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方法文章

分析视网膜色素变性小鼠模型中光感受器的变性与保护

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DOI：

10.3791/68324

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2025年7月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neural Development and Regeneration Laboratory, Department of Neurobiology, Science and Biotechnology Graduate Program, Institute of Biology, Fluminense Federal University, 2Neural Development and Regeneration Laboratory, Department of Neurobiology, Neuroscience Graduate Program, Institute of Biology, Fluminense Federal University, 3Instituto Estadual de Hematologia Arthur de Siqueira Cavalcanti (HEMORIO)

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案概述了在视网膜色素变性小鼠模型中分析光感受器变性与保护的优化技术，包括玻璃体内给药、冷冻切片和免疫荧光。该方法可确保视网膜完整性，并为治疗干预的效果提供定量数据。

摘要

视网膜病变影响全球数亿人，是导致视力障碍和失明的重要原因。在这些疾病中，视网膜色素变性（RP）是一种以进行性视网膜退化为特征的遗传性眼病，全球约有150万至200万人受其影响。在遗传性视网膜营养不良动物模型中开展的概念验证研究，为探索疾病的病理生理机制、治疗有效性和安全性提供了重要的证据基础。小鼠玻璃体内注射和冷冻切片是研究RP模型中药物效应的常用技术，因其可将物质精确递送至玻璃体，并制备高质量的组织学样本，以详细分析视网膜的改变。此外，近年来也采用针对视紫红质恢复蛋白（recoverin）的免疫荧光细胞计数方法来研究RP模型中与视网膜退化相关的细胞变化，该蛋白是一种在视网膜光感受器中表达的钙依赖性蛋白，此方法有助于评估光感受器的丢失情况以及治疗干预后可能的细胞保护效果。玻璃体内注射技术已得到优化，通过使用细针将溶液注入玻璃体腔，以确保眼球完整性并获得可靠结果。在设定的时间段以评估药物效应后，进行组织学处理，使用冷冻切片机将样本切成10 μm厚度的切片，随后用抗recoverin抗体进行免疫荧光标记。最后通过细胞计数评估药物治疗是否产生保护作用，表现为光感受器的保留。尽管这些技术已广泛应用于视网膜病变研究并产生了一致的数据，但在实现精确的组织处理和高质量的样本制备方面仍存在挑战。本方案提供了一种标准化的方法，优化从玻璃体内注射到组织切片制备的每一步骤，确保结果具有可重复性和高质量。

引言

视觉是感觉系统中最复杂的感官之一，对于捕捉环境中的视觉刺激并将其转化为脑内处理形成图像的电化学信号至关重要。多种生物学因素（如衰老、遗传缺陷和疾病）可能损害视觉，显著影响生活质量和日常活动。

人眼由三个主要腔室组成。外层由角膜和巩膜构成，为眼球提供结构支撑。中层包括虹膜、睫状体和脉络膜，其中脉络膜负责为光感受器提供血液供应。最后，内层为视网膜，该结构负责处理光刺激，并将光转化为电信号传递至大脑以形成图像1,2。

神经视网膜由多个细胞层组成，包括感光细胞、双极细胞、水平细胞、无长突细胞和节细胞等特化细胞。此外，视网膜还含有胶质细胞，如小胶质细胞、星形胶质细胞和 Müller 细胞，以及色素上皮细胞。后者位于视网膜的非神经部分，在维持结构完整性、保护和支持感光细胞方面发挥关键作用3,4。神经部分则包含直接参与光信号捕获与处理的感觉和神经元细胞5,6,7。

视网膜对视觉至关重要，常受多种可导致失明的病理状况影响。在这些疾病中，视网膜色素变性（RP）是最主要的遗传性视网膜病变之一，其病因与超过80个基因相关8,9。RP是一种异质性疾病，主要以常染色体显性或隐性方式遗传，但也可能以X连锁方式遗传或由自发突变引起10。

根据人群和地理区域的不同，全球患病率估计介于每3,000至7,000人中有一人11,12，RP通常在青少年时期或成年早期发病，初期症状包括夜视能力下降和周边视野丧失。随着疾病进展，中心视力也会受损，最终可能导致完全失明9,13。

尽管目前尚无治愈视网膜色素变性（RP）的方法，但多种正在研发的疗法已显示出延缓或逆转疾病进展的潜力。这些方法包括基因治疗、细胞治疗、药物治疗以及电子装置。为了深入理解RP并评估新的干预手段，研究中已广泛使用小鼠视网膜变性模型。这些模型通常被称为rd（视网膜变性）模型，是研究RP分子机制及治疗方法的重要工具。在用于视网膜色素变性研究的多种模型中，Pde6βrd10/rd10（rd10）小鼠品系在编码视杆细胞特异性磷酸二酯酶β亚基的基因上存在错义突变14，其感光细胞的退变过程较为缓慢，与人类疾病中的情况相似15。

玻璃体内给药已在各类研究中广泛应用16,17,18。本方案适用于研究药物对视网膜作用的研究人员，尤其是关注光感受器细胞存活率的研究。因此，本方案的主要目标是优化在视网膜色素变性（RP）小鼠模型中通过玻璃体内注射进行药物递送的方法，并利用针对视紫红质恢复蛋白（recoverin）——一种光感受器细胞标志物——的免疫荧光染色来评估光感受器的存活情况。玻璃体内注射可实现药物的局部给药，从而减少全身性副作用，提高药物在视网膜的生物利用度，并降低对其他器官的不良影响。另一方面，针对recoverin的免疫荧光染色可对光感受器细胞的存活情况进行特异性分析，为评价该治疗策略的有效性提供有效工具。然而，这些技术的应用效果取决于多种因素，如动物模型的选择、注射的精确度以及治疗持续时间，在将本方法应用于其他实验条件时应充分考虑这些因素。

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方案

本项目及其所有实验方案均遵循国家动物实验控制委员会的动物护理指南，并已获得动物使用伦理委员会（CEUA - UFF）批准，批准编号为1464280219。

1. 动物

  1. 使用 rd10 小鼠品系，该品系会发生感光细胞退化，以及C57 Black/6品系（rd10的遗传背景）。将这些品系饲养在12小时光照/12小时黑暗循环条件下， 随意供应 可自由获取水和食物。

2. 麻醉

  1. 按照每公斤体重80 mg的氯胺酮和每公斤体重8 mg的赛拉嗪剂量，用蒸馏水稀释后进行腹腔注射。氯胺酮作为N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDA受体）抑制剂，具有镇痛作用，而赛拉嗪则发挥麻醉镇静作用。
  2. 进行腹腔注射时，注射体积按10 µL × 体重（g）计算。
  3. 固定小鼠以确保腹部操作区域清晰可见。用70%酒精清洁腹腔右下象限，并将针头斜面向上刺入该区域。
  4. 通过轻捏动物的尾巴或足掌来确认疼痛反射是否消失。若无反应，则表明动物已充分麻醉。

3. 玻璃体内注射

  1. 在动物麻醉后，暴露其眼睛，并使用10倍放大倍率的双目立体显微镜，识别角膜与巩膜之间的灰白色环状区域——即角巩膜缘，该区域为注射操作的穿刺部位。
  2. 进行注射时需另一人协助。在双目立体显微镜下，一人负责固定动物并插入针头，另一人则推动注射器活塞，将物质注入眼内。
  3. 首先，使用带有固定针头的超细注射器（31 G × 6 mm）在角巩膜缘区域进行穿刺，注意避免针头插入过深；仅插入针尖斜面的一半深度即可。
  4. 随后，将手持的预灭菌微量注射器（26 S规格，无斜面针头）插入由胰岛素注射器所建立的穿刺孔中，该注射器内含1 µL待注射液体或药物。
  5. 由助手缓慢推动注射器活塞，确保在约30秒内将全部体积注入眼内。
  6. 对同一只动物的另一只眼重复上述操作，并记录操作时间。
  7. 若存在多个实验组，需标记动物耳部，以确保各实验组的准确识别。
  8. 在每只动物的眼部滴加1滴0.01 M PBS溶液，防止角膜干燥。
  9. 完成上述操作后，将动物置于设定温度为37 °C的加热垫上，直至其苏醒，此过程可能需要1–2小时。在麻醉期间需持续监测动物状态，苏醒后将其放回笼中，等待后续分析时间点。
  10. 建议使用可见染料（如台盼蓝）进行初步训练，以帮助操作人员优化小鼠玻璃体内注射技术。
    注：染料有助于观察针头路径，从而精确调整注射深度与角度，降低对眼部结构造成损伤的风险，提高操作安全性。

4. 安乐死与眼球准备

  1. 注射后经过特定治疗时间，通过吸入5%异氟烷过量麻醉处死动物。持续暴露至呼吸停止后至少1分钟。为确保动物死亡，用手抓住动物颈背部，并用力牵拉尾巴直至颈椎脱位。
  2. 在摘除眼球前，标记颞极。将标记笔或加热的针/针头小心地接触巩膜的颞区，确保标记清晰且准确。此步骤将在切片过程中作为定位参考点。
  3. 接着暴露眼球，使用无菌手术刀和虹膜剪剪除周围组织，分离结缔组织和肌肉组织，暴露眼球。在小鼠中，应仔细解剖眼外肌，因为该操作具有挑战性。为便于操作，可在眼睑两侧角落处用无菌手术刀做侧向切口。
  4. 使用中号弯头镊子，夹住视神经轻轻将眼球从眼眶中取出，并立即在室温（RT）下用4%多聚甲醛（PFA）溶液固定5分钟。
  5. 在PFA溶液中固定后，用中号弯头镊子将眼球转移至玻璃板上。该玻璃板作为解剖平台，确保其内含有0.1 M、pH 7.4的磷酸盐缓冲液。
  6. 随后将玻璃板置于10倍放大倍率的双目体视显微镜下，使用手术刀在角膜缘（角膜边界）稍上方做一小切口。接着使用显微虹膜剪沿角膜缘进行环形剪切，以分离角膜。
  7. 使用Dumont #5镊子移除角膜、虹膜及晶状体。最后，将眼球再次置于4% PFA溶液中固定55分钟。此后，用0.1 M、pH 7.4的磷酸盐缓冲液清洗眼球三次。

5. 冷冻保存与冷冻

注意：视网膜组织冰冻切片按照先前所述方法进行，但做了一些调整19。

  1. 使用10%、20%和30%的蔗糖梯度溶液（溶于0.1 M磷酸盐缓冲液，pH 7.4）对眼球进行低温保存。将眼球依次浸入蔗糖溶液中，从最低浓度（10%）开始，逐步过渡至最高浓度（30%）。每一步持续至眼球完全沉入容器底部，表明组织已充分渗透，可进入下一浓度。在最后的30%蔗糖溶液中，将眼球于4 °C保存约12小时。
  2. 次日，去除多余的30%蔗糖溶液，将眼球按实验分组依次放置于直径为2 cm的圆形铝制容器中。
    注意：应根据实验组数量制作适当尺寸的铝箔容器。
  3. 在10倍放大倍率的双目立体显微镜下，使用移液器或滤纸小心清除眼球内部及周围的残留蔗糖，操作过程中需注意避免损伤组织结构。
  4. 将眼球包埋于最佳切割温度（OCT）冷冻包埋剂中，注意避免在眼球内部或周围产生气泡，并在室温下静置1小时。
  5. OCT处理1小时后，将眼球调整至先前标记的参考点朝上的方向。将铝箔容器置于小型泡沫箱内的合适铝板上，准备冷冻。
  6. 小心将液氮倾倒至铝板上，围绕铝箔容器流动，确保液氮均匀分布于表面，以促进组织均匀冷冻。注意避免液氮直接接触铝箔容器内的眼球。随后，使用冷冻切片机对眼球进行切片。

6. 载玻片制备

  1. 在带磨砂边的玻璃载玻片上涂布聚-L-赖氨酸（200 μg/mL）。
  2. 静置 12 小时，待载玻片干燥后即可使用。

7. 冷冻切片

  1. 在冷冻切片机上，将冷冻组织块放置于载物台上。
  2. 转动手动轮，切出厚度为 10 μm 的切片。
  3. 调整组织块的位置，确保所有眼球在切面中均完整呈现。
  4. 持续切片，直至在明场显微镜下观察到视神经。
  5. 将切片收集到预先用多聚赖氨酸处理过的载玻片上。
  6. 将载玻片储存于 -20 °C，待分析时使用。

8. 免疫荧光

注意：免疫荧光实验按照先前所述方法进行，略有调整19,20。

  1. 将从冷冻切片机获得的切片在室温下用含有0.5% Triton X-100的100 μL 0.01 M PBS溶液孵育15分钟，以通透细胞质膜。
  2. 在室温下用0.01 M PBS洗涤切片两次，每次5分钟，以去除多余的Triton X-100。
  3. 在室温下用含有1%牛血清白蛋白（BSA）的100 μL 0.01 M PBS溶液孵育30分钟，以封闭非特异性抗体结合位点。
  4. 封闭后，在4 °C（冰箱中）用100 μL抗recoverin抗体（按1:1500比例溶于1% BSA溶液中）孵育切片，过夜，以标记视杆细胞。
  5. 次日，在室温下用100 μL抗兔多克隆二抗488或抗兔多克隆二抗568（按1:500比例溶于1% BSA溶液中）孵育切片2小时。
  6. 在室温下用0.01 M PBS洗涤切片两次，每次5分钟。
  7. 在室温下用100 μL DAPI（1 mg/mL，4',6-二脒基-2-苯基吲哚）孵育切片2-3分钟。
  8. 在室温下用0.01 M PBS洗涤切片一次，持续5分钟。
  9. 最后，用含2.5 g没食子酸正丙酯溶于40 mL甘油和0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.4）的封片剂处理切片，该试剂可作为抗荧光淬灭剂和封片介质，以保存样本。在切片上加盖盖玻片（24 mm × 50 mm），然后用指甲油封固。随后即可在显微镜下观察样本。

9. 荧光显微镜显微摄影

  1. 使用配备蓝色、绿色和红色滤光片的荧光光学显微镜对经免疫组织化学技术标记的细胞进行成像。同时连接相机以进行载玻片显微摄影。为获取显微照片，需使用装有 LAS V3.7（Leica）软件（成像软件）的计算机，并打开该软件以实现与显微镜的同步观察。
  2. 将载玻片置于显微镜载物台上。首先使用最低放大倍数的物镜和蓝色滤光片。
  3. 使用粗调和微调焦旋钮调节焦距，直至清晰观察到视网膜上被标记为蓝色的细胞（细胞核）。
  4. 选择视网膜成像的目标区域。逐步增加至40倍物镜放大倍数，并根据需要调节焦距。
  5. 调节焦距后，拔出旁通针以将显微镜图像传输至成像软件。选择所需的滤光片（A4（蓝色）、L5（绿色）和TX2（红色））。调整以下参数： 暴露, 增益，以及 伽马，以确保图像清晰，并尽可能接近显微镜下观察到的实际情况。
  6. 在400× 放大倍数下，采集四个面积为113的视野 × 113 μm，从视网膜周边向中心方向定位。确保其中两个视野代表视网膜周边区域，另两个视野代表视网膜中心区域。
  7. 为获得周边视野的显微照片，需在距中心约50处拍摄图像 μm 距离眼球边缘处。对于中心视野的显微照片，选择位于 50 μ从视神经起始处测量并采集图像。左右眼均用于定量分析，每个处理组共分析八个视野。
  8. 完成所有显微照片拍摄后，进行免疫标记细胞的手动定量分析。

10. 细胞定量

  1. 打开 ImageJ v.1.54g 程序。在程序中，依次点击 文件，然后点击 打开，并选择保存在计算机中的图像。
  2. 图像打开后，点击 多点 工具。使用此工具通过左键单击需要计数的每个细胞，以进行细胞定量。
  3. 定量外核层（ONL）中共定位的细胞，即同时表达 recoverin 和 DAPI 阳性的细胞。
  4. 计数完成后，用鼠标左键双击，查看所标记细胞的总数。
  5. 确定 recoverin 阳性细胞数量后，将细胞数填入 Excel 定量表格中，并继续下一张显微照片的分析。
  6. 对每只动物对应的 8 个视野重复上述所有步骤。
  7. 计算这 8 个视野的平均值，作为整个视网膜的一个实验数据点（n = 1）。对于周边视网膜的图表，使用周边区域视野的平均值，共四个视野：左眼两个，右眼两个。该平均值代表周边视网膜的一个实验数据点（n = 1）。中心视网膜图表的制作方法与周边视网膜图表相同，仅更换分析区域即可。

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结果

通过使用 recoverin 阳性细胞的免疫荧光标记技术，我们能够观察 rd10 和 C57Bl6 动物中感光细胞的退化模式，其中后者被视为健康对照（图 1）。如图所示，在 rd10 和野生型动物中，recoverin 阳性细胞的标记特异性地出现在感光细胞所在的外核层（ONL），并包括这些细胞内部节段的标记。随着发育进程，我们可观察到两种动物中荧光免疫染色均得以保留，但在 rd10 动物中 ONL 厚度明显减小。因此，该技术在观察不同类型细胞的分布模式方面具有有效性。

在这方面，该方案的积极成果包括该技术能够检测出两种模型之间的明显差异，显示出 rd10 动物中光感受器进行性丢失的现象，从而验证了该方法在研究视网膜色素变性等病理过程中的实用性。此外，所获得的结果突出了该方案在确保免疫荧光信号特异性和均一性方面的成功，使得能够识别出退行性变化的模式以及实验组之间的定量差异。视网膜结构保存的一致性...

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讨论

视网膜是一种精细且难以接近的组织，因此需慎重选择用于对该组织进行药理治疗的技术。玻璃体内注射是一种成熟且广泛应用的技术，可将药物直接递送至视网膜，尤其适用于治疗年龄相关性黄斑变性21、糖尿病视网膜病变22、以及视网膜色素变性23等眼病。与本实验方案一致，已有大量研究将玻璃体内注射与免疫组织化学相结合，用于观察视网膜各层结构16、17、18。这些研究结果进一步证实了这些技术在视网膜研究中的相关性和有效性。玻璃体内注射可使药物在靶部位达到有效治疗浓度，同时减少全身性不良反应。然而，必须注意可能发生的并发症，如眼内炎、视网膜脱离以及眼内压升高24。

根据我们的经验，该技术的优势之一在于能够有效...

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披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

本研究是在巴西国家科学技术发展委员会（CNPq）和里约热内卢州卡洛斯·查加斯·菲略研究支持基金会（FAPERJ）资助的研究 员项目期间完成的，部分经费由巴西高等教育人员提升协调办公室（CAPES）提供，资助代码 001。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.3% Triton-X-100Sigma-AldrichT8787封闭缓冲液溶液
1% BSASigma-AldrichA4503封闭缓冲液溶液
1% 人源 BD Fc 封闭剂BD Biosciences564220阻断缓冲液所需的 Fc 阻断剂
150 W LED灯亚马逊B07VH3CVSF用于组织光照射的LED光源
1× PBS Gibco10010-023封闭缓冲液和洗涤步骤用溶液
20加仑储物箱亚马逊B001B1C4G0光照射处理容器
40 W RGBW 泛光 LED 灯 亚马逊B08QFPJSMD用于组织光照射的RGB光源
Ag85BAbcamab43019/NA用于IBEX成像的抗体。参见表1。
α-平滑肌肌动蛋白 DyLight 755Novus BiologicalsNBP2-345221R/NA用于IBEX成像的抗体。参见表1。
亲和素/生物素封闭试剂盒Abcamab64212链霉亲和素-生物素封闭液
BD Cytofix/CytopermBD Biosciences554714固定液
BOND 脱蜡液Leica BiosystemsNC0221076脱蜡液
BOND抗原修复液1Leica BiosystemsNC0235529柠檬酸盐pH 6抗原修复溶液（ER1）
BOND抗原修复液2Leica BiosystemsNC0235530基于EDTA的pH 9抗原修复液（ER2）
BOND 研究检测系统Leica BiosystemsNC0396648自动化研究用染色试剂
BOND RX 研究型染色机Leica BiosystemsNA自动化研究染色平台
BOND 洗涤液Leica BiosystemsNC0221077洗涤缓冲液
CD15BD Biosciences347420/AB_400298用于IBEX成像的抗体。参见表1。
CD20 eFluor 660赛默飞世尔科技50-0202-82/AB_11150959用于IBEX成像的抗体。参见表1。
CD4 Alexa Fluor 488R&D SystemsFAB8165G/AB_2728839用于IBEX成像的抗体。参见表1。
CD45 藻红蛋白（PE）Novus BiologicalsNBP2-34528PE/NA用于 IBEX 成像的抗体。参见表 1。
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135/AB_2892745用于IBEX成像的抗体。参见表1。
驴抗山羊IgG Alexa Fluor Plus 488赛默飞世尔科技A32814/AB_2762838用于IBEX成像的抗体。参见表1。
驴抗小鼠IgG Alexa Fluor Plus AF647赛默飞世尔科技A32787/ AB_2762830用于IBEX成像的抗体。参见表1。
驴抗小鼠IgM Alexa Fluor 488杰克逊免疫研究实验室715-545-020/AB_2340844用于IBEX成像的抗体。参见表1。
驴抗兔IgG Alexa Fluor Plus AF555赛默飞世尔科技A32794/AB_2762834用于IBEX成像的抗体。参见表1。
EasyDip染色系统Newcomer Supply5300KIT切片染色系统
Fluoromount-G赛默飞世尔科技00-4958-02封片剂
HoechstBiotium40046用于IBEX成像的核染色。参见表1。
Imaris 文件转换器 x64 10.2.0Imaris 牛津仪器免费文件转换器
ImarisViewer 软件 x64 10.2.0Imaris 牛津仪器免费的图像处理软件
ImmEdge笔Vector LaboratoriesH-4000疏水屏障笔
硼氢化锂（1 克）STREM Chemicals93-0397用于染料失活的化学试剂，购买该试剂的小份 aliquot（1 克）
Lumican 生物素R&D SystemsBAF2846用于 IBEX 成像的抗体。参见表 1。
微型盖玻片VWR48393-241玻璃盖片
全细胞角蛋白 Alexa Fluor 750Novus BiologicalsNBP2-33200AF750/AB_2868569用于 IBEX 成像的抗体。参见表 1。
PELCO BioWave Pro 微波系统Ted Pella公司36500-230非加热型科学微波炉
PELCO SteadyTemp ProTed Pella Inc50062用于科研微波的全自动温度控制
SimpleITK开源软件注册与通道处理软件
链霉亲和素 Alexa Fluor 594赛默飞世尔科技S11227IBEX成像标记试剂。参见表1。
宽场显微镜Leica MicrosystemsNALeica Microsystems THUNDER 成像仪，配备 LED8 光源和 LAS X 软件（3.7.1.21655）。进行荧光成像时，使用定制的四通道滤光片组及外置滤光轮（货号：11536075），并配合两个额外的单通道滤光片（货号：8118215），实现每轮成像检测七个染料通道。滤光片的激发、二向色镜和发射波长分别为：（1）四通道滤光立方体：二向色镜位于 391/32、479/33、554/24、638/31，无单独的激发或发射滤光片；（2）外置滤光轮位置 1：434/32，位置 2：520/40，位置 3：585/20，位置 4：720/60，位置 5：透通；（3）单通道滤光片 1—585/22 激发，594 二向色镜，625/30 发射；（4）单波段 2—635/20 激发，647 二向色镜，667/30 发射
蔡司光学镜头清洁剂亚马逊B00GPVQVCO显微镜物镜清洁剂
抗体
Ag85BAbcamab43019多克隆兔 IgG，第1个周期
α-平滑肌肌动蛋白 DyLight 755Novus BiologicalsNBP2-345221R1A4/asm-1，周期 1
CD4 Alexa Fluor 488R&D SystemsFAB8165G多克隆山羊 IgG，第1轮
CD8 Alexa Fluor 647BioLegend372906C8/144B，第1周期
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135KP1，周期1
驴抗山羊IgG Alexa Fluor Plus 488赛默飞世尔科技A32814多克隆驴，第一轮
驴抗小鼠IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo Fisher ScientificA32787多克隆驴，第一轮
驴抗兔IgG Alexa Fluor Plus AF555赛默飞世尔科技A32794多克隆驴，第一周期
HoechstBiotium40046细胞核标记，循环1
CD15BD Biosciences347420MMA，第2周期
CD20 eFluor 660赛默飞世尔科技50-0202-82L26，第2个周期
CD45 藻红蛋白（PE）Novus BiologicalsNBP2-34528PE2B11 + PD7/26，第2周期
驴抗小鼠IgM Alexa Fluor 488杰克逊免疫研究实验室715-545-020多克隆驴，第二轮
Lumican 生物素R&D SystemsBAF2846多克隆山羊IgG，第2周期
全细胞角蛋白 Alexa Fluor 750Novus BiologicalsNBP2-33200AF750AE-1/AE-3，循环 2
链霉亲和素 Alexa Fluor 594赛默飞世尔科技S11227N/A，第二周期
HoechstBiotium40046循环 2
溶液
封闭缓冲液（第一轮）
Triton-X-100Sigma-AldrichT8787体积分数0.3%
BSASigma-AldrichA4503体积分数1%
人BD Fc封闭BD Biosciences564220体积分数1%
1× PBS Gibco10010-02397.7%（体积分数）
一抗染色液 #1（循环 1）
封闭缓冲液（第一轮）视网膜病变影响全球数亿人，是导致视觉障碍和失明的重要原因。在这些疾病中，视网膜色素变性（RP）是一种以进行性视网膜退化为特征的遗传性眼病，全球约有150万至200万人受累。在遗传性视网膜营养不良动物模型中开展的概念验证研究，为疾病病理生理机制、治疗有效性和安全性的研究提供了重要证据基础。在小鼠中进行的玻璃体内注射和冷冻切片技术被广泛用于RP模型中药物效应的研究，因为这些方法能够将药物精确递送至玻璃体腔，并制备高质量的组织学样本，以详细分析视网膜的结构改变。此外，近年来通过使用抗recoverin抗体进行免疫荧光标记并结合细胞计数的方法，被用于研究RP模型中与视网膜退化相关的细胞变化，因为该方法有助于评估光感受器细胞的丢失以及治疗干预后可能的细胞保护作用。玻璃体内注射技术已优化，以确保眼部结构完整性和实验结果的可靠性，采用细针将溶液注入玻璃体腔。在设定的观察期后评估药物效应，随后进行组织学处理，使用冷冻切片机将样本切成10 μm厚度的切片，再经recoverin抗体免疫荧光标记。最后通过细胞计数评估药物是否产生保护作用，表现为光感受器细胞的保留。尽管这些技术已在视网膜病变研究中广泛应用并产生一致的数据，但在实现精确的组织处理和高质量样本制备方面仍存在挑战。本方案提供了一种标准化的操作流程，优化从玻璃体内注射到组织切片制备的每一步骤，以确保结果的可重复性和高质量。加入抗体后定容至终体积
HoechstBiotium400461:5000
CD8 AF647BioLegend3729061:10
一抗染色溶液 #2（第一轮）
封闭缓冲液（第一轮）视网膜病变影响全球数亿人，是导致视力障碍和失明的重要原因。其中，视网膜色素变性（RP）是一种遗传性眼病，以进行性视网膜退化为特征，全球约有150万至200万人受累。在遗传性视网膜营养不良的动物模型中开展的概念验证研究，为疾病发病机制、治疗有效性和安全性的研究提供了重要证据基础。小鼠玻璃体内注射和冷冻切片技术被广泛用于RP模型中药物效应的研究，因其可将物质精确递送至玻璃体腔，并制备高质量的组织学样本，以详细分析视网膜结构改变。此外，近年来通过使用抗恢复蛋白（recoverin）抗体进行免疫荧光细胞计数，被用于研究RP模型中与视网膜退行性变相关的细胞变化。恢复蛋白是一种在视网膜光感受器中表达的钙依赖性蛋白，该方法有助于评估光感受器的丢失情况以及治疗干预后可能的细胞保护效果。玻璃体内注射技术已优化，以确保眼球完整性并获得可靠结果，采用细针将溶液注入玻璃体腔。在设定的时间段以评估药物效应后，进行组织学处理，使用冷冻切片机将样本切成10 μm厚的切片，随后用抗恢复蛋白抗体进行免疫荧光标记。最后通过细胞计数评估药物治疗是否产生保护作用，表现为光感受器的保留。尽管这些技术已在视网膜病变研究中广泛应用并产生一致的数据，但在实现精确的组织处理和高质量样本制备方面仍存在挑战。本方案提供了一种标准化方法，优化从玻璃体内注射到组织切片制备的每一步骤，确保结果的可重复性和高质量。加入抗体后加液至终体积
CD4 AF488R&D SystemsFAB8165G1:10
Ag85BAbcamab43019/NA1:100
第二抗体染色溶液#1（循环1）
封闭缓冲液（第一轮）视网膜病变影响全球数亿人，是导致视力障碍和失明的重要原因。其中，视网膜色素变性（RP）是一种遗传性眼病，以进行性视网膜退化为特征，全球约有150万至200万人受累。在遗传性视网膜营养不良的动物模型中开展的概念验证研究，为疾病病理生理机制、治疗有效性和安全性的研究提供了重要证据基础。在小鼠中进行的玻璃体内注射和冷冻切片技术被广泛用于RP模型中药物效应的研究，因其可实现向玻璃体腔内精确递送物质，并制备高质量的组织学样本，以深入分析视网膜结构变化。此外，近年来通过使用抗恢复蛋白（recoverin）抗体进行免疫荧光标记并结合细胞计数的方法，也被用于研究RP模型中与视网膜退行性变相关的细胞变化，因为该方法有助于评估光感受器细胞的丢失情况以及治疗干预后可能的细胞保护效应。玻璃体内注射技术已优化，以确保眼球结构完整并获得可靠结果，采用细针将溶液注入玻璃体腔。在设定的观察期后评估药物效应，随后进行组织学处理，使用冷冻切片机将样本以10 μm厚度切片，再经恢复蛋白抗体免疫荧光标记。最后通过细胞计数评估药物治疗是否产生保护作用，表现为光感受器细胞的保留。尽管这些技术已在视网膜病变研究中广泛应用并产生一致的数据，但在实现精确的组织处理和高质量样本制备方面仍存在挑战。本方案提供了一种标准化操作流程，优化从玻璃体内注射到组织切片制备的每一步骤，确保结果具有可重复性和高质量。加入抗体后定容至终体积
驴抗山羊 AF Plus 488赛默飞世尔科技A32814/AB_27628381:100
驴抗兔 AF Plus 555赛默飞世尔科技A32794/AB_27628341:100
驴抗小鼠 AF Plus 647赛默飞世尔科技A32787/AB_27628301:50
一抗染色液 #3（循环 1）
封闭缓冲液（第一轮）视网膜病变影响全球数亿人，是导致视力障碍和失明的重要原因。其中，视网膜色素变性（RP）是一种遗传性眼病，以进行性视网膜退化为特征，全球约有150万至200万人受累。在遗传性视网膜营养不良动物模型中开展的概念验证研究，为疾病发病机制、治疗有效性和安全性的研究提供了重要证据基础。小鼠玻璃体内注射和冷冻切片技术被广泛用于RP模型中药物效应的研究，因其可将物质精确递送至玻璃体腔，并制备高质量的组织学样本，以详细分析视网膜结构改变。此外，近年来通过使用抗恢复蛋白（recoverin）抗体进行免疫荧光细胞计数，被用于研究RP模型中与视网膜退行性变相关的细胞变化。恢复蛋白是一种在视网膜光感受器中表达的钙依赖性蛋白，该方法有助于评估光感受器的丢失情况以及治疗干预后可能的细胞保护效果。玻璃体内注射技术已优化，以确保眼球完整性并获得可靠结果，采用细针将溶液注入玻璃体腔。在设定的时间段以评估药物效应后，进行组织学处理，使用冷冻切片机将样本切成10 μm厚的切片，随后用抗恢复蛋白抗体进行免疫荧光标记。最后通过细胞计数评估药物治疗是否产生保护作用，表现为光感受器的保留。尽管这些技术已在视网膜病变研究中广泛应用并产生一致的数据，但在实现精确的组织处理和高质量样本制备方面仍存在挑战。本方案提供了一种标准化方法，优化从玻璃体内注射到组织切片制备的每一步骤，确保结果的可重复性和高质量。加入抗体后定容至终体积
CD68 iF594Caprico Biotechnologies10641351:10
α-SMA DL755Novus BiologicalsNBP2-345221R/NA1:30
无 BSA 封闭缓冲液（第二轮） 
Triton-X-100Sigma-AldrichT8787体积分数0.3%
人BD Fc阻断剂BD Biosciences564220体积分数1%
1× PBS Gibco10010-023体积分数为98.7%
一抗染色溶液 #4（第二轮）
无 BSA 封闭缓冲液（第二轮）视网膜病变影响全球数亿人，是导致视力障碍和失明的重要原因。其中，视网膜色素变性（RP）是一种遗传性眼病，以进行性视网膜退化为特征，全球约有150万至200万人受累。在遗传性视网膜营养不良的动物模型中开展的概念验证研究，为疾病发病机制、治疗有效性和安全性的研究提供了重要证据基础。在小鼠中进行的玻璃体内注射和冷冻切片技术被广泛用于RP模型中药物效应的研究，这些技术可将物质精确递送至玻璃体，并制备高质量的组织学样本，以详细分析视网膜结构变化。此外，近年来通过使用抗恢复蛋白（recoverin）抗体进行免疫荧光细胞计数的方法也被用于研究RP模型中与视网膜退化相关的细胞变化，因为该方法有助于评估光感受器的丢失情况以及治疗干预后可能的细胞保护效果。玻璃体内注射技术已得到优化，采用细针将溶液注入玻璃体腔，以确保眼球完整性并获得可靠结果。在设定的时间段以评估药物效应后，进行组织学处理，使用冷冻切片机将样本切成10 μm厚的切片，随后用抗恢复蛋白抗体进行免疫荧光标记。最后通过细胞计数评估药物治疗是否产生保护作用，表现为光感受器的保留。尽管这些技术已在视网膜病变研究中广泛应用并产生一致的数据，但在实现精确的组织处理和高质量样本制备方面仍存在挑战。本方案提供了一种标准化方法，优化从玻璃体内注射到组织切片制备的每一步骤，确保结果具有可重复性和高质量。加入抗体后定容至体积
CD15BD Biosciences3474201:30
Lumican 生物素R&D SystemsBAF28461:100
CD45 PENovus BiologicalsNBP2-34528PE1:20
CD20 eFluor 660赛默飞世尔科技50-0202-821:10
泛细胞角蛋白 AF750Novus BiologicalsNBP2-33200AF7501:10
二抗染色溶液 #2（第二轮）
无 BSA 封闭缓冲液（第二轮）视网膜病变影响全球数亿人，是导致视力障碍和失明的重要原因。其中，视网膜色素变性（RP）是一种遗传性眼病，以进行性视网膜退化为特征，全球约有150万至200万人受累。在遗传性视网膜营养不良的动物模型中开展的概念验证研究，为疾病发病机制、治疗有效性和安全性的研究提供了重要证据基础。小鼠玻璃体内注射和冷冻切片技术被广泛用于RP模型中药物效应的研究，因其可将物质精确递送至玻璃体，并制备高质量的组织学样本，以详细分析视网膜结构变化。此外，近年来通过使用针对视紫红质恢复蛋白（recoverin）的抗体进行免疫荧光细胞计数，被用于研究RP模型中与视网膜退化相关的细胞改变，因为该方法有助于评估光感受器的丢失以及治疗干预后可能的细胞保护效果。玻璃体内注射技术已优化，以确保眼球完整性并获得可靠结果，采用细针将溶液注入玻璃体腔。在设定的时间段以评估药物效应后，进行组织学处理，使用冷冻切片机将样本切成10 μm厚的切片，随后用recoverin抗体进行免疫荧光标记。最后通过细胞计数评估药物治疗是否产生保护作用，表现为光感受器的保留。尽管这些技术已在视网膜病变研究中广泛应用并产生一致的数据，但在实现精确的组织处理和高质量样本制备方面仍存在挑战。本方案提供了一种标准化方法，优化从玻璃体内注射到组织切片制备的每一步骤，确保结果的可重复性和高质量。加入抗体后定容至体积
驴抗小鼠 IgM AF488杰克逊免疫研究实验室715-545-020/AB_23408441:100
Strepavidin AF594赛默飞世尔科技S112271:200

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