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方法文章

RNA-Seq揭示Th17细胞分化通路在辐射诱导脑损伤中的作用机制

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DOI：

10.3791/68322

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2025年6月20日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Institute of Radiation Medicine

本文内容

摘要

本研究旨在探讨辐射诱导的脑损伤小鼠中 Th17 细胞分化通路的激活情况。

摘要

放射治疗是头颈部恶性肿瘤常见的治疗方式；然而，它不可避免地会对正常脑组织造成辐射损伤，最终导致放射性脑损伤（RBI）。尽管关于辐射诱导的神经炎症已有广泛研究，但RBI与Th17细胞分化通路之间的关联仍缺乏充分认识。本研究通过单次30 Gy全脑照射C57BL/6小鼠建立RBI模型。采用Morris水迷宫（MWM）、旷场实验、新物体识别实验和转棒实验评估认知功能。采用苏木精-伊红（H&E）染色分析脑组织的组织病理学改变。通过免疫荧光染色检测小胶质细胞（IBA-1）和星形胶质细胞（GFAP）的活化状态。采用RNA测序鉴定差异表达基因，同时利用Simple Western和qPCR检测Th17细胞分化相关关键信号分子的表达水平。RBI小鼠表现出显著的认知功能障碍，尤其在空间学习和记忆保持方面。组织学检查显示，受照小鼠大脑皮层和海马区的小胶质细胞和星形胶质细胞被激活。RNA测序分析发现，RBI组小鼠大脑皮层中Th17细胞分化通路显著富集。进一步通过Simple Western和qPCR验证，证实RBI小鼠大脑皮层中TGF-β、IL-6、RORγt、IL-17和P-STAT3的表达上调。这些结果表明，Th17细胞分化通路在放射性脑损伤的发病机制中发挥关键作用。由Th17细胞介导的神经炎症可能是辐射诱导认知功能障碍的重要机制。

引言

放射治疗是原发性和转移性头颈部肿瘤的重要治疗手段，但放射性脑损伤（RBI）可能作为严重并发症发生，其特征为中枢神经系统受损。RBI的发生率因肿瘤类型和治疗方式而异，据报道，脑膜瘤接受立体定向放射治疗后的发生率为28%–50%1，鼻咽癌为1.9%–5%2,3，低级别胶质瘤为1%–24%4,5，脑转移瘤为8%–20%6,7。RBI可分为急性型、早期迟发性和晚期迟发性三类，其中晚期迟发性RBI以认知功能障碍（尤其是记忆障碍）和学习能力下降为主要表现。放射性认知功能障碍（RICD）影响约50%–90%的头颈部肿瘤长期生存患者，显著降低其生活质量8，但其发病机制尚不明确，目前仍缺乏有效的预防和治疗策略。

神经炎症是放射性脑损伤（RBI）的关键病理特征，可加剧血脑屏障的破坏，并阻碍海马区的神经发生。Th17细胞是一类能够产生促炎性细胞因子IL-17的CD4+ T细胞亚群9，已被发现与多种神经退行性疾病相关，包括多发性硬化症和帕金森病10,11。在特定炎症条件下，这些细胞能够穿过血脑屏障，参与神经炎症过程12。自2005年被发现以来，Th17细胞因其在抗病原体免疫反应以及炎症性疾病中的双重作用而受到广泛关注，使其成为研究RBI及其相关认知功能障碍机制的潜在靶点13。

本研究仅使用雄性小鼠。排除雌性小鼠旨在避免动情周期相关的神经炎症波动可能带来的混杂效应，因为黄体酮水平在周期的不同阶段可相差高达十倍14。此外，我们的实验模型旨在模拟头颈部肿瘤放射治疗的临床背景，其中约72%的患者为男性15。与此一致，大多数已发表的关于辐射诱导脑损伤（RBI）机制的研究均采用雄性啮齿类动物来建立基础病理特征16。

尽管已有多种模型被用于研究放射性脑损伤（RBI），但传统的组织病理学染色和简单的Western印迹等方法在灵敏度、通量和准确性方面存在局限性17。近年来，RNA测序（RNA-Seq）和高通量蛋白质组学等技术进步为深入理解RBI的分子机制提供了更可靠的手段18。这些技术能够全面解析基因表达变化和蛋白质水平的改变，所提供的数据比早期方法更为精确19。其中，Simple Western是一种新型自动化技术，结合了毛细管电泳与化学发光蛋白检测的优势，可在极小样本量下实现高通量分析，并显著提高实验重复性20。与传统Western印迹相比，Simple Western无需膜转移步骤，可提供定量的蛋白质表达数据，在灵敏度和重复性方面具有明显优势，尤其适用于低丰度蛋白质的检测21,22。

RNA 提取与制备的实用指南对于高质量测序和定量分析的成功至关重要。为获得最佳 RNA 提取效果，我们建议使用高质量的 RNA 提取试剂盒，并确保 RNA 浓度在 100–1000 ng/µL 范围内，且 RNA 完整性数（RIN）高于 7.0，以避免降解。在使用 Simple Western 进行蛋白质分析时，应确保蛋白样品充分变性，并以每根毛细管约 1–5 µg 的浓度上样。对于 qPCR 验证，应使用由至少 1 µg RNA 合成的高质量 cDNA，并确保逆转录条件一致。在 RNA 制备过程中常见的问题，如基因组 DNA 污染或 RNA 降解，可通过使用无 RNA 酶的实验器材并及时完成相位分离以防止 RNA 降解来避免。

通过整合这些方法，本研究旨在探究Th17细胞分化通路是否在放射性脑损伤的小鼠模型中被激活，以及其在辐射诱导的认知功能障碍发病机制中所起的作用。

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方案

本实验操作严格遵循 ARRIVE 指南（动物研究：体内实验报告指南）。已获得北京放射医学研究所机构动物护理和使用委员会的批准（批准编号：AF/SC-08/02；日期：2024年2月25日）。

1. 小鼠颅脑照射

  1. 使用10只6至8周龄的雄性C57BL/6小鼠进行实验，将其中5只分配至RBI组，另5只分配至对照组，对照组为未接受RBI处理的空白对照小鼠。将小鼠饲养于受控环境条件下，包括恒定的温度、湿度以及12小时光照/12小时黑暗循环。实验开始前，对小鼠进行为期1周的适应性饲养。
  2. 使用戊巴比妥钠（1%，50 mg/kg体重）经腹腔注射麻醉动物。通过检查动物对足垫施加压力时是否缺乏反射性反应，确认麻醉效果。麻醉开始后立即在双眼涂抹兽用眼科软膏，以防止角膜干燥。
  3. 使用专用的木质固定装置将动物置于俯卧位，并用3 mm厚的铅（Pb）屏蔽板（纯度99.9%）覆盖身体非靶区部位，以确保局部照射。
  4. 准直 2 x 2 cm2 照射野自带滤过（1.5 mm Al + 0.25 mm Cu）。使用集成激光十字准直系统（λ = 635 nm ± 0.5 mm 精度）将照射野对准颅骨中线，并通过集成CMOS相机系统和红外背光实时验证定位。使用X-RAD 320系统在以下参数下（320 kVp/12.5 mA，SSD = 50 cm）以1.325 Gy/min的剂量率对颅部区域进行单次30 Gy的X射线照射。
  5. 使用可溯源的电离室在等中心位置进行每周剂量校准。将射线束参数维持在320 kVp/12.5 mA，并采用3.2 mm Cu HVL滤过，以获得1.325 Gy/min（±3% 变异）的剂量率。每日验证射束均匀性（> 95% 位于该区域内，使用 Gafchromic EBT3 胶片测定。
  6. 每日皮下注射美洛昔康（1-2 mg/kg），连续给药3天，以控制术后疼痛。将动物置于预热的恢复室中，并持续监测直至其完全恢复意识并能维持胸卧位。在恢复期间，不得让动物无人看护。
  7. 每周记录所有小鼠的体重。观察小鼠共4周，包括1周适应期和照射后3周。

2. 动物行为分析

  1. 在RBI后3周进行行为学实验。
  2. 莫里斯水迷宫
    1. 使用一个圆形水池（直径：120 cm，高度：50 cm），加入不透明的水（20–22 °C），通过添加奶粉使水浑浊以遮蔽隐藏平台。将一个隐藏平台（直径：10 cm）固定放置于某一象限，使其位于水面下1 cm处。
    2. 在试验前，将小鼠在测试房间内适应至少30分钟。训练阶段开始时，从四个伪随机选择的入水点（北、南、东、西）之一将每只小鼠放入水中。
    3. 允许小鼠游泳最多60秒以寻找隐藏平台。若小鼠在60秒内未能找到平台，则引导其至平台并让其在平台上停留15秒。
    4. 每只小鼠每天进行4次试验，每次试验间隔15分钟。每次试验之间用温热的毛巾将小鼠彻底擦干，以防低体温。连续进行5天训练以评估学习能力的获得情况。
    5. 在探测试验当天，移除平台，让小鼠自由游泳60秒。记录其在目标象限停留的时间、穿越平台位置的次数以及游泳路径等参数。
    6. 使用自动化视频追踪系统记录并分析所有试验，实验操作者需对分组情况设盲。
  3. 旷场实验
    1. 实验前将小鼠在测试房间内适应至少30分钟。使用一个由不透明塑料制成的旷场装置（50 cm × 50 cm × 40 cm）。对测试区域进行均匀照明（通常为25–30 lux），避免产生强烈阴影，以减少小鼠应激。
    2. 在每只动物测试前，用70%乙醇彻底清洁旷场区域以消除气味线索。将小鼠轻柔地放置于旷场中心以开始实验。允许小鼠自由探索10分钟。
    3. 使用自动化追踪系统记录小鼠的运动活动和位置。将中心区域定义为总面积的内侧20%–25%。测量小鼠在中心区域停留的时间和总移动距离。
    4. 实验结束后，将小鼠放回其饲养笼，并彻底清洁装置。
  4. 新物体识别实验
    1. 实验前将小鼠在测试房间内适应至少30分钟。使用一个旷场装置（50 cm × 50 cm × 40 cm），保持均匀照明（20–30 lux）。在每只动物测试之间，用70%乙醇彻底清洁旷场区域以消除嗅觉线索。
    2. 将每只小鼠放入空旷场中，允许其自由探索10分钟。此阶段不放置任何物体。
    3. 24小时后，将两个相同物体（A和A′）放置于旷场对角的角落（距离墙壁至少8 cm）。将小鼠轻柔地放置于旷场中心，允许其探索10分钟。
    4. 使用自动化视频系统记录物体互动情况。将物体探索定义为小鼠鼻尖朝向物体且距离物体在2 cm以内。
    5. 试验结束后，将小鼠放回其饲养笼，并彻底清洁旷场区域和物体。
    6. 在1小时的记忆保持间隔后，将一个熟悉物体（A）和一个新物体（B）放置于相同位置。将小鼠重新放回旷场，允许其探索5分钟。
    7. 使用与之前相同的标准记录探索每个物体的时间。计算识别指数：
      ​识别指数（%）= [探索新物体的时间 / （探索新物体时间 + 探索熟悉物体时间）] × 100
  5. 转棒实验
    1. 测试前将小鼠在测试房间内适应至少30分钟。使用一个电动转棒装置，转棒直径约为3 cm，距底座高度约为30 cm。
    2. 将转速模式设为加速模式（在5分钟内从4 rpm加速至40 rpm）。在放置每只小鼠前，用70%乙醇清洁转棒表面。
    3. 将小鼠轻柔地放置于旋转棒的中心位置，使其朝前。启动旋转并立即开始计时。
    4. 由系统自动记录小鼠跌落的潜伏期。小鼠跌落后应安全接住，避免受伤。每次试验之间至少休息15分钟，以防止疲劳。
    5. 每只小鼠每天进行3次连续试验，取跌落潜伏期的平均值作为最终结果。确保所有测试均由设盲的实验操作者在一致条件下完成。测试结束后将小鼠放回其饲养笼，并彻底消毒装置。

3. 动物安乐死与样品制备

  1. 在RBI后5周收集组织样本。
  2. 准备戊巴比妥钠（100 mg/kg）和无菌注射器。通过腹腔注射戊巴比妥钠。等待小鼠呼吸停止且心跳终止，以确认死亡。
  3. 迅速在枕骨交界处断头，并用精细剪刀矢状切开颅骨缝，然后用弯头镊子小心抬起双侧颅骨瓣，同时保持脑膜完整性，再切断神经连接。
  4. 在60秒内将完整脑组织转移至预冷的切片模具中，使用无菌剃刀片进行正中矢状切分。立即使用精密仪器记录前后径（8.2 ± 0.3 mm）、内外侧宽度（4.5 ± 0.2 mm）以及组织质量（112 ± 8 mg）。
  5. 在冰上解剖皮层和海马组织。将左半脑迅速置于液氮中冷冻，用于RNA测序、qPCR和Simple Western分析。
  6. 将右半脑固定于4%多聚甲醛（PFA）中用于组织学分析。将固定后的脑组织依次经70%至100%梯度乙醇脱水，每步持续30分钟。
  7. 用二甲苯透明脑组织2小时。在60°C下用熔融石蜡浸润组织4小时。将透明后的脑组织包埋于石蜡块中，并在室温下使其凝固。使用切片机切割厚度为5 µm的冠状切片。

4. 苏木精和伊红染色

  1. 将切片浸入二甲苯中脱蜡，每次5分钟，重复3次。通过梯度乙醇系列（100%、95%、70%）和蒸馏水进行水化，每步5分钟。
  2. 根据所需的染色强度，用苏木精染色5分钟。用流动的自来水冲洗切片5分钟，以去除多余的苏木精。
  3. 将切片在1%盐酸乙醇溶液中分化数秒，以获得理想的对比度。再次用流动的自来水冲洗5分钟。用伊红染色1分钟。
  4. 用蒸馏水短暂冲洗切片。通过梯度乙醇系列（70%、95%、100%）脱水，每步5分钟。
  5. 将切片浸入二甲苯中透明，每次5分钟，重复3次。使用封片剂加盖玻片封片。采用尼康Eclipse Ni-U显微镜配合20倍物镜采集图像。

5. 免疫荧光

  1. 将切片浸入4%多聚甲醛（PFA）中，室温固定15分钟。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤切片，每次5分钟，共3次，以去除多余的PFA。
  2. 用含0.3% Triton X-100的PBS溶液，室温孵育10分钟，对组织进行通透处理。再用5%正常血清，室温孵育1小时，以阻断非特异性结合。
  3. 根据抗体说明书，将切片与IBA-1和GFAP一抗在封闭液中按1:2000稀释后，4 °C孵育过夜。用PBS洗涤切片，每次5分钟，共3次，以去除未结合的一抗。
  4. 避光条件下，室温孵育1小时，使用Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG二抗，按1:1000稀释。用PBS洗涤切片，每次5分钟，共3次，以去除多余的二抗。
  5. 用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂封片，并用透明指甲油封固盖玻片。
  6. 使用共聚焦显微镜系统，配备20倍物镜，采集荧光图像。
  7. 使用ImageJ软件定量分析荧光强度。利用ImageJ的“分析颗粒”（Analyze Particles）工具进行定量分析，设定大小阈值为50–200 µm2 （小胶质细胞）和100–500 µm2 （星形胶质细胞）。采用滚动球算法（半径 = 50像素）扣除背景。

6. qPCR 分析

  1. 使用RNA提取试剂盒从组织中提取总RNA。按照制造商提供的方案进行匀浆、裂解和RNA纯化。
  2. 使用分光光度计对提取的RNA进行定量，测定其浓度并评估纯度（A260/A280比值）。确保RNA浓度适用于cDNA合成（100–500 ng/µL）。
  3. 使用生物分析仪评估RNA质量。确保RNA无降解（18S和28S rRNA条带清晰）且RNA完整性数（RIN）大于7。
  4. 配制20 µL反转录反应体系，包含1 µg RNA、反转录缓冲液、寡聚dT引物、dNTPs、RNase抑制剂和反转录酶。
  5. 在42 °C孵育60分钟以合成cDNA，随后在85 °C加热5分钟以灭活反转录酶。
  6. 在96孔PCR板中加入cDNA、预混液、正向引物、反向引物（表1）和无核酸酶水。每20 µL反应体系中加入2 µL cDNA，确保引物终浓度为200 nM。用光学粘性封膜密封PCR板以防止蒸发。
基因引物序列 (5'-3'，正向/反向)
TGF-β1CCACCTGCAAGACCATCGAC
CTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC
TGF-β3GGACTTCGGCCACATCAAGAA
TAGGGGACGTGGGTCATCAC
IL-6CTGCAAGAGACTTCCATCCAG
AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG
RORγtTCCACTACGGGGTTATCACCT
AGTAGGCCACATTACACTGCT
IL-17ATCAGCGTGTCCAAACACTGAG
CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT
IL-17FTGCTACTGTTGATGTTGGGAC
CAGAAATGCCCTGGTTTTGGT
GAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTG
GGGGTCGTTGATGGCAACA

表1：qPCR 引物序列。

  1. 将反应板放入实时荧光定量 PCR 仪中，并设置热循环程序。采用以下扩增条件：95 °C 预变性 3 分钟，随后进行 40 个循环，每个循环为 95 °C 变性 15 秒，60 °C 退火延伸 30 秒。
  2. 以 GAPDH 作为内参基因对目标基因的表达量进行标准化。采用 ΔΔCt 法计算相对表达水平，并以相对于对照组的倍数变化形式呈现数据。

7. RNA测序分析

  1. 根据机构动物护理规程对小鼠进行麻醉和处死。立即用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）灌注以清除循环血液。
  2. 在冰上解剖脑组织。使用无菌解剖工具分离大脑皮层。尽量缩短解剖时间以保持RNA完整性。
  3. 将皮层组织在液氮中速冻。若不立即进行RNA提取，则在 -80 °C 下保存。
  4. 使用电动匀浆器将冷冻的皮层组织（30–50 mg）在1 mL RNA提取试剂中充分匀浆，直至无可见碎片残留。
  5. 进行氯仿相分离。加入200 µL氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育2–3分钟，然后在4 °C下以12,000 x g离心15分钟。
  6. 将上层液体转移至新离心管，加入等体积70%乙醇，并使用基于硅胶柱的试剂盒进行RNA纯化。
  7. 在RNA纯化过程中使用柱上DNase消化以去除基因组DNA。用30–50 µL洗脱液收集总RNA，并置于冰上以备立即使用。
  8. 使用分光光度计测定RNA浓度和纯度。确认A260/A280比值约为2.0。取1 µL RNA在Bioanalyzer上进行分析。为测序目的，确保RNA完整性数（RIN）大于8.0。
  9. 采用poly(A)选择方法及链特异性文库构建试剂盒。按照制造商说明书构建300–400 bp的文库，并使用商业试剂盒纯化文库。
  10. 使用Bioanalyzer确认片段大小，并通过定量后等摩尔混合文库。使用Illumina测序平台进行双端测序（2×150 bp）。
  11. 使用Trim Galore去除接头序列，用FastQC评估数据质量，采用STAR将测序读段比对至小鼠参考基因组（GRCm39），并使用featureCounts进行基因表达定量。利用DESeq2鉴定差异表达基因。
  12. 基于DESeq2的输出结果，筛选显著差异表达基因（DEGs）（校正后p值 < 0.05 且 |log2FC| > 1）。基于超几何检验，使用Phyper进行GO和KEGG通路富集分析。将校正后P值 ≤ 0.05的通路认定为具有统计学显著性。

8. 简单 Western 分析

  1. 在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中匀浆小鼠大脑皮层，然后在4 °C下以12,000 × g 离心10分钟以去除碎片。使用BCA法测定蛋白浓度。
  2. 将蛋白样品与上样缓冲液混合，并在95°C孵育5分钟，以确保蛋白完全变性。
  3. 将3 µL变性后的蛋白样品加入Simple Western毛细管中。确保样品正确上样，避免溢出。将毛细管放入Simple Western仪器中。
  4. 将分离的蛋白与1:50稀释的一抗（包括p-STAT3、STAT3、RORγt、TGF-β、IL-6和IL-17）在30分钟内孵育。
  5. 用洗涤缓冲液对毛细管系统进行三次洗涤，每次5分钟，以去除未结合的一抗。加入用封闭缓冲液稀释的HRP标记的二抗，孵育30分钟。
  6. 用洗涤缓冲液再进行三次每次5分钟的洗涤，以去除多余的二抗。在Simple Western系统上运行检测程序，通过化学发光法自动检测蛋白。
  7. 使用Compass for Simple Western软件分析数据。通过比较电泳图谱中的相对峰面积来定量蛋白表达水平，并以GAPDH蛋白为内参进行数据归一化。

9. 统计分析

  1. 打开 GraphPad Prism 9.0.0. 软件。点击 文件 > 导入数据 以加载数据。数据以均值 ± 标准差（SD）形式呈现。组间比较采用非配对 t 检验。
  2. 使用 Shapiro-Wilk 检验评估数据正态性。若正态性假设不成立（p < 0.05），组间比较采用 Mann-Whitney U 检验；若满足正态性（p ≥ 0.05），则采用独立样本 t 检验评估组间差异。
  3. 报告结果时提供 p 值。将 p < 0.05 视为具有统计学显著性。使用以下符号表示：n.s. 表示无显著性，* 表示 p < 0.05，** 表示 p < 0.005，*** 表示 p < 0.0005，**** 表示 p < 0.0001。

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结果

RBI 小鼠的认知功能障碍
在给予30 Gy全脑照射后，每周监测小鼠的体重。在第4周进行认知功能评估th 周图1A）。初步测量结果显示，对照组与RBI组的体重相似。然而，在照射后1至3周内，RBI组体重显著下降（图1B），表明全脑照射对小鼠的生长和发育具有不利影响。

Morris水迷宫（MWM）测试结果表明，对照组的逃避潜伏期随时间呈进行性下降，而RBI组在逃避时间上未表现出显著变化。图1C）。重要的是，两组之间的逃逸潜伏期在第4天已表现出显著差异th 和 5th 测试天数（图1C）。对照组在空间学习阶段的第5...

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讨论

方案中的关键步骤
本方案涉及在小鼠中诱导放射性脑损伤（RBI），随后对神经炎症及 Th17 细胞分化通路进行综合评估（图6）。其中关键步骤是对 C57BL/6 小鼠实施30 Gy剂量的颅脑照射，这是RBI的成熟模型1。使用电离室对剂量进行精确校准，以确保实验可重复性28。行为学实验（包括莫里斯水迷宫，MWM）用于评估认知功能障碍29，而RNA测序则揭示基因表达变化，特别是Th17细胞分化通路的激活情况30，从而对RBI提供深入的分子层面理解8。

技术的改进与故障排除
改进措施包括优化辐照技术，并进行每周剂量校准，以确保辐射暴露的一致性31。添加了行为...

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披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

本工作的支持由北京放射医学研究所提供

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12-230 kDa 分离模块，8 x 25 毛细管卡盒ProteinSimpleSM-W004用于 SimpleWestern
抗 GAPDH 抗体ProteintechHRP-600041:500 稀释/用于 SimpleWestern 的抗体
抗 GFAP 抗体Abcamab72601:2000 稀释/用于免疫荧光的抗体
抗 IBA-1 抗体Abcamab1788461:2000 稀释/用于免疫荧光的抗体
抗 IL-17 A/F 抗体ThermoMA5-237481:10 稀释/用于 SimpleWestern 的抗体
抗 IL-1β 抗体CST122421:50 稀释/用于 SimpleWestern 的抗体
抗 IL-6 抗体ThermoMA5-238001:5 稀释/用于 SimpleWestern 的抗体
抗小鼠检测模块ProteinSimpleDM-002用于 SimpleWestern 的二抗
抗 P-STAT3(Try705) 抗体ThermoMA5-151931:2 稀释/用于 SimpleWestern 的抗体
抗兔检测模块ProteinSimpleDM-001用于 SimpleWestern 的二抗
抗 RORγt 抗体Thermo14-6988-821:5 稀释/用于 SimpleWestern 的抗体
抗 STAT3 抗体Thermo7100771:20 稀释/用于 SimpleWestern 的抗体
抗 TGF β-1,2,3 抗体ThermoMA5-237951:10 稀释/用于 SimpleWestern 的抗体
BAC 检测试剂盒ThermoA55860蛋白检测
EZ 标准试剂包 1 12-230 kDaProteinSimplePS-ST01EZ-8用于 SimpleWestern
山羊抗兔 IgG H&LAbcamab1500771:1000 稀释/用于免疫荧光的抗体
RNeasy 试剂盒Qiagen74134RNA 提取
SuperScript IV 第一链合成系统Thermo Fisher Scientific18091050逆转录
SYBR Green 主混合液Takara Bio RR820A定量 PCR
TRIzol 试剂Invitrogen15596026RNA 提取

参考文献

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