基于乙醇的导管内消融输注预防兔模型乳腺癌的 X 射线可视化

乳腺癌 （BC） 是美国女性最常见且第二高的癌症相关死亡。对 2025 年的预测估计，将有 316,950 例新发乳腺癌，42,170 名女性将死于 BC¹。目前，双侧预防性乳房切除术是预防BC最有效的手术。然而，这是一种高度侵入性的手术，涉及完全切除产生乳腺癌的上皮细胞和周围组织。由于其侵入性以及该手术的心理和社会影响，只有不到 50% 的高危女性接受了降低风险的乳房切除术²。我们和其他人已经开发了用于啮齿动物模型中乳腺癌一级预防和/或局部治疗的导管内 （ID） 给药程序 ^2,3，^作为当前预防和治疗的替代方案。乙醇 （EtOH） 具有低毒性和安全性，已得到充分认可，并用于多种临床应用，例如用于治疗静脉畸形的硬化剂和作为局部治疗某些癌症的消融剂³。通常，在这些临床程序中，以 90-100% 的浓度输注或输送几毫升 EtOH 。在我们之前的工作中，将70%的EtOH直接递送到小鼠和大鼠模型的导管树系统中可有效化学消融乳腺上皮细胞，对邻近正常组织的损害有限，并防止乳腺肿瘤的形成4,5,6,7。由于该程序被扩大到具有较大管腔体积与管腔上皮细胞表面积比的兔子的较大导管树系统，因此我们探索了具有较低百分比（10%至70%）的EtOH百分比（10%至70%）的溶液的消融特性。通过对临床转化的关注，我们推断，有效消融上皮细胞的乙醇百分比最低，耐受性最好，安全性最好。

确认完整的导管树填充对于保证消融溶液已与乳腺上皮细胞直接接触是必要的。在我们之前对啮齿动物模型的研究中，手术后通过 microCT 成像对输注的导管树进行了 X 射线可视化。由于麻醉、转移、设置和定位动物进行成像所需的时间流逝，FDA批准的Omnipaque（碘己醇）或类似的含碘快速扩散造影剂不适合啮齿动物的导管树可视化^6,8。我们发现基于纳米颗粒的造影剂，尤其是含有氧化钽纳米晶体的造影剂，扩散速度较慢，更适合啮齿动物的导管树可视化 6,7,8,9。然而，通过microCT成像进行的这种后验确认不允许我们监测或控制输注体积的量，并且偏离了临床上建立的诊断程序，例如用于导管树可视化的导管造影术^10,11。因此，建立将这种ID程序转化为人类的技术可行性的关键步骤是在乳腺大小和复杂性不断增加的动物模型中展示输注导管树的实时透视可视化。该协议将这种消融手术从啮齿动物 ^4,5 扩展到兔子模型。从进化、解剖学和生理学上讲，兔乳腺比啮齿动物或其他大型动物模型（如牛和羊）的乳房更相似 12,13,14。雌性兔子有四对乳腺，每对包含四棵导管树，而啮齿动物每个乳腺只有一棵导管树。兔可以插管^15,16，使用类似于临床导管造影术中造影剂的 ID 给药的程序，在首次人体临床研究中。因此，兔为这种ID消融手术在人类中的转化应用提供了实用且相关的中间大型动物模型。该协议解决了在啮齿动物模型中无法解决的多导管树系统的 ID 递送和体内成像的技术挑战。该协议使用与当前临床实践兼容的仪器、试剂和材料来可视化导管树。因此，所描述的含碘己醇乙醇消融溶液的透视引导输注程序可以在首次人体临床试验中轻松实施和评估。

这种方法已在我们的实验室中实施，在一次疗程中成功地插管并依次输注兔子一个或多个乳腺的所有四个导管树，并用含有造影剂的乙醇基消融溶液（图1， 图2， 图3）。该方法包括在透视台上用兔子（4个月处女）的27 G钝头针头将消融溶液直接注入插管开口。该程序是在全身麻醉（异氟醚）下对动物进行的，并进行围手术期和术后抗炎治疗（酮洛芬，非甾体抗炎药）。透视成像使我们能够实时监测导管树的填充情况，控制分配体积的速率和量，和/或确定ID递送在每个单独的树系统中的成功程度（图1， 图2， 图3）。这种透视技术更接近消融治疗图像引导的预期临床应用，并有助于限制施加在患者身上的总体辐射剂量。该协议表明，FDA批准的Omnipaque（碘己醇）是一种合适的造影剂，用于可视化兔导管树的初始填充（图3）。通过大体检查和组织学分析观察表明，70% 的乙醇浓度会导致导管树内外的快速组织损伤，并延伸到乳腺结构之外（图 3）。10-40%范围内的乙醇浓度提供了足够的上皮细胞消融，与70%乙醇相比，附带组织损伤更低（图4）。需要使用该程序进行纵向研究，每个消融溶液具有适当的功效组大小和定时组织收集，以建立消融溶液的最佳参数，以进行其在人类患者中的临床评估。

所有描述的实验都是根据密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行的。兔子 （Oryctolagus cuniculus） 根据《实验动物护理和使用指南》和美国农业部动物福利法在 AAALAC 认可的设施中得到照顾。

注意：该方法是在从商业来源获得的处女（未产）和退休饲养员（经产）新西兰白动物中进行的，这些动物的年龄（4个月至>1岁）和体重（2.6至4.2公斤）不等。根据我们的经验，由体重决定的动物大小比动物的年龄更可靠，无法预测的大小。通常，体重超过 3.3 公斤的动物会出现适合插管的。下面描述的方案侧重于4-5个月大且体重超过3.3公斤的处女动物，因为它们更适合长期疗效，伤口愈合，毒性和安全性研究。

1.术前准备

1. 动物抵达后在新设施中适应至少 1 周，特别是对于用于恢复程序和长期研究的动物。在第一周，每天监测/检查兔子，并按照机构指南的建议提供零食和营养丰富，以帮助适应过程。
2. 从批准的住房设施中获取兔子（~ 4 个月大的新西兰白兔）。手术前记录体重。
   注意：可以在手术前一天记录体重，以准备麻醉所需的计算。也可以使用退休饲养员（> 1 岁，> 3.5 公斤），因为它们具有更大的，并且更容易插入单个导管（图 3）。由于这些原因，退休饲养员可用于初始实验，以熟悉和优化导管内程序。
3. 在异氟醚给药前20分钟肌肉注射35mg / kg氯胺酮和5mg / kg甲苯噻嗪以镇静动物。
   注意：麻醉是根据兔子的体重进行的，每种药物的范围如下：氯胺酮为15-35mg / kg，甲苯噻嗪为2-5mg / kg。在进行脱毛和插管之前，确保动物已镇静。这是为了动物和工作人员的福利和安全。确认镇静后，可以将兔子背侧放在成像/手术台上。
4. 在出现镇静临床症状（即举止安静，眼睛部分闭合和粉红色）后，皮下注射 5 mg/kg 酮洛芬镇痛。
   注意：镇痛是根据兔子的体重进行的，酮洛芬的范围为2-5mg / kg。
5. 使用适当的设备（例如，气管插管或声门上气道装置）为兔子插管，并连接到经过充分测试和认证的异氟醚机器（1-2%异氟醚，1.0 L / min氧气）可以麻醉兔子。仔细监测动物的呼吸，确保麻醉维持在异氟醚的 1-2%。在整个过程中通过SpO₂，心率，呼吸频率和温度监测兔子的血氧饱和度。
   注意：插管的尺寸取决于兔子的体重和大小。然而，尺寸范围并不总是准确的，因此拥有多种尺寸以查看哪一种最适合该特定兔子会很有帮助。鼻锥面罩也可以代替气管插管用于麻醉目的¹⁷，请注意该面罩不能通过插管为动物的气道提供保护。将设置为37°C的温水循环毯（温暖毯）放在毛巾下，以保持兔子的体温。
6. 将 25 G 静脉导管放置并固定到耳边缘静脉中，以便紧急给药。
   注意：根据兔静脉的大小，可以使用 24 到 26 的规格范围。
7. 在双眼上涂抹眼部润滑剂，以防止眼睛刺激和角膜干燥。
8. 用电动剃须刀剃掉第二对和第三对周围的皮毛。使用棉尖涂抹器将脱毛膏涂抹在区域。让乳霜接触该区域 15 秒。
   注意： 必须格外小心，以免剃须刀损坏任何。无绳吸尘器也可用于帮助保持手术区域清洁。
9. 用无菌盐水润湿纱布垫，并在涂抹脱毛膏 15 秒后用它冲洗乳霜并松开动物的皮毛。确认良好的能见度和可从去除皮毛的区域进入。如有必要，请重复。
   注意：乳霜应在兔子身上停留尽可能短的时间间隔，在10-30秒之间，并完全去除，以避免对皮肤进行化学灼伤。

2. 导管内输液

1. 通过在BSL2组织培养罩中无菌条件下从储备溶液中混合适当体积的溶液来制备消融溶液。
   注意：碘海醇（350 mg碘/ mL）由于对光敏感，应储存在黑暗区域。该实验期间使用了一系列 EtOH 浓度。为了测试其他百分比的 EtOH，将储备溶液稀释至必要浓度的烧蚀溶液。为了在烧蚀溶液中保持相同浓度的碘，可以使用不同百分比的 EtOH、PBS 或无菌水来填充体积差。
2. 对于此示例，在 5 mL 管中制备 10% EtOH、280 mg 碘/mL 碘己醇、1% 食用染料的新鲜消融溶液。对于 5 mL 的最终体积，加入 4 mL 碘己醇储备液（350 mg 碘/mL）、500 μL 100% EtOH（200 证明）、450 μL PBS、50 μL 原液蓝色食用色素。
   注意：每个导管树最多可填充 400 μL，但对于 3.5 kg 以下的动物，通常为 250-350 μL。可以使用高达 0.2% 的 Evans Blue 代替食用色素。如果打算在输注后立即进行全安装或其他组织分析，Evans Blue 可能是首选。
3. 用细尖镊子去除覆盖导管开口的任何死皮。
   注意：兔子可能有一个角化塞子从突出，如果不移除，可能会阻止成功插管。外用利多卡因也可以涂抹在周围，以帮助最大限度地减少注射部位周围的刺激（表 1）。
4. 用洗必泰纱布垫擦拭输液部位。
   注意：洗必泰用作清洁剂，在插管前对注射部位进行消毒（表1）。
5. 将 28 G 针头（长度：12.7 mm）的斜面插入侧面，并以 200 μL/min 的速度缓慢注入 200 μL 0.9% 生理盐水。这样可以更好地可视化导管开口。
   注意：并非所有 200 μL 盐水可能需要注射到中;一旦看到生理盐水从一个或多个导管开口流出，就停止注射。
6. 使用 1 mL 鲁尔锁注射器吸出 1 mL 制备的消融溶液。将注射器连接到 12 英寸公母延长线的母“翼”端。小心地将一根 27 G 钝头针（长度：12.7 毫米）连接到延长线的公端。用溶液灌注生产线。用酒精纱布垫将针头擦拭干净。另外，请注意不要用烧蚀溶液倾倒注射器，因为这可能会导致形成气泡。
   注意：这些是旨在完全填充导管树的推荐体积：每棵树最多 300 μL，每个颈部和/或腹股沟乳腺（第 1^{对和第 4 对）} 最多 1.2 mL，每棵树最多 400 μL，每个胸腺和/或腹部乳腺（第 2^{对和第 3 对）} 最多 1.6 mL。对于其他应用，根据实验要求和/或透视指导，使用较小或较大的体积可能是合适的，以避免导管树过度填充。延长线可以更好地控制流速，并同时进行输液和实时透视成像。为了进行比较，9-12周龄小鼠模型⁴ 的推荐导管内输注体积为：颈部和腹股沟部最多30μL，胸部和腹部乳腺最多50μL，大鼠模型⁵：颈部和腹股沟部最多100μL，胸腹部乳腺最多300μL。
7. 使用 10 倍放大灯帮助定位导管开口。用手指轻轻握住，然后将针头插管到导管口中。轻轻地继续插入 27 G 钝头针头，直到尖端完全进入内。为了将针头容纳在中，请将朝向针头，而不是将针头向下推入。注意沿着导管开口的路径。
   注意：在某些兔子中，当您尝试将针头插入开口时，您可能会感到阻力。小心地轻轻施加压力以突破顶部上皮细胞层。根据我们的经验，需要放大装置来清楚地识别插管的导管开口。这可能是放大灯、镜头、放大镜或类似设备。
8. 针头完全插入后，以大约 200 μL/min 的恒定速率缓慢注入 300 μL 溶液。输注后等待30秒，将针头从插管树上拔出;这确保了注射体积保留在导管树内，并减少了泄漏的可能性。
   注意：通常，一名研究人员插管并握住针头，而另一名研究人员握住注射器并以所需的速率推动柱塞。注射泵可用于具有更受控的流速，因为输液速率的突然变化可能会破裂或损坏导管树。
9. 用湿纱布或 EtOH 湿巾清除任何溢出的溶液，以避免图像中出现无关的造影剂溶液。

3. 透视成像

1. 在输注每个导管树后拍摄透视图像。透视的参数为：透视X射线仪器上的30 fps、67 kV和17.3 mA。但是，请根据实验和成像需求进行调整。
2. 使用透视图像来确定是否需要额外的体积来完全填充导管树。
   注意：透视成像可以在输注消融溶液的同时进行。在成像过程中，可以使用金属或塑料镊子固定，以保护工作人员免受有害 X 射线的伤害。这允许监测导管树的填充情况。活体透视可以根据肺泡末端增加的体积指导何时停止输注。输注后的透视可以确认导管树是否完全充满或是否有渗漏。确认性透视通常在同一乳腺内输注每个导管后进行。

4. 术后护理和恢复

1. 最后一次导管内输注后停止异氟醚的流动。
2. 肌肉注射 0.5 mg/kg 阿替帕美唑。
   注意：恢复时间因动物而异，但兔子应在注射后5-20分钟开始显示恢复迹象。
3. 在温暖的毯子上为动物提供持续的热支持，直到从麻醉中完全恢复。在解除麻醉之前保持氧气流量长达 5 分钟。
   注意：恢复迹象包括咀嚼、咳嗽、鼻子抽搐和/或眼球运动等口腔运动。兔子应该有矫正反射，并且能够在放回恢复载体之前将自己保持在胸骨位置。恢复剂根据兔子的体重给药，范围为0.1-1mg / kg阿特帕美唑。
4. 皮下注射 5 mg/kg 酮洛芬。
5. 一旦兔子可以将自己保持在胸骨位置，就取出静脉导管。将纱布垫放在移除导管的位置以止血。
   注意：当兔子在运输架中时，可以移除导管。
6. 将兔子运回适当的饲养设施。
7. 术后至少 3 天继续皮下注射 5 mg/kg 酮洛芬。
8. 每天一次监测兔子是否有不适、痛苦、疼痛和自残的迹象，术后至少 3 天。如果兔子表现出任何这些临床症状，可以延长酮洛芬治疗时间。记录和监测体重以评估厌食症的迹象。
   注意：酮洛芬根据兔子的体重给药，范围为2-5mg / kg。导管内输注后可每 24 小时给药一次，持续长达 5 天，以减少炎症并最大限度地减少疤痕。为了尽量减少皮肤溃疡或其他伤口愈合相关问题的不良事件，请在注射部位局部涂抹利多卡因。任何在酮洛芬治疗后表现出持续不适、痛苦、疼痛或受伤迹象的动物都应被安乐死。

5. 组织分析

1. 以 100 mg/kg 的剂量静脉注射安乐死溶液（戊巴比妥钠和苯妥英钠）。60 秒后，通过捏脚趾/耳朵、呼吸或心跳迹象、角膜反射和/或瞳孔刺激来检查生命迹象。
2. 在10%中性缓冲福尔马林¹⁸中进行尸检以获得乳腺组织和常规石蜡包埋程序24-36小时后。然后，使用细胞类型特异性标记物进行标准苏木精和曙红（H&E）染色和/或免疫组织化学染色，以协助获得所需的分析读数¹⁸。通过适当的处置协议（例如焚烧）处理尸体。
3. 与病理学家协商分析乳腺组织。使用计算机软件程序协助量化消融率和附带组织损伤。
   注意：在输注后一小时内（图4）使用QuPath开放软件进行组织分析（https://qupath.github.io/）。该分析仅基于 H&E 染色组织。QuPath 或类似的计算机软件需要病理学家的输入和校准。一些细胞可能仅使用形态学特征进行错误分类（图 4）。使用细胞类型特异性标记物，如细胞角蛋白和α平滑肌肌动蛋白可用于改进计算机辅助分类⁶。最终，细胞分类分析必须由病理学家策划和验证。

雌性兔子的 8 个乳腺中的每一个都包含 4 个导管树，这些导管树在独立的孔处打开（图 2）。由于啮齿动物之间每个乳腺的导管树的大小和数量不同（每个乳腺只有 1 个导管），兔子是人类翻译的良好中间模型。我们可以注入多达400μL的10-70%EtOH溶液，以填充4个月大的新西兰白兔任何乳腺的整个导管树（图1，图2，图3，图4 4,8,9）。我们可以在一次疗程中向多达 8 个乳腺中的多达 4 根导管树注入消融溶液。典型的实验设计包括将含有碘基X射线造影剂的特定消融溶液注入多达4个乳腺中的单个乳腺内的2-3个导管树（图2， 图3）。对于含碘己醇（90-300 mg碘/ mL）消融溶液，在每次输注期间和/或之后进行透视，以确定用部分或全部量的输注溶液输注每个导管树的个体成功（图2，图3）。收集乳腺组织可以评估配方的变化如何影响乳腺上皮细胞的破坏（图4）。这些成像分析提供了了解最合适的解决方案的信息，以实现最大程度的消融，同时最大限度地减少周围组织损伤。我们确定 10% EtOH 溶液提供的消融率与含有更高比例 EtOH 的消融溶液相当（图 4）。

图 1：导管内手术的工作流程。 突出显示了 ID 程序的关键步骤。详情请看视频。 请点击此处查看此图的大图。

图 2：导管内插管和输注的关键步骤。 （A）垂直于注射生理盐水以扩张导管开口以进行插管（正中平面视图）。（B）导管树（D1）的插管和填充可以用烧蚀溶液中的蓝色染料进行跟踪（正中平面视图）。（C） 实时透视成像可精确和高分辨率地监测烧蚀溶液中含有碘海醇的导管树填充 （D1）（背平面视图）。导管树开口从左到右编号，从上象限（D1，左上象限）开始，到下象限（D4，右下象限）结束。 请点击此处查看此图的大图。

图 3：大小和消融溶液成功输送到多个导管。 新西兰白兔大小的典型表现。奶嘴大小根据兔子的体重和年龄而变化。乳腺从左上角（L1，左颈）到右下角（R8，右腹股沟）编号。所有图像都显示在背侧平面。（A）2.8公斤处女兔（上），较小，难以插管，3.5公斤处女兔（中），适合插管，4.1公斤经产兔（下），较大，更容易插管。（B）注入溶液中的蓝色食用色素可用作导管内输送和导管树填充的 体内 证据。输注不成功时以红色轮廓（脂肪垫输送，顶部）表示，输注成功时以蓝色轮廓表示（导管内输送，中间和底部）。与 10% 的溶液（浅蓝色，下图）相比，70% 的 EtOH 溶液在输注几分钟后对皮肤造成更大的损伤（红斑）（深蓝色，中图）。（C） 透视提供了导管内给药的 体内 证据。输液不成功（脂肪垫输送，顶板）。成功顺序输注 D1 导管第一和 D2 导管树第二（左下图）。实时透视为 D3 导管树（右下图）的填充（白色箭头）提供图像指导;充满含碘海醇的消融溶液和用于固定的镊子的延长线也可见。比例尺对应于不同放大倍率图像中的 1 厘米。 请点击此处查看此图的大图。

图4：新西兰白兔在使用乙醇基消融溶液进行导管内手术后的乳腺组织分析。 （A-B）与另一只接受10%EtOH消融处理的动物的右腹股沟乳腺相比，未消融治疗的4个月大动物的右腹股沟乳腺的代表性H&E染色。组织切片沿正中平面切割，因此 D1 和 D3（左导管树）表示在同一组织切片上。全组织视图（A）和高放大倍率视图（B）显示了EtOH消融对H&E染色的形态学和色度影响（上图），并根据计算机辅助训练的分类器推断出上皮细胞和基质细胞类别（下图）。黑色比例尺对应于 A 中的 1 mm，白色比例尺对应于 B 中的 100 μm。（C）图条显示用不同浓度的EtOH处理或未处理的导管树（每组n>4个）中的细胞类别分布。星号表示每组每个细胞类别的未配对韦尔奇 t 检验的 p 值与 10% EtOH 处理组中的匹配细胞类别的比较（* <0.05， ** < 0.01， **** <0.0001）。 请点击此处查看此图的大图。

作者没有什么可透露的。