 的刺激电流下，Au 和 Au-C 电极的有效刺激阈值电压分别为 1.32 V 和 0.90 V（图 10D）。阈值电压降低 30.3% 表明在长时间刺激期间氧化应激可能会降低31，从而促进更安全的生物电子应用，同时将组织损伤降至最低。此外，还开发了一种碳接枝 16 通道 Au 电极，用于增强心外膜心电图信号检测（图 10E-F）。与传统的 Au 电极相比，纳米结构碳转移显着提高了 8.0 倍的信噪比，证明了纳米多孔碳基涂层在高保真生物电子学中的有效性。

I/R 梗死模型的成功诱导在实验期间现场或实验后分别通过生理信号监测或 TTC 染色进行验证。切片和染色后，梗塞的心脏将显示一个白色区域，代表心肌损伤，对应于梗塞大小（图 7B）。相比之下，健康的心脏在染色后会缺少白色区域。在实时监测期间，成功的缺血模型将显示心率显着降低，这在 LVP 和 ECG 读数中很明显。此外，缺血性心脏的 MEA 映射将显示通过心外膜的电传导速度降低，导致延迟时间增加37 （图 7A）。

figure-results-3
图 1：协议和制造工作流程的示意图。 （A） 离体 大鼠心脏设置和设备接口的示意图。（B） 多孔硅膜的制造过程（步骤 1）。多孔硅膜的制造从 SOI 晶圆开始，其中光刻胶层通过光刻技术图案化以定义六边形特征。RIE 选择性地去除暴露的硅，然后在缓冲的 HF 中进行剥离过程以释放硅膜。膜在 HF 基溶液中进行染色蚀刻，产生纳米多孔 Si 结构。所得多孔硅膜被小心地分离并转移到 PDMS 基板上进行机械支撑。最后，等离子体处理改变了表面特性以增强光电流。（C） 柔性大孔多电极阵列的制造过程（步骤 2）。柔性 MEA 的制造从硅晶片上的 PI 涂层开始，作为柔性衬底层。使用 AZ 2020 光刻胶进行光刻印以定义电极区域。金属沉积 （Au/Ti） 通过电子束蒸发进行，以产生导电痕迹，然后使用 AZ 40XT-11D 进行另一个光刻步骤，以保护选定区域免受 RIE 的影响，形成大孔基板。SU-8 光刻和硬烘烤步骤在最终剥离过程从 Si 晶片中释放柔性 MEA 之前增加了封装。（D） 碳膜图案化和转移的工作流程（第 3 步），包括通过盐浸渍的纤维加工、通过激光合成的微加工以及从纸质基材到其他支撑物的水辅助图案转移。 图 1D 已从27 修改而来。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-4
图 2：制造器件的光学和 SEM 图像。 （A） 纳米多孔硅的横截面 SEM（顶部）和光学显微图像（底部）。（B） 具有空心（顶部）和蛇形（底部）设计的大孔多电极阵列的光学图像。（C） 碳化基材的横截面光学显微图像（上）和照片（下）。 图 2A 已从26 修改而来。 图 2C 已从27 修改。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-5
图 3：硅膜器件的 CAD 设计。 该图详细介绍了 （A） 小型、（B） 中型、（C） 大型和 （D） 开放式窗口形硅膜器件的参数。单位：mm。这个数字是从26 个修改而来的。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-6
图 4：大孔 MEA 的 CAD 设计。 （A） 空心形 MEA 的设计图纸和注释。（B） 蛇形 MEA 的设计图纸和注释。单位：mm。图 4A 已从26 修改而来。 图 4B 已从28 修改而来。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-7
图 5：用于心脏接口的碳基电极阵列的示意图和设计。 （A） 刺激电极界面的设计（步骤 3）。在典型的刺激过程中，刺激电极以双电极配置连接。工作电极（蛇形纳米多孔碳图案）放置在左心室壁上，而对电极放置在右心室壁上并连接到地面。方电流波形通过恒电位仪传输。（B） 用于碳电极掩蔽和转移的 16 通道 MEA（步骤 3）。第 1 层表示 PI 衬底上 16 通道 MEA 的 Au 图形。第 2 层表示 PET 封装膜。这个数字是从27 个修改而来的。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-8
图 6： 离体 设置和实验过程的示意图和照片描述。 （A） 用于 离体 设置的设备和工具，包括锥形瓶容器、手术器械、灌注系统和温度控制系统（步骤 4）。（B） 大鼠心脏提取工艺：用异氟醚麻醉动物;固定老鼠的手臂;打开大鼠的胸腔;收获鼠心。（C） 从提取的心脏中取出周围的脂肪组织，为实验设置做好准备。（D） 将提取的心脏连接到 离体 灌注系统。（E） 灌注设置显示连接到系统以模拟生理条件的心脏。（F） 心脏心电图记录设置。（G） 通过设置（步骤 5）演示缺血再灌注 （I/R） 过程。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-9
图 7：健康离体心脏和 I/R 心脏之间的比较。 （A） 从假健康心脏和缺血/再灌注 （I/R） 心脏记录 LVP 、 ECG 和 ECG 传播延迟。（B） 氯化三苯基四唑 （TTC） 染色的健康心脏和 I/R 心脏切片的代表性照片。白色区域表示梗死区域的大小。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-10
图 8：使用多孔硅膜和柔性 MEA 对离体大鼠心脏进行双向光电起搏和电记录。（A） 照片显示了硅膜的附着和蛇形 MEA 在心脏上硅膜旁边的放置。（B） 照片显示了安装在 Si 窗口内的开放窗口形硅膜和空心形 MEA 的附着。（C） 离体大鼠心脏上的光学起搏显示三种不同强度、240 bpm 和 1 ms 脉冲持续时间的未捕获、部分捕获和完全捕获。（D） 强度与持续时间的关系图，以评估设备的起搏阈值。（E） 在 0.24 mW/mm2 强度和 10 ms 脉冲持续时间下的光起搏曲线。图 8B-D 已从26 修改而来。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-11
图 9：双向接口中的多站点步调和映射。 （A） 起搏和记录站点的位置。（B） 等时线图显示了在开窗结构的整体 Si 器件上对 8 个不同位置进行光刺激后的电信号激活延迟。（C） 不同起搏位置的示例控制和起搏 16 通道心电图轨迹。通过刺激不同的位置，空间激活诱导了在不同记录部位的组织检测到的 QRS 演变的时间延迟。这些可以描述为激活延迟图，从而能够检查心脏表面的传导通路。这个数字是从26 个修改而来的。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-12
图 10.用于心脏刺激和记录的纳米多孔碳基生物电子学。 （A） 用于心脏刺激的多孔碳膜接枝 Au （Au-C） 电极的光学图像。插图显示了 Au 电极上蛇形结构微电容器的放大视图。（B） 离体大鼠心脏对频率为 4 Hz 的双相方电流波形刺激的心电图反应。在 4.0 mA/cm2 的相同电流密度下，心脏在 Au 或 Au-C 电极的刺激下表现出不同的心电图反应。（C） Au 和 Au-C 刺激电极的持续时间-强度曲线及其曲线拟合出现在 4 Hz 的刺激频率下。（D） 施加到电极的阈值电压，用于 Au 和 Au-C 电极在不同持续时间下进行有效刺激。（E） 用 Au 电极和 Au-C 电极设备记录的 ECG 信号的基线曲线。（F） 信噪比 （S/N） 是根据记录的心电图曲线计算得出的。插图显示了用于心电图记录的 Au 和 Au-C 电极阵列的光学图像（电极尺寸：1 mm;步骤 7.5）。这个数字是从27 个修改而来的。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-13
图 11：不同 Si 器件的光电流比较和起搏阈值评估。 （A） 四种硅基器件的光电流幅度比较。蓝色迹线表示 N = 8 个独立器件的平均光电流，叠加的灰色迹线表示单个器件的测量值。随附的条形图显示了峰值光电流值（蓝色）和积分电荷注入（橙色）。条形图表示为平均值± s.d。比例尺，10 毫秒。（B） 使用三种不同的设备进行 离体 心脏起搏。以 240 b.p.m. 的速率和 10 ms 的脉冲宽度进行起搏。这个数字是从26 个修改而来的。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-14
图 12：通过对注入和返回的电荷进行积分来表征电荷平衡。 （A） 特征光电流迹线中的充电和放电过程图示。（B） 计算电荷注入和电荷返还所涉及的总费用。结果表明，在不同的刺激持续时间下，总体上具有良好的电荷平衡。这个数字是从26 个修改而来的。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-15
图 13：16 通道 MEA 中每个电极收集的代表性电信号。 16 个通道 （Ch） 中的电信号显示离体跳动心脏的心电图 （ECG） 信息。该数字已从28 人修改。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-16
图 14.纳米多孔碳基生物电子学的电化学性质。 （A） 可激发组织和图案化碳界面之间的电化学界面。（B） 根据 A 所示电路拟合曲线的 Au 和 Au-C 电极的阻抗和相位谱。（C） 与标准 Ag/AgCl 电极相比，具有相同几何形状的 Au 和 C 图案的 CV 测量，电压范围为 -0.2 至 0.4 V。（D） 双相恒流刺激循环期间 Au 和 Au-C 电极的电压变化。这个数字是从27 个修改而来的。 请单击此处查看此图的较大版本。

复合推荐品种浓度 [mM]分子量每 1 升每 2 升
氯化钠适马 （S9625）12658.47.3614.7
氯化钾西格玛 （P4504）5.474.60.40.8
葡萄糖适马 （G7021）101801.83.6
HEPES 系列西格玛 （H4034）102382.3834.766
氯化镁2.7 小时2O适马 （M9272）12031 毫升2 毫升
库存 1 M库存 1 M
氯化钙2.2H2O适马 （C3881）21471 毫升2 毫升
库存 2 M库存 2 M
NaH2PO4西格玛 （S0751）0.391201 毫升2 毫升
库存 0.39 M库存 0.39 M

表 1：HEPES Tyrode 的解决方案组件。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该协议引入了 离体 大鼠心脏平台（图 1A）和 I/R 模型，以提供快速方便的器官水平电生理学研究，以配合生物电子学中快速增长的研究工作和需求38。它详细介绍了三种器件系统的制造和验证，即纳米多孔硅、柔性多电极阵列和纳米多孔碳（图 1B-D）， 作为双向电生理询问的基准。纳米多孔硅可实现低强度、电容和高时空起搏，灵活的多电极阵列可实现心外膜活动的多通道记录和映射，纳米多孔碳在与 MEA 结合使用时会导致低电压刺激和高 SNR记录 27。

光学起搏之前已使用光遗传学进行了证明，这种方法需要基因修饰才能在靶组织中表达光敏离子通道33。虽然有效，但由于需要病毒载体或转基因方法，光遗传学带来了极大的复杂性，引发了安全、伦理和监管问题，尤其是对于临床应用。相比之下，基于半导体的非遗传生物刺激提供了一种更简单、转化更可行的替代方案 39,40,40,42。硅和其他有机半导体等材料能够对组织进行直接光电调节，而不会发生基因改变，利用电容光电流实现生物安全和电荷平衡刺激。这种方法在起搏强度方面实现了与光遗传学相当甚至更好的性能，远低于激光安全阈值，以最大限度地减少组织损伤31,32（图 8）。基于半导体的生物刺激的非遗传性质消除了与基因改造相关的障碍，为在临床环境中的广泛采用以及组织工程和生物电子医学的多样化应用铺平了道路。然而，需要仔细设计这些设备以与组织整合，其中需要仔细考虑生物相容性，以及用于有效刺激和记录的接口位置（图 8A-B）。此外，组织表面存在的材料可能会阻碍实时成像的可能性，除非可以将设备设计为对某些显像剂的激发-发射窗口透明。

纳米多孔硅在半导体光刺激器中脱颖而出，因为它不需要人工返回电极，这与以前报道的材料不同26。这种独特的特性源于它能够根据光斑大小和位置形成空间分辨的阴极和阳极区域。发光表面用作阴极注入部位，而周围的外围区域则促进阳极电流返回。这种机制可以在整体、无像素的膜上进行多位点刺激，从而实现精确和局部的刺激。值得注意的是，局部光刺激，而不是全局照明，对于创建有效的双极刺激曲线至关重要。此外，设备大小会显著影响性能;较大的器件在相同的刺激条件下产生更高的电流，进一步增强了其功能的多功能性。

光学起搏的失败可能由多种因素引起，即使在健康的生物模型中也是如此，主要与设备完整性和生物界面耦合有关。首先，在心脏刺激之前，彻底的光电流表征至关重要。长期储存后的材料降解43 氧化物钝化、染色蚀刻过程中的过度蚀刻、处理或转移过程中的器件断裂或接口期间不正确的器件方向都可能产生低于预期的光电流。为了减轻机械损伤，PDMS 被用作容纳纳米多孔硅膜的软基材，防止用镊子直接处理的潜在损坏。其次，与心外膜建立无缝接口，在此设置中灌注生物流体，是必不可少的。较厚的生物流体层会阻碍正确的附着并损害起搏效率。为了增强生物界面耦合，可以采用生物粘合剂42,43 或缝合来稳定连接并确保可靠的刺激。值得注意的是，我们研究中使用的纳米多孔硅是可生物降解的，支持临时起搏应用，但在生理条件下，性能会在 1-2 天内下降。为了获得更长期的稳定性，应考虑表面钝化44 或使用更耐用的半导体材料。

在离体起搏期间，在较高频率（例如，4 Hz）下 LVP 逐渐增加（图 8E）可能是由于心肌收缩力增强、钙积累和 Frank-Starling 机制45 的结果。起搏率升高可改善细胞内钙循环和心室充盈动力学，增加前负荷和收缩强度46。虽然这可能会增加心肌需氧量和心律失常风险，但这些影响可以通过充分的预氧合、密切的心电图监测和控制起搏参数来减轻。在我们的实验中，没有观察到明显的不良反应。

在多电极记录中，指定心脏上的电极位置及其与起搏电极的相对位置对于有意义的分析至关重要。必须消除电极之间的串扰，以确保捕获不同的波形和时间分辨模式。柔性电极阵列通常与心外膜建立良好的界面;然而，使用离子导电胶粘剂涂层（例如薄水凝胶层28,43）可以进一步增强粘附力，以提高稳定性和信号质量。

纳米结构石墨烯/碳材料具有大面积的电荷存储和注入表面积，可以通过降低电极-盐水结处的阻抗和增加电荷注入能力来提高生物电子设备的性能35。目前将石墨烯材料图案化到柔性电极（例如 Au）上的方法包括电沉积、旋涂和丝网印刷47。然而，这些方法通常与复杂的制造工艺、有限的图形化能力以及由于粘合剂的死体积而导致的性能降低有关。利用激光合成方法在纤维素衬底上生成纳米结构碳图案，然后将它们转移到其他软膜上以产生柔顺的生物界面，这为生物电子学制造提供了一种简单有效的方法。具有小几何尺寸的图案碳涂层的结合，低至单细胞水平，这将增加局部电场，而碳膜的高度多孔结构将降低电极-组织界面的电阻，将在未来协同实现高效的生物刺激和记录48。

虽然 Langendorff 离体 I/R 模型是一种方便的疾病模型，但它缺乏全身相互作用，将心脏与神经激素和免疫反应隔离开来，并依赖于缓冲液的人工灌注，这可以改变氧输送和内皮功能等生理状况。其有限的活力将研究局限于急性事件。尽管如此，该模型提供了一个高度受控的环境，具有精确的参数调整和良好的可重复性。它还支持实时心脏功能测量，使其成为探索缺血性心脏病新治疗策略的宝贵工具。例如，可以设想电设备来预处理心脏，训练它承受严重的活性氧 （ROS） 环境，或降低 ROS 水平以促进恢复。这种治疗的疗效可以通过心跳模式、心电图波形和传导速度等指标来评估。此外，多站点刺激平台可以提供有关心肌梗死的空间信息，从而能够对受影响的区域进行更详细的评估。这种方法还可以证明与梗塞严重程度相关的刺激阈值的改善，为治疗评估和优化提供了一个全面的框架。

虽然该协议强调了这三种设备在双向 离体 心脏模型中的使用，但它们的适用性远远超出了心脏组织。这些设备可以很容易地适应其他电可激发的组织或器官，例如神经组织、骨骼肌和胃肠道系统，在这些组织中，精确的电调制至关重要，使其成为生物电子医学研究和转化应用的多功能工具。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P.L. 和 B. T. 申请了纳米多孔硅器件制造和应用的专利。P.L.， C. Y. 和 B. T. 申请了纳米多孔碳器件制造和应用的专利。P. L. 和 B.T. 申请了柔性微电子阵列制造和应用的专利。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项研究得到了美国国立卫生研究院通过赠款 1R56EB034289-01 和 1R01EB036091-01 和美国陆军研究办公室通过赠款 W911NF-24-1-0053 的财政支持。P. L. 感谢 Grier 生物物理科学创新奖给予的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
16 通道头台Intan 技术C3334型
2,3,5-三苯基四唑氯化物西格玛·奥尔德里奇T8877-5G三苯基四唑氯化物
2-丙醇 （IPA） 费舍尔科学A451-4
635 nm 激光器，500 mW激光发光那
丙酮费舍尔科学答18-4
埃 Evovac 电子束蒸发器埃那
AZ 300MIF 开发人员微化学品18441123163开发 人员
亚利桑那州 nlof 2020 微化学品1A002020
亚利桑那州 NMP 微化学品那光刻胶去除剂
AZ40XT-11D 微化学品1000300光刻 胶
缓冲HFThermo ScientificAA44627K2
氯化钙2.2H2O西格玛·奥尔德里奇（C3881）
CO2激光器 通用激光系统VLS 4.60
导电银漆佩尔科16062电极与连接铜线之间的导电附着力
铜线封装 0.1 毫米亚马逊河https://www.amazon.com/Enameled-Temperature-Resistance-Transformers-Inductors/dp/
B09TNM51S5/ref=asc_df_B09
TNM51S5？mcid=155de761ea4
c389ea86d45ba61a83e8d&标签
=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid
=693675076770&hvpos=&hvnetw
=g&HVRand=664358781094905
4431&hvpone=&hvptwo=&hvqmt
=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint
=&hvlocphy=9021716&hvtargid=
PLA-1878323158943&PSC = 1
Digidata 1550 数字化仪分子器件那
葡萄糖西格玛·奥尔德里奇G7021型
HBSS，无钙，无镁，无酚红Thermo Scientific14175095
海德堡 MLA150 直写器海德堡那
肝素 （1000 IU/kg）Sagent 制药1009655
HEPES的西格玛·奥尔德里奇（H4034）
己烷 西格玛·奥尔德里奇52750-10毫升溶剂
高频费雪科学A513-500微量金属级
HMDS 蒸汽主蒸烤箱产量工程系统那
HNO3费雪科学A509P500微量金属级
热覆膜机办公仓库L410-A多层封装
Intan RHD 系统Intan 技术C3100型
iWorx 心电图iWorx IA-400D型
iWorx LVD 探头iWorxBP-100型
iWorx 前置放大器iWorxC-ISO-256 标准
氯化钾西格玛·奥尔德里奇（第 4504 页）
乳胶气球（4 号）拉德诺蒂170404
镁2.7H2O西格玛·奥尔德里奇（M9272）
氯化钠西格玛·奥尔德里奇（S9625）
含有Nafion 117的溶液西格玛·奥尔德里奇31175-20-9纳米多孔碳图案的固定试剂
氢化钠2PO4西格玛·奥尔德里奇（S0751）
钠西格玛·奥尔德里奇221465
PDMS的费雪科学NC9285739
Plasma-Therm 电感耦合等离子体氟化物蚀刻仪等离子热那
PMMA （495 A6） 微化学品M130006
聚（焦苯二酐-Co-4,4'-羟二苯胺）西格玛·奥尔德里奇575801PI前体
聚乙烯-共醋酸乙烯酯西格玛·奥尔德里奇437247-250克渗透用聚合物
聚乙烯醇西格玛·奥尔德里奇341584-25克
聚对苯二甲酸乙二醇酯 （PET）亚马逊河KS-6304-21-11D 型透明 PET 片材 .0005“ 厚 x 27” 宽 x 10 英尺 长 1 件
恒电位仪生物SP-200型电刺激
抗蚀烤箱 寄发LCC1-15-5
扫描电子显微镜卡尔蔡司梅林形态表征仪器
硅片 NOVA电子材料HS39626
有机硅胶粘剂世平指数KWIK-SIL-S型封装
硼砂西格玛·奥尔德里奇SX0355型
SOI晶圆Ultrasil3-10541类型-方向：P/B（100） DT：7+/-1um DR：<.005欧姆 HT：300+/-10um HR：1-30 欧姆箱：1um+/-5% UD-13998/UH-13962
SU-8 2002微化学品SU-8 2000 系列
SU-8显影剂微化学品SU-8 2000 系列
湿纸巾粘合剂3M1469SB的
Whatman 定性滤纸，1 级西格玛·奥尔德里奇WHA1001150碳图案化基材

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sunwoo, S. H., et al. Soft bioelectronics for the management of cardiovascular diseases. Nat Rev Bioeng. 2 (1), 8-24 (2024).
  2. Choi, H., et al. Adhesive bioelectronics for sutureless epicardial interfacing. Nat Elect. 6 (10), 779-789 (2023).
  3. Choi, Y. S., et al. Fully implantable and bioresorbable cardiac pacemakers without leads or batteries. Nat Biotech. 39 (10), 1228-1238 (2021).
  4. Cingolani, E., Goldhaber, J. I., Marbán, E. Next-generation pacemakers: from small devices to biological pacemakers. Nat Rev Cardiol. 15 (3), 139-150 (2018).
  5. Sala, L., Ward-van Oostwaard, D., Tertoolen, L. G. J., Mummery, C. L., Bellin, M. Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs). J Vis Exp. (123), e55587(2017).
  6. Fiegle, D. J., Volk, T., Seidel, T. Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices. J Vis Exp. (159), e61167(2020).
  7. Alam, P., Maliken, B. D., Ivey, M. J., Jones, S. M., Kanisicak, O. Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes. J Vis Exp. (164), e61073(2020).
  8. Nippert, F., Schreckenberg, R., Schlüter, K. D. Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes. J Vis Exp. (128), e56634(2017).
  9. Trayanova, N. A. Whole-Heart Modeling: Applications to Cardiac Electrophysiology and Electromechanics. Circ Res. 108 (1), 113-128 (2011).
  10. Yin, R. T., et al. Open thoracic surgical implantation of cardiac pacemakers in rats. Nat Protoc. 18 (2), 374-395 (2023).
  11. Wu, K., et al. Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice. J Vis Exp. (171), e62514(2021).
  12. Pendexter, C. A., et al. Modified Langendorff Perfusion for Extended Perfusion Times of Rodent Cardiac Grafts. J Vis Exp. (208), e66815(2024).
  13. Kałużna, E., Nadel, A., Zimna, A., Rozwadowska, N., Kolanowski, T. Modeling the human heart ex vivo-current possibilities and strive for future applications. J Tissue Eng Regenerat Med. 16 (10), 853-874 (2022).
  14. Jiang, Y. W., et al. Topological supramolecular network enabled high-conductivity, stretchable organic bioelectronics. Science. 375 (6587), 1411-1417 (2022).
  15. Driscoll, N., et al. MXene-infused bioelectronic interfaces for multiscale electrophysiology and stimulation. Sci Transl Med. 13 (612), eabf8629(2021).
  16. Gablech, I., Głowacki, E. D. State-of-the-Art Electronic Materials for Thin Films in Bioelectronics. Adv Elect Mater. 9 (8), 2300258(2023).
  17. Cho, Y. H., Park, Y., Kim, S., Park, J. 3D Electrodes for Bioelectronics. Adv Mater. 33 (47), 2005805(2021).
  18. Chen, Z., et al. bioresorbable, transparent microelectrode arrays for multimodal spatiotemporal mapping and modulation of cardiac physiology. Sci Adv. 9 (27), eadi0757(2023).
  19. Jiang, Y. W., et al. Rational design of silicon structures for optically controlled multiscale biointerfaces. Nat Biomed Eng. 2 (7), 508-521 (2018).
  20. Prominski, A., et al. Porosity-based heterojunctions enable leadless optoelectronic modulation of tissues. Nat Mater. 21 (6), 647-655 (2022).
  21. Huang, Y. X., et al. Bioresorbable thin-film silicon diodes for the optoelectronic excitation and inhibition of neural activities. Nat Biomed Eng. 7 (4), 486-498 (2023).
  22. Balamur, R., et al. Capacitive and Efficient Near-Infrared Stimulation of Neurons via an Ultrathin AgBiS2 Nanocrystal Layer. ACS Appl Mater Inter. 16 (23), 29610-29620 (2024).
  23. Karatum, O., Kaleli, H. N., Eren, G. O., Sahin, A., Nizamoglu, S. Electrical Stimulation of Neurons with Quantum Dots via Near-Infrared Light. ACS Nano. 16 (5), 8233-8243 (2022).
  24. Han, M., et al. Photovoltaic neurointerface based on aluminum antimonide nanocrystals. Comm Mater. 2 (1), (2021).
  25. Ejneby, M. S., et al. Chronic electrical stimulation of peripheral nerves via deep-red light transduced by an implanted organic photocapacitor. Nat Biomed Eng. 6 (6), 741-753 (2022).
  26. Li, P., et al. Monolithic silicon for high spatiotemporal translational photostimulation. Nature. 626 (8001), 990-998 (2024).
  27. Yang, C., et al. A bioinspired permeable junction approach for sustainable device microfabrication. Nat Sustain. 7 (9), 1190-1203 (2024).
  28. Shi, J., et al. Monolithic-to-focal evolving biointerfaces in tissue regeneration and bioelectronics. Nat Chem Eng. 1 (1), 73-86 (2024).
  29. Shi, J., et al. Active biointegrated living electronics for managing inflammation. Science. 384 (6699), 1023-1030 (2024).
  30. Zhang, L., et al. Marangoni Effect-Driven Motion of Miniature Robots and Generation of Electricity on Water. Langmuir. 33 (44), 12609-12615 (2017).
  31. Cogan, S. F. Neural Stimulation and Recording Electrodes. Ann Rev Biomed Eng. 10 (1), 275-309 (2008).
  32. Nussinovitch, U., Gepstein, L. Optogenetics for in vivo cardiac pacing and resynchronization therapies. Nat Biotechnol. 33 (7), 750-754 (2015).
  33. Hsueh, B., et al. Cardiogenic control of affective behavioural state. Nature. 615 (7951), 292-299 (2023).
  34. Tian, B. Z., et al. Macroporous nanowire nanoelectronic scaffolds for synthetic tissues. Nat Mater. 11 (11), 986-994 (2012).
  35. Fang, Y., et al. Micelle-enabled self-assembly of porous and monolithic carbon membranes for bioelectronic interfaces. Nat Nanotechnol. 16 (2), 206-213 (2021).
  36. Kay, G. N., Shepard, R. B. Stimulation and Excitation of Cardiac Tissues. Clin Cardiac Pacing Defibrillat Resynchronizat Ther. , 61-113 (2017).
  37. Zhang, J., et al. Gold-modified nanoporous silicon for photoelectrochemical regulation of intracellular condensates. Nat Nanotechnol. , (2025).
  38. Li, P., Kim, S., Tian, B. Beyond 25 years of biomedical innovation in nano-bioelectronics. Device. 2 (7), 100401(2024).
  39. Yang, C., Cheng, Z., Li, P., Tian, B. Exploring Present and Future Directions in Nano-Enhanced Optoelectronic Neuromodulation. Acc Chem Res. 57 (9), 1398-1410 (2024).
  40. Prominski, A., Li, P., Miao, B. A., Tian, B. Nanoenabled Bioelectrical Modulation. Acc Mater Res. 2 (10), 895-906 (2021).
  41. Li, P., Kim, S., Tian, B. Nanoenabled Trainable Systems: From Biointerfaces to Biomimetics. ACS Nano. 16 (12), 19651-19664 (2022).
  42. Majmudar, A., Kim, S., Li, P., Tian, B. Perspectives on non-genetic optoelectronic modulation biointerfaces for advancing healthcare. Med-X. 2 (1), 18(2024).
  43. Hwang, S. W., et al. A Physically Transient Form of Silicon Electronics. Science. 337 (6102), 1640-1644 (2012).
  44. Yu, Y., et al. Enhanced photoelectrochemical efficiency and stability using a conformal TiO2 film on a black silicon photoanode. Nat Ener. 2 (6), 17045(2017).
  45. Kosta, S., Dauby, P. C. Frank-Starling mechanism, fluid responsiveness, and length-dependent activation: Unravelling the multiscale behaviors with an in silico analysis. PLoS Computat Bio. 17 (10), e1009469(2021).
  46. Silverman, D. N., et al. Heart Rate-Induced Myocardial Ca2+ Retention and Left Ventricular Volume Loss in Patients With Heart Failure With Preserved Ejection Fraction. J Am Heart Assoc. 9 (17), e017215(2020).
  47. Zeng, M., et al. Printing thermoelectric inks toward next-generation energy and thermal devices. Chem Soc Rev. 51 (2), 485-512 (2022).
  48. Rastogi, S. K., et al. Remote nongenetic optical modulation of neuronal activity using fuzzy graphene. Proc Natl Acad Sci. 117 (24), 13339-13349 (2020).

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