本研究阐明了哺乳动物细胞对戈丹提煅烧粉（GB）颗粒的吞噬加工过程，表征了其细胞摄取、液泡动态变化、酸化及降解过程。这些发现不仅加深了我们对基本吞噬机制的理解，同时也确立了GB作为开发新型治疗策略的有前景的模型系统。
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摘要
摘要
吞噬作用是一种重要的细胞机制，细胞通过该机制吞噬并降解外来颗粒、病原体或碎片，在免疫防御和组织稳态维持中发挥关键作用。该过程的紊乱与多种疾病相关。为了探究吞噬作用通路中涉及的复杂事件，需要先进的智能颗粒和有效的监测技术。戈丹提·巴沙（Godanti Bhasma，GB）是一种由生物活性硫酸钙颗粒组成的印度传统药物，可在哺乳动物细胞中通过吞噬作用迅速内化，并诱导显著的胞质空泡化。本研究利用流式细胞术（FC）、活细胞成像以及特异性染色技术，评估了GB诱导吞噬作用的关键阶段。流式细胞术分析显示，伴随颗粒内化过程，形成了类似吞噬杯的结构。活细胞成像实现了对吞噬过程的实时观察，包括颗粒摄取、空泡形成、被吞噬物质的降解以及空泡的更新。采用中性红和吖啶橙染色评估空泡的酸化情况。有趣的是，在GB处理的细胞中加入溶酶体抑制剂BFA1后并未引起空泡化，表现为中性红摄取缺失，这强调了空泡化发生对酸性环境的依赖性。这些发现凸显了GB诱导的吞噬作用作为研究模型的潜力，有助于阐明该过程中一系列连续的细胞事件，对于理解宿主-病原体相互作用、细胞内运输机制以及开发与吞噬功能障碍相关疾病的创新治疗策略具有重要意义。
引言
吞噬作用是一种重要的细胞过程，由组织驻留的专业吞噬细胞（如巨噬细胞和树突状细胞）以及非专业吞噬细胞（如上皮细胞和成纤维细胞）执行，这些细胞能够摄取并降解外来颗粒。这些细胞通过内化和清除外来颗粒、病原体或细胞碎片，在免疫防御和组织稳态中发挥重要作用1。该过程始于模式识别受体（PRRs）——例如Toll样受体（TLRs）——对外来病原体、碎片或颗粒的识别，这些受体可结合病原体相关分子模式（PAMPs）2。这种识别会触发吞噬杯的形成，即质膜向外延伸并包裹目标颗粒3。肌动蛋白丝在此过程中起关键作用，驱动质膜重塑以实现颗粒的内吞4。当颗粒被完全包裹形成吞噬体后，即产生一个由膜包被的囊泡。吞噬体经历成熟过程，其特征是先与早期内体融合，再与晚期内体融合，最终与含有水解酶的溶酶体融合5。这些酶（如组织蛋白酶、溶菌酶和核酸酶）在吞噬体内酸化环境中被激活，该酸化过程由囊泡ATP酶（V-ATPase）介导，使pH值降至4.5–5.5。降解过程最终通过残余物的胞吐作用排出细胞外而完成。这一动态而复杂的过程若发生功能障碍，可能导致严重的免疫问题6,7,
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方案
1. 细胞培养与接种
- 准备完全DMEM培养基，添加10%热灭活胎牛血清（FBS）及抗生素（100 µg/mL青霉素，100 µg/mL链霉素）。使用前对所有试剂和设备进行灭菌处理。
- 使用DMEM在25 cm2培养瓶和35 mm培养皿中培养3T3-L1、HeLa和RAW 264.7细胞。将培养物置于37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中培养，每48小时更换一次培养基。
- 传代时，用PBS洗涤细胞2次，然后加入500 µL胰蛋白酶-EDTA溶液使贴壁细胞脱落，孵育5分钟。加入1 mL DMEM以中和胰蛋白酶-EDTA溶液，吹打形成单细胞悬液，并用新鲜DMEM调整总体积至10 mL。以300 × g 离心5分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于1 mL新鲜培养基中。
- 取10 µL细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液按1:1混合，使用血细胞计数板计数活细胞，按公式计算细胞密度：细胞数/mL = 平均计数 × 104 × 2。
- 对于96孔板：每孔加入100 µL细胞悬液（含10,000个细胞）。对于腔室载玻片：在两个腔室中各加入50 µL细胞悬液（含5000个细胞），中间腔室保持空白，并在每个接种后的腔室中加入50 µL DMEM。
- 将培养板和腔室载玻片置于37 °C、5% CO2条件下孵育24小....
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结果
该研究强调了哺乳动物细胞对GB颗粒的关键细胞反应。我们使用成像流式细胞仪研究了GB颗粒在3T3-L1细胞中的内化过程（图1）。细胞暴露于颗粒的时间从30分钟到12小时不等。30分钟后，我们观察到颗粒附着在细胞表面（图1B），并且在结合位点处细胞膜开始向内折叠，表明内化过程已启动（图1C）。在结合位点周围形成了一个环状的膜突起，可能为吞噬杯结构（图1C）。最终，颗粒被发现位于较大的膜包被空泡内，显示出空泡化的动态过程（图1D）。
在我们之前的研究中，MTT 实验结果表明，在 24 至 96 小时内，用浓度范围为 0–2.5 mg/mL 的戈丹提煅烧物（Godanti Bhasma, GB）处理 3T3-L1 细胞，并未显著影响细胞活力。值得注意的是，在长期暴露期间，较高浓度下细胞活力仍保持.......
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讨论
吞噬作用是一种关键的免疫防御机制，能够吞噬并随后清除颗粒物、病原体以及凋亡细胞。为了理解吞噬体形成与成熟的过程，研究诸如液泡化进程、酸化以及被吞噬物质降解等动态事件，必须使用智能生物相容性颗粒结合先进的成像技术18,19。本研究采用GB这一生物相容性模型颗粒作为吞噬作用检测系统。扫描电子显微镜（SEM）分析显示，GB颗粒具有异质性的尺寸分布，范围从0.5到5 µm16。为降低这种变异性，通过使较大颗粒自然沉降对悬浮液进行标准化处理，仅取上层部分用于后续所有实验。该方法确保了颗粒尺寸的一致性，并提高了细胞摄取的可重复性。值得注意的是，GB颗粒通过吞噬摄取可内在地诱导显著的液泡形成，且在细胞中不引起任何细胞毒性效应。成像流式细胞术（IFC）进一步揭示了该过程，显示细胞膜在颗粒黏附部位精确发生内陷。尤其在这些接触点周围观察到圆形或半圆形的膜延伸结构，提示吞噬杯的形成，而吞噬杯对于靶颗粒的内化至关重要。该吞噬杯在促进吞噬过程中发挥关键作用20
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由科学 &印度政府科学技术部科学与工程研究委员会（SERB）核心研究资助（CRG/2022/009045）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 25 cm2 培养瓶 | NEST，印度 | 707001 | |
| 96孔和6孔板 | Tarsons India Pvt. Ltd.，印度加尔各答；Thermo Scientific，印度 | 980040; 140675 | |
| 吖啶橙 | 印度 SRL | 82407 | |
| 抗生素，胰蛋白酶-EDTA 溶液 | 印度高媒体 | 628242; 655111 | |
| 细胞系—HeLa、3T3-L1 和 RAW-264.7 | 印度浦那马哈拉施特拉邦国家细胞科学中心（NCCS） | ||
| 培养皿（35 mm） | SPL Lifesciences，印度 | 101350 | |
| 杜尔贝科’DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基） | MP Biomedicles，印度 | 1033126 | |
| 胎牛血清（FBS） | 印度 High Media | 651257 | |
| 流式细胞仪 | Millipore，美国 | Amnis | Amnis 成像流式细胞仪 |
| 荧光显微镜 | DiGi Lab，印度 | 型号：DiGi 110 Infinity | |
| 戈丹蒂药散 | 帕坦伽利阿育吠陀 | 240002 | |
| 中性红染料 | 印度CDH | 593630 | |
| 延时显微镜 | NanoEnTek 公司 韩国首尔 | JuLi | JuLi 智能荧光细胞分析仪 |
| 延时显微镜 | LEEDZ MICRO IMA. UK | 编号 LIM225552358A58 | EA PRIME 倒置显微镜 |
参考文献
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. B. Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8 (2), 131-141 (2008).
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nat Rev Immunol. 12 (7), 492-502 (2012).
- G....
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重印与许可
