微型中风小鼠模型中神经免疫相互作用的分离与流式细胞术评估

摘要

本文介绍了一种在轻度卒中模型中利用流式细胞术分析评估缺血性卒中后免疫细胞功能的实验方案。该方法可实现对神经免疫相互作用的详细研究，并可适用于其他神经退行性疾病的探索，从而加深我们对卒中病理过程中免疫应答机制的理解。

摘要

脑卒中是全球范围内导致死亡和长期残疾的主要原因，其中缺血性脑卒中占大多数病例。在发生缺血性脑卒中后，常驻和浸润的免疫细胞被激活，进而加剧神经元损伤。然而，免疫系统在缺血性脑卒中病理过程中的作用尚未完全阐明，这主要归因于神经炎症过程中免疫反应对微环境变化所表现出的复杂且动态的调控机制。因此，对缺血性脑卒中后不同时相点常驻和浸润免疫细胞的活化状态进行监测与分析至关重要。本研究介绍了一种在轻度脑卒中模型中利用流式细胞术分析这些免疫细胞功能的实验方案。我们在特定时间点显微解剖梗死脑组织，随后通过机械和酶消化方法将其解离为单细胞悬液。细胞经70 µm细胞筛过滤后，使用荧光标记的抗体混合物进行染色，再通过流式细胞术进行定量分析。尽管该检测方法最初专为研究缺血性脑卒中后的神经免疫相互作用而设计，但也可便捷地拓展应用于多发性硬化、帕金森病和阿尔茨海默病等其他神经退行性疾病中的神经免疫机制研究。

引言

脑卒中是全球范围内导致死亡和长期残疾的主要原因，其中缺血性脑卒中占绝大多数病例^1,2,3。本方法的总体目标是通过提供一种改进的方法来评估小型卒中鼠模型中常驻和浸润性免疫细胞的活化状态，从而加深我们对缺血性脑卒中后发生的神经免疫相互作用的理解^4,5。这些免疫细胞与神经元微环境之间的复杂相互作用对于理解缺血性脑卒中的病理生理机制至关重要。然而，由于神经炎症所触发的免疫反应具有动态性和多面性，这些神经免疫相互作用背后的精确机制仍不清楚⁶。该技术旨在阐明在神经炎症背景下免疫反应的复杂动态过程，及其对神经元损伤和恢复结局的后续影响。

该技术的开发依据源于免疫细胞在缺血事件后加剧神经元损伤并影响恢复过程中的关键作用。传统研究这些相互作用的方法往往缺乏捕捉免疫细胞活化时空细微变化所需的分辨率。通过采用流式细胞术分析来自显微解剖的梗死脑组织所制备的单细胞悬液，本方案能够更详细、动态地评估随时间变化的免疫细胞谱型^7,8。该方法可识别特定的免疫细胞群体及其功能状态，这对于理解缺血性脑卒中的病理生理机制至关重要。

与组织学染色或批量RNA测序等其他技术相比，这些方法可能难以明确区分不同免疫细胞类型的个体贡献，而该流式细胞术方法具有多项优势。例如，既往研究表明，流式细胞术能够同时高通量分析多个标志物，从而更全面地表征免疫细胞的表型与功能^{9,10,11,12,13}。此外，该方法可适用于多种神经退行性疾病——如多发性硬化、帕金森病和阿尔茨海默病——表明其在研究神经免疫相互作用的广泛文献中具有高度的通用性与相关性。

对于考虑应用本方法的研究人员而言，评估其研究的具体目标至关重要。该技术特别适用于需要在缺血性脑卒中或相关神经退行性疾病背景下对免疫反应进行详细时间过程分析的研究。建议使用者具备流式细胞术的基础知识以及小鼠模型的操作经验，以有效实施本方案并正确解读所得数据。通过为研究神经免疫相互作用提供一个可靠的框架，该方法对深入阐明免疫系统在脑卒中病理过程中的复杂作用做出了重要贡献。

方案

所有动物实验均经首都医科大学附属北京友谊医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。建议所有溶液均经过无菌过滤，所使用的所有试管均应为无菌的。

1. 准备试剂和缓冲液

1. 消化酶混合液：将胶原酶IV溶解至终浓度为0.25%，并将DNase I稀释至终浓度为2 U/mL。
2. 磁性激活细胞分选（MACS）缓冲液：将牛血清白蛋白（BSA）和乙二胺四乙酸（EDTA）分别溶解于1×PBS中，使其终浓度达到0.5%和2 mM。

2. 局灶性缺血性脑卒中模型

注意：采用 C57BL/6 J 小鼠（8–10 周龄）建立局灶性缺血性脑卒中模型，方法如前所述¹⁴。也可使用其他有充分文献记录、适用于啮齿类动物的药用级注射用麻醉剂。

1. 使用3%异氟烷（氧气流速为0.8–1.0 L/min）诱导小鼠麻醉，随后以1.5%异氟烷维持麻醉。整个手术过程中使用加热垫将体温维持在37 °C。
   注意：本研究强调在切口前必须确认麻醉动物已达到外科麻醉深度。可通过用力捏压后肢脚趾，评估其足部回缩反射是否存在；若无反应，则表明动物已充分麻醉。
2. 使用电动剃刀修剪右眼与右耳之间的毛发。通过以氯己定和酒精交替环形擦拭至少三次，确保皮肤无菌。在切口前，皮下注射5 mg/kg美洛昔康和3.25 mg/kg缓释型丁丙诺啡。切口前沿切口线皮内注射最多4 mg/kg利多卡因（用生理盐水稀释）。然后在眼睛表面涂抹眼用润滑剂以防止角膜干燥，并在解剖显微镜下于眼部附近指定区域做一条0.5 cm的垂直切口。
3. 轻柔分离所有组织以暴露颅骨，并识别右侧大脑中动脉（MCA）的远端分支，其特征为垂直的"Y"形血管结构。使用电钻穿透颅骨，并小心地将其移除。
4. 使用显微镊子轻柔切除脑膜。
5. 暴露右侧大脑中动脉（MCA）的远端分支，随后使用10-0不可吸收聚丙烯缝线对右侧MCA远端分支进行永久性结扎，先打双结再加一个反向结固定，随后剪除缝线多余部分。
6. 将组织复位至原始位置，并用4-0尼龙缝线缝合面部皮肤切口。
7. 将小鼠置于仰卧位，使用电动剃刀修剪颈部区域的毛发。通过以氯己定和酒精交替环形擦拭至少三次，确保皮肤无菌。
8. 在颈部区域做一横向切口，轻柔分离下颌下腺。简要而言，使用手术刀在皮肤上精准地做一横向切口，以便于观察中线两侧的下颌下腺。随后借助镊子和钝头剪刀小心进行钝性解剖，暴露其下方的颈总动脉。
9. 使用显微镊子仔细分离颈动脉鞘，识别颈总动脉并将其与迷走神经分离。
10. 将4-0尼龙缝线穿过颈总动脉，并用滑结固定。
11. 在对侧颈总动脉重复步骤10。双侧颈总动脉（CCAs）暂时性阻断7分钟。
12. 将下颌下腺组织复位至原始位置，并使用组织粘合剂闭合颈部切口。
    注意：假手术组接受与卒中组完全相同的操作，唯一区别在于远端MCA和 CCA未进行结扎。
13. 在整个手术过程中及术后持续监测小鼠的呼吸和体温。将小鼠放置于无垫料的笼子中，一半身体位于加热垫上，维持此状态直至其完全清醒。为减轻不适，术后最初48小时内给予0.05 mg/kg丁丙诺啡。

3. 脑灌注与解剖

1. 准备一个50 mL注射器，并在其末端连接一根26 G针头。用生理盐水充满注射器。
2. 使用3%异氟烷对小鼠进行深度麻醉，随后通过二氧化碳窒息实施安乐死。
   注意：本研究强调必须确保麻醉动物已达到外科手术麻醉水平，方可进行任何切口操作。可通过用力夹捏后肢脚趾，评估其足部回缩反射，以确认无任何反应。若未观察到任何反应，则可判定动物已充分麻醉。
3. 将小鼠仰卧位固定于泡沫板上，伸展其前肢和后肢，并用26 G针头将其固定。
4. 待小鼠完全麻醉后，用有齿镊夹住腹部皮肤，做一侧向切口以暴露肝脏。随后沿肋骨两侧剪开，以暴露心脏。
5. 将26 G针头插入左心室，并剪断右心耳，然后推动注射器使血液流出。
6. 继续灌注过程，直至从心耳流出的液体变得澄清透明。
7. 使用直手术剪剪断颈椎，将小鼠断头。
8. 在头部皮肤上做一由后向前的切口以暴露颅骨。在颅侧壁与颅底交界处做两个侧向切口。
9. 沿矢状缝剪开颅骨，并在两眼眶之间做一切口。
10. 用镊子移除覆盖每个半球的颅骨，暴露脑组织，并将其转移至小鼠钢制脑切片模具中。随后将脑组织连续切成厚度为2 mm的冠状切片。

4. 将皮质组织消化成单细胞悬液及用于流式细胞术的抗体染色

1. 向12孔板的每个孔中加入500 µL消化酶混合液。
2. 使用显微镊子小心分离梗死组织，并将其转移至消化酶混合液中（图1）。
3. 用眼科剪将组织精细剪碎至尽可能小的片段，并在37 °C下孵育20分钟。
4. 使用P1000移液器轻柔地将溶液吹吸10次，以使组织解离为单个细胞，随后将溶液通过70 µm细胞滤筛。持续用含钙和镁的冰冻HBSS冲洗12孔板和细胞滤筛。
5. 在4 °C下以500 × g离心5分钟，然后小心弃去上清液。
   注意：由于形成的沉淀较为疏松且易脱落，请避免扰动沉淀，以防细胞损失。
6. 将沉淀重悬于1 mL 1x PBS中，并重复步骤5。随后将沉淀重悬于150 µL 1x PBS中，将悬液转移至圆底96孔板中，再于4 °C下以500 × g离心5分钟。
7. 牢固握住96孔板，迅速倒置以弃去上清液。
8. 将细胞活力荧光染料按1:100比例用1x PBS稀释，然后将沉淀重悬于150 µL该稀释液中。室温（RT）避光孵育10分钟。
9. 在4 °C下以500 × g离心5分钟，弃去上清液。用MACS缓冲液稀释细胞表面抗体混合液。无需洗涤细胞，直接加入细胞表面抗体混合液，在4 °C下继续孵育15–20分钟。
10. 在4 °C下以500 × g离心5分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于150 µL MACS缓冲液中。
11. 重复步骤4.10，并将悬液转移至1.5 mL离心管或5 mL圆底聚苯乙烯试管中。

5. 流式细胞术分析与分选

1. 根据仪器配置，使用手动方法或在线设计工具设计多色流式细胞术检测方案，以优化与抗体偶联的荧光染料的选择，并最大限度减少光谱重叠。
   注意：设计多色流式细胞术检测方案时，必须考虑若干关键因素。首先，在开始之前，必须熟悉所用仪器的配置，包括激光器和滤光片。其次，对于低丰度抗原，应选用亮荧光染料标记的抗体；而对于高表达抗原，则应选用弱荧光染料标记的抗体。最后，必须在检测方案中包含细胞活力染料，以有效排除非活细胞和碎片。值得注意的是，为确保对低丰度或特征不明确的抗原进行适当的设门分析，应使用单荧光减一（FMO）对照¹⁵。FMO对照包含除目标标记物外的所有谱系标记物，有助于精确区分阳性与阴性染色细胞¹⁶。
2. 调整前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）检测器的设置，确保目标细胞在图谱上适当显示，并可根据需要进行设门。
3. 仔细优化FSC和SSC参数，以消除碎片或额外噪声。在同时显示FSC面积和高度的散点图中，区分双联体与单细胞。根据细胞活力荧光染料阴性信号分离活细胞。
   注意：不同仪器的设置可能存在轻微差异。例如，某些细胞分选仪使用FSC的宽度和高度来区分双联体与单细胞，而其他仪器则使用FSC的面积和高度实现相同目的。
4. 调整每个通道的补偿。
   注意：可用于荧光溢出补偿的材料包括细胞样本和市售的补偿微珠。
   1. 将自发荧光对照（未染色细胞）与染色细胞的阳性对照进行比较，确保染色细胞在各参数上的信号处于适当比例。此外，通过分析多色细胞样本、观察双色散点图，并上下调整补偿设置，确保细胞群在图中彼此垂直或水平对齐。
   2. 利用CD45和CD11b信号区分淋巴细胞（CD11b^-CD45^high）、小胶质细胞（CD11b⁺CD45^int）、髓系细胞（CD11b⁺CD45^high）和星形胶质细胞（CD11b^-CD45^- GLAST⁺）^17,18。
   3. 使用假手术脑组织作为自发荧光对照及区分淋巴细胞的参考。若正在检测特定目标，应使用卒中后脑组织制备FMO对照。
5. 开始采集对照和样本数据，并确保保存数据。
   注意：由于本文所述的微小卒中模型通常导致较小的梗死灶，所收集的细胞数量通常少于大脑中动脉闭塞（MCAO）模型。一般而言，收集5 × 10⁵个细胞可分别获得约5 × 10³个小胶质细胞和1 × 10⁵个星形胶质细胞。
6. 选择并分选目标细胞群至5 mL圆底聚苯乙烯试管或15 mL锥形离心管中。
   注意：加入500 µL PBS，并仔细冲洗试管，以确保细胞活性并促进细胞沉淀形成。

6. 特定细胞群体中基因表达的分析

注意：总 RNA 提取也可使用商业试剂盒，并按照制造商的说明书进行。

1. 将第5.6步 的细胞在4 °C条件下以500 × g离心3 min，弃去上清液。用1 mL TRIzol试剂重悬细胞。
   注意：分选获得的细胞数量相较于培养细胞或组织明显较少。因此，较高的离心速度可能有助于形成更紧密的细胞沉淀。本步骤获得的细胞可用于后续应用，例如细胞培养或单细胞RNA测序流程。
2. 将样品在室温下静置5 min，以促进核蛋白复合物的解离。
3. 向样品中加入0.2 mL氯仿，密封管盖。剧烈振荡15 s，然后在室温下孵育2 min。
4. 在4 °C条件下以10,000 g离心15 min。RNA将仅存在于上层水相中。
5. 小心地将上层水相转移至洁净离心管中，注意不要扰动界面。
   注意：水相体积应约为500 µL。
6. 通过加入0.5 mL异丙醇并反复倒置混匀数次，使RNA从水相中沉淀出来。将样品在室温下孵育10 min。
7. 在4 °C条件下以10,000 g离心10 min，以收集RNA沉淀。
8. 倒出上清液，并通过抽吸彻底去除残留液体。
9. 用75%乙醇洗涤RNA沉淀一次，加入至少1 mL的75%乙醇。充分混匀样品后，在4 °C条件下以7500 × g离心5 min。
10. 彻底去除所有残留的乙醇。将RNA沉淀在空气中干燥5 min。
11. 通过反复吹打，用10 µL无RNase的水溶解RNA。
12. 按照制造商说明书进行实时PCR分析。

结果

本研究中，我们提出了一种改进的实验方案，用于在小卒中模型中通过流式细胞术分析评估缺血性卒中后免疫细胞的功能。小卒中模型通过永久结扎右侧大脑中动脉（MCA）远端分支，随后对双侧颈总动脉（CCAs）进行7分钟的闭塞来建立。该方法可诱导出一种病灶体积小且稳定、死亡率极低的轻度卒中。此外，该模型具备研究长期神经免疫相互作用的能力，因此特别适用于探究炎症在卒中后恢复过程中的作用。

小胶质细胞诱导的神经炎症在缺血性脑卒中的病理生理过程中占据核心地位¹⁹。为了阐明缺血性脑卒中后小胶质细胞转录组的动态变化，我们首先通过流式细胞术分离小胶质细胞，并利用实时PCR确认其纯度。图2展示了在脑卒中后第1天代表性卒中动物中所采用的设门策略（图2A），以及对小胶质细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞标志物基因表达的实时PCR验证结果（图2B）。结果显示，与星形胶质细胞、神经元及少突...

讨论

本研究中，我们介绍了一种利用微型卒中模型进行流式细胞术分析，以评估缺血性脑卒中后免疫细胞功能的详细实验方案。该方案的关键步骤包括：通过永久性结扎右侧大脑中动脉（MCA）远端分支，同时阻断双侧颈总动脉（CCAs）7分钟，建立局灶性缺血性脑卒中模型。该手术方法可诱导轻度脑卒中，具有稳定的病灶体积和较低的死亡率，适用于长期研究神经免疫相互作用¹⁴。手术操作必须精确执行，因为任何变异均可能导致脑卒中严重程度不一致，从而影响后续免疫学评估结果的有效性²⁴。

为了优化细胞解离和纯化，需要对本文所述技术进行改进。在制备显微解剖获得的梗死脑组织单细胞悬液时，联合使用机械法和酶解法对于确保较高的细胞得率和存活率至关重要。具体而言，在消化酶混合物中联合使用胶原酶IV和DNase I，可有效降解细胞外基质成分，同时最大限度减少细胞死亡²⁵。此外，在离心步骤中还需进行问题排查，因为离心速度和时间的变化会影响细胞沉淀的紧密程度和纯度。我们发现，将离心条件调整为500...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	NEST	615601	实验材料
1× PBS	Corning	21-040-CM	试剂
96孔透明圆底TC处理微孔板	Corning	3799	实验材料
APC抗小鼠CD19抗体	Biolegend	152410	抗体
APC/Cyanine7抗小鼠CD45抗体	Biolegend	103116	抗体
Avertin (1.25%)	Nanjing Aibei Biotechnology	M2920	试剂
BD FACSAria II	BD	642510	设备
Brilliant Violet 421抗小鼠CD4抗体	Biolegend	100437	抗体
Brilliant Violet 605抗小鼠/人CD11b抗体	Biolegend	101237	抗体
BSA	Sigma-Aldrich	A1933-1G	化学品
胶原酶IV	Sigma-Aldrich	C4-28-100MG	酶
DNase I	New England Biolabs	M0303L	酶
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS-100G	化学品
Falcon 5 mL 圆底聚苯乙烯试管	Corning	352052	实验材料
Falcon 15 mL 圆锥形离心管	Corning	352095	实验材料
FlowJo V10	BD		软件
GLAST (ACSA-1) 抗体，PE标记	Miltenyi Biotec	130-118-344	抗体
异氟烷	RWD Life Science	R510-22-10	试剂
PE/Cyanine7抗小鼠CD3抗体	Biolegend	100220	抗体
PE/Dazzle 594抗小鼠NK-1.1抗体	Biolegend	156518	抗体
TRIzol试剂	Thermo Fisher Scientific Inc.	15596026	试剂
UltraPure 无DNase/RNase蒸馏水	Thermo Fisher Scientific Inc.	10977015	试剂
Vetbond组织粘合剂	3M	1469SB	实验材料
Zombie Aqua可固定活力检测试剂盒	Biolegend	423102	胺反应性荧光染料