微型中风小鼠模型中神经免疫相互作用的分离与流式细胞术评估

摘要

本文介绍了一种在轻度卒中模型中利用流式细胞术分析评估缺血性卒中后免疫细胞功能的实验方案。该方法可实现对神经免疫相互作用的详细研究，并可适用于其他神经退行性疾病的探索，从而加深我们对卒中病理过程中免疫应答机制的理解。

摘要

脑卒中是全球范围内导致死亡和长期残疾的主要原因，其中缺血性脑卒中占大多数病例。在发生缺血性脑卒中后，常驻和浸润的免疫细胞被激活，进而加剧神经元损伤。然而，免疫系统在缺血性脑卒中病理过程中的作用尚未完全阐明，这主要归因于神经炎症过程中免疫反应对微环境变化所表现出的复杂且动态的调控机制。因此，对缺血性脑卒中后不同时相点常驻和浸润免疫细胞的活化状态进行监测与分析至关重要。本研究介绍了一种在轻度脑卒中模型中利用流式细胞术分析这些免疫细胞功能的实验方案。我们在特定时间点显微解剖梗死脑组织，随后通过机械和酶消化方法将其解离为单细胞悬液。细胞经70 µm细胞筛过滤后，使用荧光标记的抗体混合物进行染色，再通过流式细胞术进行定量分析。尽管该检测方法最初专为研究缺血性脑卒中后的神经免疫相互作用而设计，但也可便捷地拓展应用于多发性硬化、帕金森病和阿尔茨海默病等其他神经退行性疾病中的神经免疫机制研究。

引言

脑卒中是全球范围内导致死亡和长期残疾的主要原因，其中缺血性脑卒中占绝大多数病例^1,2,3。本方法的总体目标是通过提供一种改进的方法来评估小型卒中鼠模型中常驻和浸润性免疫细胞的活化状态，从而加深我们对缺血性脑卒中后发生的神经免疫相互作用的理解^4,5。这些免疫细胞与神经元微环境之间的复杂相互作用对于理解缺血性脑卒中的病理生理机制至关重要。然而，由于神经炎症所触发的免疫反应具有动态性和多面性，这些神经免疫相互作用背后的精确机制仍不清楚⁶。该技术旨在阐明在神经炎症背景下免疫反应的复杂动态过程，及其对神经元损伤和恢复结局的后续影响。

该技术的开发依据源于免疫细胞在缺血事件后加剧神经元损伤并影响恢复过程中的关键作用。传统研究这些相互作用的方法往往缺乏捕捉免疫细胞活化时空细微变化所需的分辨率。通过采用流式细胞术分析来自显微解剖的梗死脑组织所制备的单细胞悬液，本方案能够更详细、动态地评估随时间变化的免疫细胞谱型^7,8。该方法可识....

方案

所有动物实验均经首都医科大学附属北京友谊医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。建议所有溶液均经过无菌过滤，所使用的所有试管均应为无菌的。

1. 准备试剂和缓冲液

1. 消化酶混合液：将胶原酶IV溶解至终浓度为0.25%，并将DNase I稀释至终浓度为2 U/mL。
2. 磁性激活细胞分选（MACS）缓冲液：将牛血清白蛋白（BSA）和乙二胺四乙酸（EDTA）分别溶解于1×PBS中，使其终浓度达到0.5%和2 mM。

2. 局灶性缺血性脑卒中模型

注意：采用 C57BL/6 J 小鼠（8–10 周龄）建立局灶性缺血性脑卒中模型，方法如前所述¹⁴。也可使用其他有充分文献记录、适用于啮齿类动物的药用级注射用麻醉剂。

1. 使用3%异氟烷（氧气流速为0.8–1.0 L/min）诱导小鼠麻醉，随后以1.5%异氟烷维持麻醉。整个手术过程中使用加热垫将体温维持在37 °C。
   注意：本研究强调在切口前必须确认麻醉动物已达到外科麻醉深度。可通过用力捏压后肢脚趾，评估其足部回缩反射是否存在；若无反应，则表明动物已充分麻醉。
2. 使用电动剃刀修剪右眼与右耳之间的毛发。通过....

结果

本研究中，我们提出了一种改进的实验方案，用于在小卒中模型中通过流式细胞术分析评估缺血性卒中后免疫细胞的功能。小卒中模型通过永久结扎右侧大脑中动脉（MCA）远端分支，随后对双侧颈总动脉（CCAs）进行7分钟的闭塞来建立。该方法可诱导出一种病灶体积小且稳定、死亡率极低的轻度卒中。此外，该模型具备研究长期神经免疫相互作用的能力，因此特别适用于探究炎症在卒中后恢复过程中的作用。

小胶质细胞诱导的神经炎症在缺血性脑卒中的病理生理过程中占据核心地位¹⁹。为了阐明缺血性脑卒中后小胶质细胞转录组的动态变化，我们首先通过流式细胞术分离小胶质细胞，并利用实时PCR确认其纯度。图2展示了在脑卒中后第1天代表性卒中动物中所采用的设门策略（图2A），以及对小胶质细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞标志物基因表达的实时PCR验证结果（图2B）。结果显示，与星形胶质细胞、神经元及少突.......

讨论

本研究中，我们介绍了一种利用微型卒中模型进行流式细胞术分析，以评估缺血性脑卒中后免疫细胞功能的详细实验方案。该方案的关键步骤包括：通过永久性结扎右侧大脑中动脉（MCA）远端分支，同时阻断双侧颈总动脉（CCAs）7分钟，建立局灶性缺血性脑卒中模型。该手术方法可诱导轻度脑卒中，具有稳定的病灶体积和较低的死亡率，适用于长期研究神经免疫相互作用¹⁴。手术操作必须精确执行，因为任何变异均可能导致脑卒中严重程度不一致，从而影响后续免疫学评估结果的有效性²⁴。

为了优化细胞解离和纯化，需要对本文所述技术进行改进。在制备显微解剖获得的梗死脑组织单细胞悬液时，联合使用机械法和酶解法对于确保较高的细胞得率和存活率至关重要。具体而言，在消化酶混合物中联合使用胶原酶IV和DNase I，可有效降解细胞外基质成分，同时最大限度减少细胞死亡²⁵。此外，在离心步骤中还需进行问题排查，因为离心速度和时间的变化会影响细胞沉淀的紧密程度和纯度。我们发现，将离心条件调整为500.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	NEST	615601	实验材料
1× PBS	Corning	21-040-CM	试剂
96孔透明圆底TC处理微孔板	Corning	3799	实验材料
APC抗小鼠CD19抗体	Biolegend	152410	抗体
APC/Cyanine7抗小鼠CD45抗体	Biolegend	103116	抗体
Avertin (1.25%)	Nanjing Aibei Biotechnology	M2920	试剂
BD FACSAria II	BD	642510	设备
Brilliant Violet 421抗小鼠CD4抗体	Biolegend	100437	抗体
Brilliant Violet 605抗小鼠/人CD11b抗体	Biolegend	101237	抗体
BSA	Sigma-Aldrich	A1933-1G	化学品
胶原酶IV	Sigma-Aldrich	C4-28-100MG	酶
DNase I	New England Biolabs	M0303L	酶
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS-100G	化学品
Falcon 5 mL 圆底聚苯乙烯试管	Corning	352052	实验材料
Falcon 15 mL 圆锥形离心管	Corning	352095	实验材料
FlowJo V10	BD		软件
GLAST (ACSA-1) 抗体，PE标记	Miltenyi Biotec	130-118-344	抗体
异氟烷	RWD Life Science	R510-22-10	试剂
PE/Cyanine7抗小鼠CD3抗体	Biolegend	100220	抗体
PE/Dazzle 594抗小鼠NK-1.1抗体	Biolegend	156518	抗体
TRIzol试剂	Thermo Fisher Scientific Inc.	15596026	试剂
UltraPure 无DNase/RNase蒸馏水	Thermo Fisher Scientific Inc.	10977015	试剂
Vetbond组织粘合剂	3M	1469SB	实验材料
Zombie Aqua可固定活力检测试剂盒	Biolegend	423102	胺反应性荧光染料