本研究表明，含藏药降糖乐的血清可通过提高线粒体和糖酵解ATP水平，改善线粒体功能障碍。
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研究文章
藏药降糖乐含药血清对RIN-m5F胰岛β细胞线粒体功能的保护作用
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
β由线粒体功能障碍引起的β细胞功能障碍是2型糖尿病（T2DM）的核心特征。藏药降糖乐由甘肃黄连（Berberis kansuensis）、姜黄根茎（Curcumaelongae Rhizoma）、锦葵果（Malvae Fructus）、蒺藜果（Tribuli Fructus）、田野碎米荠（Thlaspi arvense L.）、余甘子（Phyllanthus emblica L.）组成，可用于治疗T2DM。然而，其对线粒体功能的影响尚不明确。本研究旨在明确藏药降糖乐对线粒体的药理作用。在预先给予藏药降糖乐7天后，通过腹主动脉采血获取大鼠血清。将大鼠胰岛β细胞（RIN-m5F）分为对照组、模型组和含降糖乐血清组。模型组和含降糖乐血清组采用含50 mM葡萄糖的DMEM培养基诱导24小时以建立损伤模型；对照组采用无葡萄糖DMEM培养基处理24小时。随后，向对照组和模型组加入普通培养基，而含降糖乐血清组则分别加入含2.5%、5%和10%含药血清的培养基，继续孵育24小时。UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS分析结果显示，降糖乐中含有90种化合物，其中6种原型成分可入血。采用CCK-8法检测细胞活力，Seahorse XFe分析仪评估线粒体能量代谢，并评价含降糖乐血清对RIN-m5F细胞高糖模型的影响。结果表明，含降糖乐血清可提高RIN-m5F细胞活力，增加线粒体ATP水平、糖酵解ATP水平、基础糖酵解、代偿性糖酵解、氧耗率（OCR）、质子漏和最大呼吸速率。 甘肃小檗、姜黄根茎、锦葵果实、蒺藜果实、田野碎米荠 L. 和 Phyllanthus emblica L，可用于治疗2型糖尿病。然而，其对线粒体功能的影响尚不明确。本研究旨在阐明藏药降糖乐对线粒体的药理作用。在预先给予藏药降糖乐7天后，通过腹主动脉采血获取大鼠血清。 大鼠胰岛 β细胞（RIN-m5F）被分为对照组、模型组和含降糖乐血清组。模型组和含降糖乐血清组使用含50 mM葡萄糖的DMEM培养基处理24 h以诱导损伤，对照组则使用不含葡萄糖的DMEM培养基处理24 h。随后，对照组和模型组加入普通培养基，含降糖乐血清组则分别用含2.5%、5%和10%含降糖乐血清的培养基继续孵育24 h。UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS分析结果显示，降糖乐中含有90种化合物，其中6种原型成分可入血。采用CCK-8法检测细胞活力，Seahorse XFe分析仪评估线粒体能量代谢，并评价含降糖乐血清对RIN-m5F细胞高糖模型的影响。结果表明，含降糖乐血清可提高RIN-m5F细胞活力，增加线粒体ATP水平、糖酵解ATP水平、基础糖酵解、代偿性糖酵解、氧耗率（OCR）、质子泄漏和最大呼吸速率。
引言
糖尿病是一种在全球广泛流行的慢性代谢性疾病。其复杂的发病机制对人类健康构成严重威胁，是亟待解决的重大公共卫生问题1。糖尿病主要分为1型糖尿病、2型糖尿病（T2DM）、妊娠期糖尿病和特殊类型糖尿病2。随着生活方式的改变和人口老龄化进程的加快，近几十年来糖尿病的患病率呈急剧上升趋势。中国是全球糖尿病患者人数最多的国家，糖尿病患者超过1.18亿，约占全球总数的22%，其中90%以上为T2DM3,4,5。在所有已报道的发病机制中，胰岛β细胞功能障碍已被确认为T2DM发生发展过程中的关键机制6,7。
线粒体作为细胞能量代谢的中心，是参与胰岛β细胞基本功能的亚细胞器8。目前研究表明，2型糖尿病（T2DM）的发生与发展与线粒体活性、功能及氧化应激密切相关。由线粒体功能障碍引起的β细胞衰竭是T2DM的核心特征9。位于胰岛中的β细胞负责合成和分泌胰岛素，胰岛素是调节血糖水平所必需的激素。在T2DM发展过程中，线粒体功能异常、活性氧增多以及氧化应激反应破坏了β细胞的线粒体动态平衡，进而影响胰岛素的分泌与代谢10。
藏药降糖乐由Berberis kansuensis, Curcumaelongae Rhizoma, Malvae Fructus, Tribuli Fructus, Thlaspi arvense L.,和Phyllanthus emblica L.（图1）组成。其为黄色粉末，具有芳香气味和苦味，可用于治疗糖尿病引起的口干、多饮、消瘦、多尿、糖尿病足、皮肤瘙痒等症状。现有临床证据表明，小檗皮中的生物碱可通过降低血糖、改善胰岛素抵抗和减轻炎症有效缓解2型糖尿病（T2DM）11。姜黄素可通过降低血糖水平、增强胰岛素敏感性、调节脂质谱以及发挥抗炎和抗氧化作用，改善T2DM12。此外，Malave Fructus, Tribuli Fructus, Thlaspi arvense L.和Phyllanthus emblica L.也具有抗糖尿病或抗氧化活性13,14,15。目前，藏药降糖乐在治疗T2DM方面的疗效、物质基础及作用机制尚不明确。中药藏药成分复杂，其防治疾病基于整体性和系统性的用药理论。目前，中药血清药化学可在一定程度上阐明药物在体内的吸收成分，已成为探索藏药物质基础的重要手段16。本研究初步阐明了藏药降糖乐在体外对线粒体的保护作用，重点验证了含降糖乐血清可在高糖应激条件下缓解大鼠胰岛β细胞（RIN-m5F）线粒体功能障碍这一新假说。
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方案
四川科学家生物检测生物技术有限公司行政委员会已批准本动物实验方案（记录编号：SYST-2024-019）。本研究使用8-10周龄、体重260-300 g的雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，在温度23 ± 2 °C、相对湿度55%-60%的受控环境中，饲养于独立通风笼具中。这些无特定病原体动物购自商业供应商（见材料表）。所有大鼠在实验开始前均经过为期1周的适应性喂养，以适应新环境，并可自由获取饮水和食物。
实验准备
根据实验流程图准备所需的药物和试剂（见材料表）。本研究使用SPF级SD大鼠（8–10周龄，260–300 g）。所有动物均购自商业供应商（见材料表）。经过检疫后，动物饲养于恒定室温环境中，采用12小时光照/12小时黑暗循环，自由摄取标准啮齿类动物饲料和水。
动物处理与血清采集
所有进行适应性喂养的大鼠均通过灌胃给予藏药降糖乐，持续7天。临床剂量为0.6 g/d，换算成大鼠剂量为1.26 g/kg17。末次给药1小时后，使用3%-4%异氟烷进行诱导麻醉，2%维持麻醉。将麻醉后的大鼠固定于手术台上，手术部位用碘伏消毒。沿腹部正中线切开，暴露腹主动脉。使用肝素化注射器从主动脉缓慢抽取血液（8 mL），并转移至离心管中进行离心。采集的血液在4 °C条件下以2360 × g 离心10分钟，以分离血清。随后将血清样品分装至冻存管中，每管5 mL，并储存于-80 °C医用冰箱（见材料表）中，用于后续分析。
UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS 分析
药材样品的制备：准确称取140.0 mg藏药降糖乐，溶于25 mL甲醇中（见材料表），在40 kHz、300 W条件下超声处理30分钟。将所得溶液经0.22 µm滤膜过滤，得到待测样品。
血清样品制备：取100 µL血清，加入400 µL预冷的甲醇和乙腈（体积比1:1；见材料表），涡旋充分混匀。将混合液置于冰浴中，超声处理1小时（40 kHz，300 W）。随后，将混合液在-20 °C孵育1小时，并在4 °C、14,000 × g条件下离心20分钟。收集上清液，真空干燥后用于UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS分析。
色谱条件：采用UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS系统（见材料表）测定上清液。液相色谱分离使用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm × 100 mm，1.8 µm）。流动相由A相（含0.1%甲酸的水溶液）和B相（100%乙腈）组成。流速为0.3 mL/min，梯度洗脱程序为5%-95% B相（0-30 min），95% B相（30-35 min）。进样体积为5 µL。质谱数据分别在正离子和负离子ESI模式下采集。HESI离子源的喷雾电压、毛细管温度、气体流速等参数均设定为固定条件。仪器扫描范围为m/z 70-1050 Da，全扫描（full MS）和二级质谱（MS/MS）采用不同的分辨率。原始质谱数据使用MS-DIAL软件进行峰对齐处理。通过比对公共数据库中的精确质量数和MS/MS数据，鉴定藏药降糖乐的化学成分。仅保留至少在一个组中非零值比例超过50%的变量。
细胞培养与处理
RIN-m5F 细胞（参见材料表）在含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO2的恒温培养箱（参见材料表）中培养。取对数生长期的RIN-m5F细胞，消化后计数，以每孔1 × 105个细胞接种至96孔板。使用10–60 mM葡萄糖进行细胞诱导，以模拟2型糖尿病（T2DM）的高糖环境。将RIN-m5F细胞分为对照组、模型组以及含2.5%、5%和10% Jiangtangle血清的各组。对照组细胞用DMEM处理，其余各组用含葡萄糖的DMEM诱导24小时。对照组和模型组加入普通培养基，各血清组则分别加入含2.5%、5%和10% Jiangtangle血清的DMEM，在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。
CCK 8 分析
使用 CCK 8 法测定细胞活力（参见材料表）。将 RIN-m5F 细胞接种于 96 孔板中，并用葡萄糖（0、10、20、30、40、50 和 60 mM）处理。随后，向各孔中加入 100 µL 含 Jiangtangle 血清的 DMEM 培养基，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 24 小时。每组设 6 个复孔。经葡萄糖孵育 24 小时后，再与含 Jiangtangle 血清的培养基孵育 24 小时，然后每孔加入 10 µL CCK 8 溶液，于 37 °C 继续孵育 1.5 小时。采用全波长酶标仪（参见材料表）检测各孔在 450 nm 处的吸光度值16。
线粒体功能分析
正如我们先前报道的18，采用 Seahorse XFe 24 分析仪（见材料表）评估实时 ATP 生成速率和糖酵解速率。将 RIN-m5F 细胞接种至 Seahorse XFe24 V24 微孔板中。细胞采用两步法接种于 XF24 细胞培养板：每孔加入 100 µL 细胞悬液，静置 1 小时。随后将培养板转移至 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 4 小时，以促进细胞初始贴壁。接着每孔加入 150 µL DMEM 培养基。在造模 24 小时及给药 24 小时后，通过向 Seahorse XF DMEM 培养基中添加 1% 葡萄糖、1% 丙酮酸钠和 1% 谷氨酰胺配制检测溶液。然后用 1 mL 检测溶液洗涤细胞两次。使用实时 ATP 速率检测试剂盒和糖酵解速率检测试剂盒时，将 56 µL 寡霉素和 62 µL 鱼藤酮/抗霉素 A 分别重悬并加入传感器微孔板的 A 孔和 B 孔。随后将细胞培养板置于无 CO2 的细胞培养箱中孵育 60 分钟。最后通过自动加样系统实时监测 ATP 生成速率和糖酵解速率。所有实验均在 37 °C 下进行，数据采用 XF Wave 软件进行分析19。
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结果
UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS 分析显示，藏药降糖乐含有酚类、生物碱、黄酮类、核苷、有机酸、氨基酸、萜类、香豆素、苷类、鞣质、木脂素、甾体及其他化合物（图2，表1）。SD 大鼠以 1.26 g/kg 剂量每日口服一次藏药降糖乐。血清门控策略的总体流程见 图3。通过 UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS 检测含降糖乐血清，鉴定出脯氨酸、柠檬酸、水杨酸、没食子酸、异丙基苹果酸和巴马汀等成分（图4，表2）。为揭示含降糖乐血清在调控线粒体功能中的作用，我们采用葡萄糖构建细胞高糖模型，并分析含降糖乐血清对 RIN-m5F 细胞的影响。在筛选建模最佳葡萄糖浓度时发现，与对照组相比，10 mM 葡萄糖处理组 RIN-m5F 细胞活力无显著变化（p > 0.05），但随着葡萄糖浓度进一步升高（20–60 mM），细...
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讨论
2型糖尿病（T2DM）通常被认为是一种隐匿起病、患病率高的慢性代谢性疾病，常伴随多种糖尿病相关并发症，如眼部、心血管和肾功能障碍20,21,22,23。其临床表现包括血糖升高、多尿、多饮、体重减轻，甚至失明，严重威胁人类生命健康24,25。随着饮食质量的提高和预期寿命的延长，葡萄糖代谢紊乱、胰岛素抵抗和β细胞功能障碍已成为T2DM主要病理生理特征中典型且公认的致病因素6。研究表明，T2DM的进展会引发胰岛功能持续进行性下降26。同时，T2DM中的胰岛素抵抗通常会导致代偿性胰岛素分泌增强，以维持正常血糖水平，但由于胰岛β细胞功能障碍，这种增强的胰岛素分泌会进一步加重胰岛功能负...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到西藏藏医药大学“十四五”内涵建设项目（2023ZYYGH05）和科学技术 & 四川省科学技术厅（2024NSFSC1845）。同时，作者谨向成都中医药大学交叉学科研究院/中医药创新研究院高级设备工程师卢 Yang 博士致谢，感谢其在Seahorse XF技术方面提供的技术服务。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| -80 °C 医用冰箱 | 甲醚 | MDF-86H118 | |
| 0.22 µm 水相膜 | 金藤 | JTMF0445 | |
| 0.22 µm 针头式微孔滤膜 | 金藤 | JTSFM013001 | |
| 乙腈 | Aladdin | A104440 | |
| Agilent OpenLab 软件 | 安捷伦 | 版本 2.X | |
| 生物安全柜 | Airtech | BSC-1004 II A2 | |
| 细胞计数试剂盒-8 | 生物基质 | BG0025 | |
| CelMate CO2 培养箱 | Esco Micro Pte Ltd. | CLM-240B-8 | |
| 色谱柱 | 安捷伦 | SB-C18 | |
| 脱色摇床 | Kylin-Bell | TS-2 | |
| 杜氏改良伊格尔培养基 | Gibco | 8121587 | |
| 电泳缓冲液 | NCM Biotech | 20230801 | |
| 甲酸 | Aladdin | F298778 | |
| 葡萄糖 | 成都Herbpurify有限公司 | P012-180-180222 | |
| GraphPad Prism 软件 | GraphPad 软件有限责任公司 | 版本 9.5.1 | |
| 高速冷冻离心机 | Thermo Fisher Scientific | Legend Micro 17R | |
| 低速离心机 | 哈龙 | NH5 | |
| 甲醇 | Aladdin | M116118 | |
| 青霉素-链霉素 | NCM Biotech | C125C5 | |
| 磷酸盐缓冲液（1×) | Gibco | 8120485 | |
| 大鼠胰岛 β细胞 | ATCC | CRL-11605 | |
| ReadMax 1500 光吸收全波长酶标仪 | 闪光 | ReadMax 1500 | |
| Seahorse XF 糖酵解速率检测试剂盒 | 安捷伦 | 103344-100 | |
| Seahorse XF 实时 ATP 速率测定试剂盒 | 安捷伦 | 103592-100 | |
| Seahorse XFe 24 分析仪 | 安捷伦 | XFe24 | |
| 胰蛋白酶（0.25%，1×) | HyClone | J210045 | |
| UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS 分析仪 | Thermo Scientific | QE Q Exactive | |
| 涡旋混合器 | Kylin-Bell | XW-80A |
参考文献
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