该协议提出了一种图像引导输注到兔乳腺导管树系统的程序。我们通过透视实时成像演示了将含有 X 射线造影剂的乙醇消融溶液受控输注到所有开口中。
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该协议提出了一种图像引导输注到兔乳腺导管树系统的程序。我们通过透视实时成像演示了将含有 X 射线造影剂的乙醇消融溶液受控输注到所有开口中。
乳腺癌是女性第二大癌症相关死因。虽然针对中危女性的主动干预措施很少,但预防性乳房切除术是高危女性最有效、降低风险的干预措施。然而,预防性乳房切除术是一种侵入性手术,可去除所有乳腺上皮细胞以及周围的基质、脂肪组织和/或肌肉组织。我们的总体研究目标是开发一种非侵入性导管内 (ID) 递送程序,通过用消融溶液填充整个导管树来局部杀死乳腺上皮细胞。我们之前证明,将乙醇作为消融溶液递送的ID递送对啮齿动物模型(小鼠和大鼠)是有效的。该协议将含有碘海醇(90-300mg / mL)的10-70%乙醇溶液作为X射线造影剂作为X射线造影剂递送到兔乳腺的多导管树系统中。具有多导管系统的兔子 (Oryctolagus cuniculus) 的乳腺比其他大型动物(例如牛、羊)的乳腺更像人类乳房。该兔子协议解决了可扩展性、实时成像和 ID 递送到大型动物中间模型中的多导管树系统的技术挑战。该协议建立了透视引导的多导管 ID 递送,其中包含可直接应用于临床的仪器、材料和试剂。组织分析能够优化乙醇浓度,以实现最大程度的上皮消融和最小的附带组织损伤,作为未来首次人体评估这种用于乳腺癌一级预防的消融手术的起点。
乳腺癌 (BC) 是美国女性最常见且第二高的癌症相关死亡。对 2025 年的预测估计,将有 316,950 例新发乳腺癌,42,170 名女性将死于 BC1。目前,双侧预防性乳房切除术是预防BC最有效的手术。然而,这是一种高度侵入性的手术,涉及完全切除产生乳腺癌的上皮细胞和周围组织。由于其侵入性以及该手术的心理和社会影响,只有不到 50% 的高危女性接受了降低风险的乳房切除术2。我们和其他人已经开发了用于啮齿动物模型中乳腺癌一级预防和/或局部治疗的导管内 (ID) 给药程序 2,3,作为当前预防和治疗的替代方案。乙醇 (EtOH) 具有低毒性和安全性,已得到充分认可,并用于多种临床应用,例如用于治疗静脉畸形的硬化剂和作为局部治疗某些癌症的消融剂3。通常,在这些临床程序中,以 90-100% 的浓度输注或输送几毫升 EtOH 。在我们之前的工作中,将70%的EtOH直接递送到小鼠和大鼠模型的导管树系统中可有效化学消融乳腺上皮细胞,对邻近正常组织的损害有限,并防止乳腺肿瘤的形成4,5,6,7。由于该程序被扩大到具有较大管腔体积与管腔上皮细胞表面积比的兔子的较大导管树系统,因此我们探索了具有较低百分比(10%至70%)的EtOH百分比(10%至70%)的溶液的消融特性。通过对临床转化的关注,我们推断,有效消融上皮细胞的乙醇百分比最低,耐受性最好,安全性最好。
确认完整的导管树填充对于保证消融溶液已与乳腺上皮细胞直接接触是必要的。在我们之前对啮齿动物模型的研究中,手术后通过 microCT 成像对输注的导管树进行了 X 射线可视化。由于麻醉、转移、设置和定位动物进行成像所需的时间流逝,FDA批准的Omnipaque(碘己醇)或类似的含碘快速扩散造影剂不适合啮齿动物的导管树可视化6,8。我们发现基于纳米颗粒的造影剂,尤其是含有氧化钽纳米晶体的造影剂,扩散速度较慢,更适合啮齿动物的导管树可视化 6,7,8,9。然而,通过microCT成像进行的这种后验确认不允许我们监测或控制输注体积的量,并且偏离了临床上建立的诊断程序,例如用于导管树可视化的导管造影术10,11。因此,建立将这种ID程序转化为人类的技术可行性的关键步骤是在乳腺大小和复杂性不断增加的动物模型中展示输注导管树的实时透视可视化。该协议将这种消融手术从啮齿动物 4,5 扩展到兔子模型。从进化、解剖学和生理学上讲,兔乳腺比啮齿动物或其他大型动物模型(如牛和羊)的乳房更相似 12,13,14。雌性兔子有四对乳腺,每对包含四棵导管树,而啮齿动物每个乳腺只有一棵导管树。兔可以插管15,16,使用类似于临床导管造影术中造影剂的 ID 给药的程序,在首次人体临床研究中。因此,兔为这种ID消融手术在人类中的转化应用提供了实用且相关的中间大型动物模型。该协议解决了在啮齿动物模型中无法解决的多导管树系统的 ID 递送和体内成像的技术挑战。该协议使用与当前临床实践兼容的仪器、试剂和材料来可视化导管树。因此,所描述的含碘己醇乙醇消融溶液的透视引导输注程序可以在首次人体临床试验中轻松实施和评估。
这种方法已在我们的实验室中实施,在一次疗程中成功地插管并依次输注兔子一个或多个乳腺的所有四个导管树,并用含有造影剂的乙醇基消融溶液(图1, 图2, 图3)。该方法包括在透视台上用兔子(4个月处女)的27 G钝头针头将消融溶液直接注入插管开口。该程序是在全身麻醉(异氟醚)下对动物进行的,并进行围手术期和术后抗炎治疗(酮洛芬,非甾体抗炎药)。透视成像使我们能够实时监测导管树的填充情况,控制分配体积的速率和量,和/或确定ID递送在每个单独的树系统中的成功程度(图1, 图2, 图3)。这种透视技术更接近消融治疗图像引导的预期临床应用,并有助于限制施加在患者身上的总体辐射剂量。该协议表明,FDA批准的Omnipaque(碘己醇)是一种合适的造影剂,用于可视化兔导管树的初始填充(图3)。通过大体检查和组织学分析观察表明,70% 的乙醇浓度会导致导管树内外的快速组织损伤,并延伸到乳腺结构之外(图 3)。10-40%范围内的乙醇浓度提供了足够的上皮细胞消融,与70%乙醇相比,附带组织损伤更低(图4)。需要使用该程序进行纵向研究,每个消融溶液具有适当的功效组大小和定时组织收集,以建立消融溶液的最佳参数,以进行其在人类患者中的临床评估。
所有描述的实验都是根据密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行的。兔子 (Oryctolagus cuniculus) 根据《实验动物护理和使用指南》和美国农业部动物福利法在 AAALAC 认可的设施中得到照顾。
注意:该方法是在从商业来源获得的处女(未产)和退休饲养员(经产)新西兰白动物中进行的,这些动物的年龄(4个月至>1岁)和体重(2.6至4.2公斤)不等。根据我们的经验,由体重决定的动物大小比动物的年龄更可靠,无法预测的大小。通常,体重超过 3.3 公斤的动物会出现适合插管的。下面描述的方案侧重于4-5个月大且体重超过3.3公斤的处女动物,因为它们更适合长期疗效,伤口愈合,毒性和安全性研究。
1.术前准备
2. 导管内输液
3. 透视成像
4. 术后护理和恢复
5. 组织分析
雌性兔子的 8 个乳腺中的每一个都包含 4 个导管树,这些导管树在独立的孔处打开(图 2)。由于啮齿动物之间每个乳腺的导管树的大小和数量不同(每个乳腺只有 1 个导管),兔子是人类翻译的良好中间模型。我们可以注入多达400μL的10-70%EtOH溶液,以填充4个月大的新西兰白兔任何乳腺的整个导管树(图1,图2,图3,图4 4,8,9)。我们可以在一次疗程中向多达 8 个乳腺中的多达 4 根导管树注入消融溶液。典型的实验设计包括将含有碘基X射线造影剂的特定消融溶液注入多达4个乳腺中的单个乳腺内的2-3个导管树(图2, 图3)。对于含碘己醇(90-300 mg碘/ mL)消融溶液,在每次输注期间和/或之后进行透视,以确定用部分或全部量的输注溶液输注每个导管树的个体成功(图2,图3)。收集乳腺组织可以评估配方的变化如何影响乳腺上皮细胞的破坏(图4)。这些成像分析提供了了解最合适的解决方案的信息,以实现最大程度的消融,同时最大限度地减少周围组织损伤。我们确定 10% EtOH 溶液提供的消融率与含有更高比例 EtOH 的消融溶液相当(图 4)。

图 1:导管内手术的工作流程。 突出显示了 ID 程序的关键步骤。详情请看视频。 请点击此处查看此图的大图。

图 2:导管内插管和输注的关键步骤。 (A)垂直于注射生理盐水以扩张导管开口以进行插管(正中平面视图)。(B)导管树(D1)的插管和填充可以用烧蚀溶液中的蓝色染料进行跟踪(正中平面视图)。(C) 实时透视成像可精确和高分辨率地监测烧蚀溶液中含有碘海醇的导管树填充 (D1)(背平面视图)。导管树开口从左到右编号,从上象限(D1,左上象限)开始,到下象限(D4,右下象限)结束。 请点击此处查看此图的大图。

图 3:大小和消融溶液成功输送到多个导管。 新西兰白兔大小的典型表现。奶嘴大小根据兔子的体重和年龄而变化。乳腺从左上角(L1,左颈)到右下角(R8,右腹股沟)编号。所有图像都显示在背侧平面。(A)2.8公斤处女兔(上),较小,难以插管,3.5公斤处女兔(中),适合插管,4.1公斤经产兔(下),较大,更容易插管。(B)注入溶液中的蓝色食用色素可用作导管内输送和导管树填充的 体内 证据。输注不成功时以红色轮廓(脂肪垫输送,顶部)表示,输注成功时以蓝色轮廓表示(导管内输送,中间和底部)。与 10% 的溶液(浅蓝色,下图)相比,70% 的 EtOH 溶液在输注几分钟后对皮肤造成更大的损伤(红斑)(深蓝色,中图)。(C) 透视提供了导管内给药的 体内 证据。输液不成功(脂肪垫输送,顶板)。成功顺序输注 D1 导管第一和 D2 导管树第二(左下图)。实时透视为 D3 导管树(右下图)的填充(白色箭头)提供图像指导;充满含碘海醇的消融溶液和用于固定的镊子的延长线也可见。比例尺对应于不同放大倍率图像中的 1 厘米。 请点击此处查看此图的大图。

图4:新西兰白兔在使用乙醇基消融溶液进行导管内手术后的乳腺组织分析。 (A-B)与另一只接受10%EtOH消融处理的动物的右腹股沟乳腺相比,未消融治疗的4个月大动物的右腹股沟乳腺的代表性H&E染色。组织切片沿正中平面切割,因此 D1 和 D3(左导管树)表示在同一组织切片上。全组织视图(A)和高放大倍率视图(B)显示了EtOH消融对H&E染色的形态学和色度影响(上图),并根据计算机辅助训练的分类器推断出上皮细胞和基质细胞类别(下图)。黑色比例尺对应于 A 中的 1 mm,白色比例尺对应于 B 中的 100 μm。(C)图条显示用不同浓度的EtOH处理或未处理的导管树(每组n>4个)中的细胞类别分布。星号表示每组每个细胞类别的未配对韦尔奇 t 检验的 p 值与 10% EtOH 处理组中的匹配细胞类别的比较(* <0.05, ** < 0.01, **** <0.0001)。 请点击此处查看此图的大图。
在我们之前的研究中,我们已经表明,70% EtOH 的 ID 递送可以消融乳腺上皮细胞,同时对啮齿动物周围组织造成的损伤最小 6,7。在此过程中,我们已经证明了消融溶液的ID输注可以放大到兔模型。特别是,我们在这个具有多导管树系统的更大模型中证明,可以成功输注乳腺内所有导管的顺序输注。这代表了将这种消融手术转化为预防性乳房切除术的可行替代方案的下一阶段,用于高危人群的一级预防。
FDA 批准的碘基 X 射线造影剂 Omnipaque(碘己醇)使我们能够通过导管树实时可视化溶液输送过程来评估输注的成功。使用透视来可视化输注的乳腺与可能部署的设备和仪器密切相关,以将这种图像引导程序带到诊所10,11。这种成像方式将使我们能够知道何时停止输注,从而使活体透视成为这种消融手术临床实施的关键组成部分。我们建立了该程序从啮齿动物到兔导管树的可扩展性,但需要进一步研究来确定在这种更大的动物模型中最好地消融乳腺上皮细胞同时最大限度地减少周围组织损伤的 EtOH 百分比。该方案侧重于手术后立即进行导管内输注和组织分析的可行性。表 1 详细介绍了故障排除策略和有用提示。虽然该协议的主要重点是提供基于乙醇的消融溶液,但该协议可用于其他应用,以局部递送其他成像试剂,基因修饰系统,如CRISPR / Cas9,慢病毒载体,siRNA,生长因子和/或致癌物2,3,以研究兔乳腺发育和肿瘤发生的其他方面。
总之,该协议提供了对不同消融溶液的局部和全身效应进行系统和纵向研究所需的研究工具。这些信息将确定该程序的安全性,并查明与首次人体临床试验中的进一步开发和临床评估相关的任何问题。
作者没有什么可透露的。
这项工作部分得到了美国国家癌症研究所 R01 CA258314 对 LFS 的资助的支持。我们感谢密歇根州立大学兽医医疗中心使用他们的成像系统和技术专长(Luke Syperda 和 Susan Rosser)、密歇根州立大学校园动物资源的技术援助(Rebecca Winget),以及密歇根州立大学精准健康计划组织分析核心设施和密歇根州立大学定量生物元素分析和测绘 (QBEAM) 中心的技术援助。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 倍放大镜,带灯和夹子,大鹅颈管 | 亚马逊河 | B0D982JCZ2 | 用于可视化 |
| Exel International 胰岛素注射器 | 费雪科学 | 14-841-31 | 用于盐水的导管周围注射 |
| 散装钝针规格 27 长度 0.5 | SAI 输液技术 | B27-50 100 散装 | 用于导管内插管 |
| 埃文斯蓝 | 西格马 | E2129-50G | 用于乳腺可视化 |
| 透视X射线成像系统 | GE医疗 | DT-C31-01 | 用于荧光图像采集 |
| HotDog 兽医保暖毯 | 热狗 | WC71V型 | 用于导管内手术/术前准备 |
| 公母延长线,长度 12 英寸 | SAI 输液技术 | 分机-12 | 用于导管内手术 |
| Omnipaque 500 mL(350 毫克碘/mL) | GE医疗 | 0407-1414-72 | 用于 X 射线可视化(透视)的造影剂 |
| 无菌蓝色食用色素 | 味好美 | 930641 | 用于乳腺可视化 |
| 无菌磷酸盐缓冲盐水 (PBS) | 赛默飞世尔 | 14190250 | 用于溶液制备 |
| 注射器 | 屋宇 署 | 309659 | 用于导管内输液 |
| V型凝胶 | Docsinnovent 文档 | D30001 - 30006 | 用于插管(目录号取决于 V 凝胶的大小) |
| 酮洛芬 | 科维特鲁斯 | #005488 | 镇痛 |
| 氯胺酮 | 科维特鲁斯 | 71069 | 镇痛 |
| 外用利多卡因 | 科弗图斯 | 70859 | 镇痛 |
| 甲苯噻嗪 | 科维特鲁斯 | 80907 | 用于麻醉 |
| 尤塔索尔 | 科维特鲁斯 | #009444 | 用于安乐死 |
| 眼部润滑剂 | 科维特鲁斯 | 75848 | 用于麻醉 |
| 阿硫帕美唑 | 科维特鲁斯 | 82124 | 用于麻醉 |
| 香蕉片 | 生物服务 | #F7161 | 适应环境 |
| 愤怒宝石 | 生物服务 | #F5136-1 | 适应环境 |
| 酸奶滴剂 | 生物服务 | #F7200-1 | 适应环境 |
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