RNA-Seq揭示Th17细胞分化通路在辐射诱导脑损伤中的作用机制

摘要

本研究旨在探讨辐射诱导的脑损伤小鼠中 Th17 细胞分化通路的激活情况。

摘要

放射治疗是头颈部恶性肿瘤常见的治疗方式；然而，它不可避免地会对正常脑组织造成辐射损伤，最终导致放射性脑损伤（RBI）。尽管关于辐射诱导的神经炎症已有广泛研究，但RBI与Th17细胞分化通路之间的关联仍缺乏充分认识。本研究通过单次30 Gy全脑照射C57BL/6小鼠建立RBI模型。采用Morris水迷宫（MWM）、旷场实验、新物体识别实验和转棒实验评估认知功能。采用苏木精-伊红（H&E）染色分析脑组织的组织病理学改变。通过免疫荧光染色检测小胶质细胞（IBA-1）和星形胶质细胞（GFAP）的活化状态。采用RNA测序鉴定差异表达基因，同时利用Simple Western和qPCR检测Th17细胞分化相关关键信号分子的表达水平。RBI小鼠表现出显著的认知功能障碍，尤其在空间学习和记忆保持方面。组织学检查显示，受照小鼠大脑皮层和海马区的小胶质细胞和星形胶质细胞被激活。RNA测序分析发现，RBI组小鼠大脑皮层中Th17细胞分化通路显著富集。进一步通过Simple Western和qPCR验证，证实RBI小鼠大脑皮层中TGF-β、IL-6、RORγt、IL-17和P-STAT3的表达上调。这些结果表明，Th17细胞分化通路在放射性脑损伤的发病机制中发挥关键作用。由Th17细胞介导的神经炎症可能是辐射诱导认知功能障碍的重要机制。

引言

放射治疗是原发性和转移性头颈部肿瘤的重要治疗手段，但放射性脑损伤（RBI）可能作为严重并发症发生，其特征为中枢神经系统受损。RBI的发生率因肿瘤类型和治疗方式而异，据报道，脑膜瘤接受立体定向放射治疗后的发生率为28%–50%¹，鼻咽癌为1.9%–5%^2,3，低级别胶质瘤为1%–24%^4,5，脑转移瘤为8%–20%^6,7。RBI可分为急性型、早期迟发性和晚期迟发性三类，其中晚期迟发性RBI以认知功能障碍（尤其是记忆障碍）和学习能力下降为主要表现。放射性认知功能障碍（RICD）影响约50%–90%的头颈部肿瘤长期生存患者，显著降低其生活质量⁸，但其发病机制尚不明确，目前仍缺乏有效的预防和治疗策略。

神经炎症是放射性脑损伤（RBI）的关键病理特征，可加剧血脑屏障的破坏，并阻碍海马区的神经发生。Th17细胞是一类能够产生促炎性细胞因子IL-17的CD4+ T细胞亚群⁹，已被发现与多种神经退行性疾....

方案

本实验操作严格遵循 ARRIVE 指南（动物研究：体内实验报告指南）。已获得北京放射医学研究所机构动物护理和使用委员会的批准（批准编号：AF/SC-08/02；日期：2024年2月25日）。

1. 小鼠颅脑照射

1. 使用10只6至8周龄的雄性C57BL/6小鼠进行实验，将其中5只分配至RBI组，另5只分配至对照组，对照组为未接受RBI处理的空白对照小鼠。将小鼠饲养于受控环境条件下，包括恒定的温度、湿度以及12小时光照/12小时黑暗循环。实验开始前，对小鼠进行为期1周的适应性饲养。
2. 使用戊巴比妥钠（1%，50 mg/kg体重）经腹腔注射麻醉动物。通过检查动物对足垫施加压力时是否缺乏反射性反应，确认麻醉效果。麻醉开始后立即在双眼涂抹兽用眼科软膏，以防止角膜干燥。
3. 使用专用的木质固定装置将动物置于俯卧位，并用3 mm厚的铅（Pb）屏蔽板（纯度99.9%）覆盖身体非靶区部位，以确保局部照射。
4. 准直 2 x 2 cm² 照射野自带滤过（1.5 mm Al + 0.25 mm Cu）。使用集成激光十字准直系统（λ = 635 nm ± 0.5 mm 精度）将照射野对准颅骨中线，并通过集成CMOS相机系统和红外背光实时验证定位。使用X-RAD 320系统在以下参数下（320 kVp/12.5 mA，SSD = 50 cm）以1.325 Gy/mi....

结果

RBI 小鼠的认知功能障碍
在给予30 Gy全脑照射后，每周监测小鼠的体重。在第4周进行认知功能评估^th 周图1A）。初步测量结果显示，对照组与RBI组的体重相似。然而，在照射后1至3周内，RBI组体重显著下降（图1B），表明全脑照射对小鼠的生长和发育具有不利影响。

Morris水迷宫（MWM）测试结果表明，对照组的逃避潜伏期随时间呈进行性下降，而RBI组在逃避时间上未表现出显著变化。图1C）。重要的是，两组之间的逃逸潜伏期在第4天已表现出显著差异^th 和 5^th 测试天数（图1C）。对照组在空间学习阶段的第5.......

讨论

方案中的关键步骤
本方案涉及在小鼠中诱导放射性脑损伤（RBI），随后对神经炎症及 Th17 细胞分化通路进行综合评估（图6）。其中关键步骤是对 C57BL/6 小鼠实施30 Gy剂量的颅脑照射，这是RBI的成熟模型¹。使用电离室对剂量进行精确校准，以确保实验可重复性²⁸。行为学实验（包括莫里斯水迷宫，MWM）用于评估认知功能障碍²⁹，而RNA测序则揭示基因表达变化，特别是Th17细胞分化通路的激活情况³⁰，从而对RBI提供深入的分子层面理解⁸。

技术的改进与故障排除
改进措施包括优化辐照技术，并进行每周剂量校准，以确保辐射暴露的一致性³¹。添加了行为.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12-230 kDa 分离模块，8 x 25 毛细管卡盒	ProteinSimple	SM-W004	用于 SimpleWestern
抗 GAPDH 抗体	Proteintech	HRP-60004	1:500 稀释/用于 SimpleWestern 的抗体
抗 GFAP 抗体	Abcam	ab7260	1:2000 稀释/用于免疫荧光的抗体
抗 IBA-1 抗体	Abcam	ab178846	1:2000 稀释/用于免疫荧光的抗体
抗 IL-17 A/F 抗体	Thermo	MA5-23748	1:10 稀释/用于 SimpleWestern 的抗体
抗 IL-1β 抗体	CST	12242	1:50 稀释/用于 SimpleWestern 的抗体
抗 IL-6 抗体	Thermo	MA5-23800	1:5 稀释/用于 SimpleWestern 的抗体
抗小鼠检测模块	ProteinSimple	DM-002	用于 SimpleWestern 的二抗
抗 P-STAT3(Try705) 抗体	Thermo	MA5-15193	1:2 稀释/用于 SimpleWestern 的抗体
抗兔检测模块	ProteinSimple	DM-001	用于 SimpleWestern 的二抗
抗 RORγt 抗体	Thermo	14-6988-82	1:5 稀释/用于 SimpleWestern 的抗体
抗 STAT3 抗体	Thermo	710077	1:20 稀释/用于 SimpleWestern 的抗体
抗 TGF β-1,2,3 抗体	Thermo	MA5-23795	1:10 稀释/用于 SimpleWestern 的抗体
BAC 检测试剂盒	Thermo	A55860	蛋白检测
EZ 标准试剂包 1 12-230 kDa	ProteinSimple	PS-ST01EZ-8	用于 SimpleWestern
山羊抗兔 IgG H&L	Abcam	ab150077	1:1000 稀释/用于免疫荧光的抗体
RNeasy 试剂盒	Qiagen	74134	RNA 提取
SuperScript IV 第一链合成系统	Thermo Fisher Scientific	18091050	逆转录
SYBR Green 主混合液	Takara Bio	RR820A	定量 PCR
TRIzol 试剂	Invitrogen	15596026	RNA 提取