藏药降糖乐含药血清对RIN-m5F胰岛β细胞线粒体功能的保护作用

摘要

本研究表明，含藏药降糖乐的血清可通过提高线粒体和糖酵解ATP水平，改善线粒体功能障碍。

摘要

β由线粒体功能障碍引起的β细胞功能障碍是2型糖尿病（T2DM）的核心特征。藏药降糖乐由甘肃黄连（Berberis kansuensis）、姜黄根茎（Curcumaelongae Rhizoma）、锦葵果（Malvae Fructus）、蒺藜果（Tribuli Fructus）、田野碎米荠（Thlaspi arvense L.）、余甘子（Phyllanthus emblica L.）组成，可用于治疗T2DM。然而，其对线粒体功能的影响尚不明确。本研究旨在明确藏药降糖乐对线粒体的药理作用。在预先给予藏药降糖乐7天后，通过腹主动脉采血获取大鼠血清。将大鼠胰岛β细胞（RIN-m5F）分为对照组、模型组和含降糖乐血清组。模型组和含降糖乐血清组采用含50 mM葡萄糖的DMEM培养基诱导24小时以建立损伤模型；对照组采用无葡萄糖DMEM培养基处理24小时。随后，向对照组和模型组加入普通培养基，而含降糖乐血清组则分别加入含2.5%、5%和10%含药血清的培养基，继续孵育24小时。UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS分析结果显示，降糖乐中含有90种化合物，其中6种原型成分可入血。采用CCK-8法检测细胞活力，Seahorse XFe分析仪评估线粒体能量代谢，并评价含降糖乐血清对RIN-m5F细胞高糖模型的影响。结果表明，含降糖乐血清可提高RIN-m5F细胞活力，增加线粒体ATP水平、糖酵解ATP水平、基础糖酵解、代偿性糖酵解、氧耗率（OCR）、质子漏和最大呼吸速率。 甘肃小檗、姜黄根茎、锦葵果实、蒺藜果实、田野碎米荠 L. 和 Phyllanthus emblica L，可用于治疗2型糖尿病。然而，其对线粒体功能的影响尚不明确。本研究旨在阐明藏药降糖乐对线粒体的药理作用。在预先给予藏药降糖乐7天后，通过腹主动脉采血获取大鼠血清。 大鼠胰岛 β细胞（RIN-m5F）被分为对照组、模型组和含降糖乐血清组。模型组和含降糖乐血清组使用含50 mM葡萄糖的DMEM培养基处理24 h以诱导损伤，对照组则使用不含葡萄糖的DMEM培养基处理24 h。随后，对照组和模型组加入普通培养基，含降糖乐血清组则分别用含2.5%、5%和10%含降糖乐血清的培养基继续孵育24 h。UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS分析结果显示，降糖乐中含有90种化合物，其中6种原型成分可入血。采用CCK-8法检测细胞活力，Seahorse XFe分析仪评估线粒体能量代谢，并评价含降糖乐血清对RIN-m5F细胞高糖模型的影响。结果表明，含降糖乐血清可提高RIN-m5F细胞活力，增加线粒体ATP水平、糖酵解ATP水平、基础糖酵解、代偿性糖酵解、氧耗率（OCR）、质子泄漏和最大呼吸速率。

引言

糖尿病是一种在全球广泛流行的慢性代谢性疾病。其复杂的发病机制对人类健康构成严重威胁，是亟待解决的重大公共卫生问题¹。糖尿病主要分为1型糖尿病、2型糖尿病（T2DM）、妊娠期糖尿病和特殊类型糖尿病²。随着生活方式的改变和人口老龄化进程的加快，近几十年来糖尿病的患病率呈急剧上升趋势。中国是全球糖尿病患者人数最多的国家，糖尿病患者超过1.18亿，约占全球总数的22%，其中90%以上为T2DM^3,4,5。在所有已报道的发病机制中，胰岛β细胞功能障碍已被确认为T2DM发生发展过程中的关键机制^6,7。

线粒体作为细胞能量代谢的中心，是参与胰岛β细胞基本功能的亚细胞器⁸。目前研究表明，2型糖尿病（T2DM）的发生与发展与线粒体活性、功能及氧化应激密切相关。由线粒体功能障碍引起的β细胞衰竭是T2DM的核心特征⁹。位于胰岛中的β细胞负责合成和分泌胰岛素，胰岛素是调节血糖水平所必需的激素。在T2DM发展过程....

方案

四川科学家生物检测生物技术有限公司行政委员会已批准本动物实验方案（记录编号：SYST-2024-019）。本研究使用8-10周龄、体重260-300 g的雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，在温度23 ± 2 °C、相对湿度55%-60%的受控环境中，饲养于独立通风笼具中。这些无特定病原体动物购自商业供应商（见材料表）。所有大鼠在实验开始前均经过为期1周的适应性喂养，以适应新环境，并可自由获取饮水和食物。

实验准备

根据实验流程图准备所需的药物和试剂（见材料表）。本研究使用SPF级SD大鼠（8–10周龄，260–300 g）。所有动物均购自商业供应商（见材料表）。经过检疫后，动物饲养于恒定室温环境中，采用12小时光照/12小时黑暗循环，自由摄取标准啮齿类动物饲料和水。

动物处理与血清采集

所有进行适应性喂养的大鼠均通过灌胃给予藏药降糖乐，持续7天。临床剂量为0.6 g/d，换算成大鼠剂量为1.26 g/kg¹⁷。末次给药1小时后，使用3%-4%异氟烷进行诱导麻醉，2%维持麻醉。将麻醉后的....

结果

UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS 分析显示，藏药降糖乐含有酚类、生物碱、黄酮类、核苷、有机酸、氨基酸、萜类、香豆素、苷类、鞣质、木脂素、甾体及其他化合物（图2，表1）。SD 大鼠以 1.26 g/kg 剂量每日口服一次藏药降糖乐。血清门控策略的总体流程见 图3。通过 UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS 检测含降糖乐血清，鉴定出脯氨酸、柠檬酸、水杨酸、没食子酸、异丙基苹果酸和巴马汀等成分（图4，表2）。为揭示含降糖乐血清在调控线粒体功能中的作用，我们采用葡萄糖构建细胞高糖模型，并分析含降糖乐血清对 RIN-m5F 细胞的影响。在筛选建模最佳葡萄糖浓度时发现，与对照组相比，10 mM 葡萄糖处理组 RIN-m5F 细胞活力无显著变化（p > 0.05），但随着葡萄糖浓度进一步升高（20–60 mM），细.......

讨论

2型糖尿病（T2DM）通常被认为是一种隐匿起病、患病率高的慢性代谢性疾病，常伴随多种糖尿病相关并发症，如眼部、心血管和肾功能障碍^20,21,22,23。其临床表现包括血糖升高、多尿、多饮、体重减轻，甚至失明，严重威胁人类生命健康^24,25。随着饮食质量的提高和预期寿命的延长，葡萄糖代谢紊乱、胰岛素抵抗和β细胞功能障碍已成为T2DM主要病理生理特征中典型且公认的致病因素⁶。研究表明，T2DM的进展会引发胰岛功能持续进行性下降²⁶。同时，T2DM中的胰岛素抵抗通常会导致代偿性胰岛素分泌增强，以维持正常血糖水平，但由于胰岛β细胞功能障碍，这种增强的胰岛素分泌会进一步加重胰岛功能负.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
-80 °C 医用冰箱	甲醚	MDF-86H118
0.22 µm 水相膜	金藤	JTMF0445
0.22 µm 针头式微孔滤膜	金藤	JTSFM013001
乙腈	Aladdin	A104440
Agilent OpenLab 软件	安捷伦	版本 2.X
生物安全柜	Airtech	BSC-1004 II A2
细胞计数试剂盒-8	生物基质	BG0025
CelMate CO2 培养箱	Esco Micro Pte Ltd.	CLM-240B-8
色谱柱	安捷伦	SB-C18
脱色摇床	Kylin-Bell	TS-2
杜氏改良伊格尔培养基	Gibco	8121587
电泳缓冲液	NCM Biotech	20230801
甲酸	Aladdin	F298778
葡萄糖	成都Herbpurify有限公司	P012-180-180222
GraphPad Prism 软件	GraphPad 软件有限责任公司	版本 9.5.1
高速冷冻离心机	Thermo Fisher Scientific	Legend Micro 17R
低速离心机	哈龙	NH5
甲醇	Aladdin	M116118
青霉素-链霉素	NCM Biotech	C125C5
磷酸盐缓冲液（1×)	Gibco	8120485
大鼠胰岛 β细胞	ATCC	CRL-11605
ReadMax 1500 光吸收全波长酶标仪	闪光	ReadMax 1500
Seahorse XF 糖酵解速率检测试剂盒	安捷伦	103344-100
Seahorse XF 实时 ATP 速率测定试剂盒	安捷伦	103592-100
Seahorse XFe 24 分析仪	安捷伦	XFe24
胰蛋白酶（0.25%，1×)	HyClone	J210045
UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS 分析仪	Thermo Scientific	QE Q Exactive
涡旋混合器	Kylin-Bell	XW-80A