探究戈丹提白夏在哺乳动物细胞中引发吞噬作用的连续细胞事件

摘要

本研究阐明了哺乳动物细胞对戈丹提煅烧粉（GB）颗粒的吞噬加工过程，表征了其细胞摄取、液泡动态变化、酸化及降解过程。这些发现不仅加深了我们对基本吞噬机制的理解，同时也确立了GB作为开发新型治疗策略的有前景的模型系统。

摘要

吞噬作用是一种重要的细胞机制，细胞通过该机制吞噬并降解外来颗粒、病原体或碎片，在免疫防御和组织稳态维持中发挥关键作用。该过程的紊乱与多种疾病相关。为了探究吞噬作用通路中涉及的复杂事件，需要先进的智能颗粒和有效的监测技术。戈丹提·巴沙（Godanti Bhasma，GB）是一种由生物活性硫酸钙颗粒组成的印度传统药物，可在哺乳动物细胞中通过吞噬作用迅速内化，并诱导显著的胞质空泡化。本研究利用流式细胞术（FC）、活细胞成像以及特异性染色技术，评估了GB诱导吞噬作用的关键阶段。流式细胞术分析显示，伴随颗粒内化过程，形成了类似吞噬杯的结构。活细胞成像实现了对吞噬过程的实时观察，包括颗粒摄取、空泡形成、被吞噬物质的降解以及空泡的更新。采用中性红和吖啶橙染色评估空泡的酸化情况。有趣的是，在GB处理的细胞中加入溶酶体抑制剂BFA1后并未引起空泡化，表现为中性红摄取缺失，这强调了空泡化发生对酸性环境的依赖性。这些发现凸显了GB诱导的吞噬作用作为研究模型的潜力，有助于阐明该过程中一系列连续的细胞事件，对于理解宿主-病原体相互作用、细胞内运输机制以及开发与吞噬功能障碍相关疾病的创新治疗策略具有重要意义。

引言

吞噬作用是一种重要的细胞过程，由组织驻留的专业吞噬细胞（如巨噬细胞和树突状细胞）以及非专业吞噬细胞（如上皮细胞和成纤维细胞）执行，这些细胞能够摄取并降解外来颗粒。这些细胞通过内化和清除外来颗粒、病原体或细胞碎片，在免疫防御和组织稳态中发挥重要作用¹。该过程始于模式识别受体（PRRs）——例如Toll样受体（TLRs）——对外来病原体、碎片或颗粒的识别，这些受体可结合病原体相关分子模式（PAMPs）²。这种识别会触发吞噬杯的形成，即质膜向外延伸并包裹目标颗粒³。肌动蛋白丝在此过程中起关键作用，驱动质膜重塑以实现颗粒的内吞⁴。当颗粒被完全包裹形成吞噬体后，即产生一个由膜包被的囊泡。吞噬体经历成熟过程，其特征是先与早期内体融合，再与晚期内体融合，最终与含有水解酶的溶酶体融合⁵。这些酶（如组织蛋白酶、溶菌酶和核酸酶）在吞噬体内酸化环境中被激活，该酸化过程由囊泡ATP酶（V-ATPase）介导，使pH值降至4.5–5.5。降解过程最终通过残余物的胞吐作用排出细胞外而完成。这一动态而复杂的过程若发生功能障碍，可能导致严重的免疫问题^6,7,8。

为了准确评估吞噬作用这一复杂的细胞过程，亟需改进并开发简便的方法，以监测吞噬过程中的主要细胞事件。传统用于量化吞噬作用的监测方法包括：在预定时间点固定吞噬细胞，通过显微镜观察；利用成像或流式细胞术检测染料标记靶标的内化；或在特定吞噬时间后计数残留的靶细胞数量。然而，这些方法无法捕捉吞噬过程中分钟级的动态变化⁹。此外，依赖染料摄取等间接指标的方法可能因存在被动染料转移而无法准确反映真实的吞噬事件¹⁰。

活细胞成像、流式细胞术和染色技术的最新进展极大地提升了我们以高时空精度监测吞噬作用的能力。例如，活细胞成像可实现对动态过程的连续观察，并能够追踪相继发生的事件¹¹。流式细胞术广泛应用于哺乳动物细胞分析以及临床研究中生物标志物的检测¹²。然而，传统的流式细胞术（FC）方法无法评估单个细胞的形态学和空间特征¹²。成像流式细胞术（IFC）是一种强大的替代方法，能够从单个细胞中获取详细信息。IFC 结合了流式细胞术的分析能力与高分辨率成像技术，可在单细胞水平上实现包含形态学和空间细节的分析。多种颗粒，包括荧光乳胶微球、酵母聚糖-APC（zymosan-APC）和合成纳米颗粒，常被用于吞噬作用的研究，有助于揭示受体结合、吞噬体形成及免疫应答等过程¹²。

与通常依赖终点分析的传统生化技术相比，活细胞成像能够对细胞过程进行连续、动态的监测。该方法具有高时空分辨率，并能观察吞噬作用中的连续事件。因此，它是研究吞噬作用这一复杂过程的有力工具，可更准确、详细地揭示细胞行为与机制¹³。

除了成像系统的进步之外，还需要能够显著标记吞噬事件（特别是吞噬体内部发生的降解步骤）的智能吞噬颗粒。吞噬作用研究通常利用乳胶珠、酵母聚糖、细菌、凋亡细胞以及合成纳米颗粒等颗粒来探索受体结合、吞噬体形成和免疫反应等机制。尽管这些颗粒提供了有价值的见解，但在追踪完整的降解过程或直接评估吞噬体成熟方面仍存在局限性。例如，乳胶珠不可生物降解，无法展示降解过程；而酵母聚糖和细菌通常需要复杂的标记方法，且可能无法产生一致的降解特征^14，15。

我们之前的研究表明，戈拉巴什塔（GB）作为一种传统的阿育吠陀制剂，主要成分为硫酸钙，是研究吞噬体成熟与降解过程的理想颗粒¹⁶。GB在吞噬体的酸性环境中会随时间逐渐溶解，从而可清晰观察颗粒的降解过程。此外，GB能够诱导显著的空泡形成，有助于研究吞噬体成熟的各个阶段，从早期形成、酸化直至最终分解。与其他颗粒不同，GB无需额外标记，提供了一个自给自足的系统，用于研究吞噬体的完整生命周期，因此是研究吞噬作用及其相关疾病动态的理想模型¹⁶。

本研究提出了一种标准化且可重复的实验方案，旨在利用戈丹提药粉（Godanti Bhasma, GB）在专业吞噬细胞系（RAW 264.7）和非专业吞噬细胞系（HeLa 和 3T3-L1）中评估颗粒诱导的吞噬作用及空泡形成。该方法的总体目标是为研究不同细胞类型中的细胞摄取机制、空泡发生以及细胞内颗粒处理提供一个可靠的平台。将 GB 悬浮于 DMEM 中，浓度为 10 mg/mL，为确保均匀性，静置使较大颗粒沉降后，收集上层部分用于实验。在流式细胞术检测中，将细胞以每孔 2 × 10⁵ 个细胞的密度接种于 12 孔板中，每孔加入 300 µL GB 工作悬浮液。对于基于成像的分析，每孔接种 5,000–10,000 个细胞于 96 孔板或腔室载玻片上。该方法确立了 GB 作为研究多种细胞类型中空泡形成与颗粒内化过程的可靠模型。

方案

1. 细胞培养与接种

1. 准备完全DMEM培养基，添加10%热灭活胎牛血清（FBS）及抗生素（100 µg/mL青霉素，100 µg/mL链霉素）。使用前对所有试剂和设备进行灭菌处理。
2. 使用DMEM在25 cm²培养瓶和35 mm培养皿中培养3T3-L1、HeLa和RAW 264.7细胞。将培养物置于37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中培养，每48小时更换一次培养基。
3. 传代时，用PBS洗涤细胞2次，然后加入500 µL胰蛋白酶-EDTA溶液使贴壁细胞脱落，孵育5分钟。加入1 mL DMEM以中和胰蛋白酶-EDTA溶液，吹打形成单细胞悬液，并用新鲜DMEM调整总体积至10 mL。以300 × g 离心5分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于1 mL新鲜培养基中。
4. 取10 µL细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液按1:1混合，使用血细胞计数板计数活细胞，按公式计算细胞密度：细胞数/mL = 平均计数 × 10⁴ × 2。
5. 对于96孔板：每孔加入100 µL细胞悬液（含10,000个细胞）。对于腔室载玻片：在两个腔室中各加入50 µL细胞悬液（含5000个细胞），中间腔室保持空白，并在每个接种后的腔室中加入50 µL DMEM。
6. 将培养板和腔室载玻片置于37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时，以促进细胞贴壁和状态稳定。在进行后续实验前，于倒置显微镜下以20倍物镜观察细胞形态、融合度及是否存在污染。

2. 细胞培养用GB储存液/混合液的制备

1. 取葛根，精确称取100 mg粉末。将粉末悬浮于10 mL添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中。
2. 涡旋混悬液，静置1分钟，使较大颗粒沉降。然后，将上层5 mL混悬液转移至无菌离心管中。
3. 将此5 mL制备的葛根混悬液定为后续细胞培养实验的储备液。在加入细胞前，充分涡旋混悬液，以确保颗粒均匀分散。

3. 流式细胞术分析

1. 通过胰蛋白酶消化法收集 RAW 264.7、HeLa 或 3T3-L1 细胞，用完全 DMEM 培养基中和，300 × g 离心 5 分钟，重悬于 1 mL 新鲜培养基中，取 10 µL 与 0.4% 台盼蓝按 1:1 混合，使用血细胞计数板计数活细胞，计算细胞密度并调整至 2 × 10⁵ 个/mL。
2. 将 2 × 10⁵ 个细胞接种至 12 孔板的每孔中，培养 24 小时。在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育。
3. 用 GB 悬液（每孔 300 µL）处理细胞，处理时间分别为：30 分钟、1 小时和 12 小时。处理结束后，用 PBS 洗涤细胞 5 次，以去除多余的颗粒。
4. 按照步骤 1.3 的方法进行胰蛋白酶消化，并用 PBS 充分洗涤细胞。将制备好的细胞悬液加入流式细胞仪的样品进样口。启动软件并选择适当的采集参数。选择明场模式进行成像。
5. 在软件中点击运行开始数据采集。至少采集 10,000 个事件，系统将捕获单个细胞通过流动池时的图像。
6. 利用面积与长宽比的散点图对单个完整细胞进行设门，以排除双联体和细胞团簇。在图像库中查看相应图像。从软件图像库中提取单个细胞图像，用于研究处理诱导的形态学变化。
7. 对于颗粒分析，将 2 × 10⁵ 个细胞接种至 12 孔板的每孔中，培养 24 小时。用 GB 悬液（每孔 300 µL）处理细胞，处理时间分别为：1 小时、7 小时、14 小时和 24 小时。
8. 处理结束后，轻轻振荡培养板 1 分钟，收集培养基至 1.5 mL 离心管中。用 PBS 洗涤细胞 5 次，以去除任何胞外颗粒。
9. 加入 500 µL RIPA 裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.5；150 mM NaCl；0.1% Triton X-100；1% 脱氧胆酸钠），彻底裂解细胞。
10. 将含有颗粒的培养基和裂解后的细胞样品分别上机进行流式细胞仪检测。将样品加入系统的样品进样口。启动软件并选择适当的采集参数。选择明场模式进行颗粒分析。
11. 在软件中点击运行开始数据采集。至少采集 20,000 个事件，系统将捕获单个颗粒通过流动池时的图像。
12. 利用面积与长宽比的散点图对所有颗粒进行设门。使用散点图工具分析颗粒数量。

4. 时间序列显微镜

1. 在35 mm培养皿中，加入2 mL DMEM，于37 °C、5% CO₂条件下培养3T3-L1细胞（3.0 × 10⁴），直至细胞融合度达到70%。
2. 将300 µL GB悬液充分混入预热的新鲜2 mL培养基中，然后将含有细胞和GB的培养皿置于成像显微镜载物台上。
3. 选择10倍物镜，按下Bright按钮开启明场照明，点击Movie按钮进入延时成像模式，设置时间间隔为5分钟，点击Rec按钮开始记录。
4. 每隔5分钟拍摄一次图像，持续16至24小时，确保在CO₂培养箱的标准条件下连续成像。
5. 使用ImageJ软件将采集的图像合成为延时视频。该技术可用于区分吞噬作用的不同阶段，从颗粒的内吞到完全降解的全过程。

5. 中性红染色

1. 在96孔板和腔室载玻片中培养细胞24小时后，充分混匀GB颗粒悬浮液原液，并向每孔或每个腔室加入30 µL悬浮液。
2. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时，以诱导空泡形成。未处理的孔或腔室作为阴性对照。
3. 进行中性红（NR）染色时，用无血清DMEM配制0.5 mg/mL的NR溶液，并通过0.2 µm滤膜过滤。
4. 对96孔板和腔室载玻片中的空泡进行成像：吸除培养基，加入60 µL中性红染料，在37 °C孵育15分钟。用PBS洗涤3次以去除多余染料，随后进行显微成像。
5. 使用20倍物镜在显微镜下观察空泡，评估其大小、形态及数量。

6. 使用Bafilomycin A1处理以抑制液泡形成和酸化

1. 通过将 100 µg BFA 溶解于 50 µL DMSO 中，再用 DMEM 稀释至 950 µL，配制浓度为 100 µg/mL（160.5 nM）的巴佛洛霉素 A1（BFA1）储备液。取 1 µL 该储备液加入 1.6 mL DMEM 中，得到 0.1 nM 的工作液。
2. 充分混匀后，向 96 孔板中含细胞的孔内加入 100 µL BFA 工作液。同时加入 30 µL GB 颗粒悬液，以评估对液泡和吞噬体形成的抑制作用。
3. 为抑制吞噬体酸化，向已形成液泡（先前经 GB 颗粒处理）的孔中加入 100 µL BFA 工作液。将所有孔置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时。
4. 每孔加入 60 µL 中性红（NR）染料，额外孵育 15 分钟后，分析液泡形成及酸化情况。

7. 吖啶橙（AO）染色

1. 在腔室载玻片中培养的细胞加入 50 µL GB 处理，并在标准实验条件下孵育过夜。
2. 处理后，将细胞与吖啶橙溶液（1 mg/mL）在 37 °C 下孵育 15 分钟，以实现对液泡和酸性囊泡细胞器的选择性染色。
3. 用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞 3 次，以去除未结合的染料并降低背景荧光。
4. 使用配备 20 倍物镜和蓝色激发滤光片（450–492 nm）的荧光显微镜快速分析载玻片，观察细胞形态和吖啶橙摄取情况，从而了解液泡动态变化。

结果

该研究强调了哺乳动物细胞对GB颗粒的关键细胞反应。我们使用成像流式细胞仪研究了GB颗粒在3T3-L1细胞中的内化过程（图1）。细胞暴露于颗粒的时间从30分钟到12小时不等。30分钟后，我们观察到颗粒附着在细胞表面（图1B），并且在结合位点处细胞膜开始向内折叠，表明内化过程已启动（图1C）。在结合位点周围形成了一个环状的膜突起，可能为吞噬杯结构（图1C）。最终，颗粒被发现位于较大的膜包被空泡内，显示出空泡化的动态过程（图1D）。

在我们之前的研究中，MTT 实验结果表明，在 24 至 96 小时内，用浓度范围为 0–2.5 mg/mL 的戈丹提煅烧物（Godanti Bhasma, GB）处理 3T3-L1 细胞，并未显著影响细胞活力。值得注意的是，在长期暴露期间，较高浓度下细胞活力仍保持...

讨论

吞噬作用是一种关键的免疫防御机制，能够吞噬并随后清除颗粒物、病原体以及凋亡细胞。为了理解吞噬体形成与成熟的过程，研究诸如液泡化进程、酸化以及被吞噬物质降解等动态事件，必须使用智能生物相容性颗粒结合先进的成像技术^18,19。本研究采用GB这一生物相容性模型颗粒作为吞噬作用检测系统。扫描电子显微镜（SEM）分析显示，GB颗粒具有异质性的尺寸分布，范围从0.5到5 µm¹⁶。为降低这种变异性，通过使较大颗粒自然沉降对悬浮液进行标准化处理，仅取上层部分用于后续所有实验。该方法确保了颗粒尺寸的一致性，并提高了细胞摄取的可重复性。值得注意的是，GB颗粒通过吞噬摄取可内在地诱导显著的液泡形成，且在细胞中不引起任何细胞毒性效应。成像流式细胞术（IFC）进一步揭示了该过程，显示细胞膜在颗粒黏附部位精确发生内陷。尤其在这些接触点周围观察到圆形或半圆形的膜延伸结构，提示吞噬杯的形成，而吞噬杯对于靶颗粒的内化至关重要。该吞噬杯在促进吞噬过程中发挥关键作用²⁰

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
25 cm2 培养瓶	NEST，印度	707001
96孔和6孔板	Tarsons India Pvt. Ltd.，印度加尔各答；Thermo Scientific，印度	980040; 140675
吖啶橙	印度 SRL	82407
抗生素，胰蛋白酶-EDTA 溶液	印度高媒体	628242; 655111
细胞系—HeLa、3T3-L1 和 RAW-264.7	印度浦那马哈拉施特拉邦国家细胞科学中心（NCCS）
培养皿（35 mm）	SPL Lifesciences，印度	101350
杜尔贝科’DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）	MP Biomedicles，印度	1033126
胎牛血清（FBS）	印度 High Media	651257
流式细胞仪	Millipore，美国	Amnis	Amnis 成像流式细胞仪
荧光显微镜	DiGi Lab，印度	型号：DiGi 110 Infinity
戈丹蒂药散	帕坦伽利阿育吠陀	240002
中性红染料	印度CDH	593630
延时显微镜	NanoEnTek 公司  韩国首尔	JuLi	JuLi 智能荧光细胞分析仪
延时显微镜	LEEDZ MICRO IMA. UK	编号 LIM225552358A58	EA PRIME 倒置显微镜