本方案介绍了一种用于活体小鼠体内显微成像的前沿可重复使用肝脏成像工具（RHIT），该工具可增强组织稳定性，适用于快速和急性实验。RHIT采用3D打印设计，生产成本低，具有可扩展性和多功能性，能够实现对不同体型小鼠代谢过程的长期观察。
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摘要
摘要
利用基于共聚焦的活体显微镜（IVM）直接观察肝脏的动态过程，可评估肝脏功能与功能障碍。特别是，该方法在获取定性和定量信息方面具有优异的空间和时间精度。在显微镜载物台上，如何在实现稳定性和可重复性的同时维持组织的生理状态，仍是技术上的挑战。在2型糖尿病（T2D）和非酒精性脂肪性肝病（MAFLD）的动物模型中，体重增加和肝脏脂质含量升高会对该过程产生不利影响。为克服这些限制，我们开发了RHIT——一种革命性的成像仪器设计，可改善组织通达性和稳定性。RHIT是一种可重复使用、可扩展的肝脏成像装置，通过高效的一步式3D打印技术制造而成，其尺寸可根据不同体型的小鼠进行调整。简而言之，RHIT是一种3D打印装置，用于在活体肝脏显微成像过程中对实验动物进行定位和稳定，仅需短暂的手术准备即可最大限度减少操作、应激和实验变异性。其可重复使用且标准化的设计便于生产与定制，支持多种尺寸和潜在的实验设计。初步结果表明，RHIT显著提高了肝脏活体成像的稳定性和可靠性，实现了对脂滴等亚细胞结构的精细可视化。这种更高的精度有助于开展更清晰、可重复性更强的代谢与生理学研究，并为纵向实验设计提供了可能。本方案提供了一种标准化且易于实施的方法，解决了肝脏IVM领域长期存在的技术难题。
引言
活体显微镜是一种强大的工具，可动态地在活体（in vivo）条件下可视化生物学过程1,2,3，这与传统的固定组织免疫荧光组织学、分离细胞的活细胞成像及流式细胞术分析形成对比。在肝脏研究中，活体显微镜已被用于检测胆汁分泌与流动4,5、葡萄糖动员6,7、非实质细胞8,9,10以及肝脏疾病11,12。此外，在脂质蓄积研究方面，活体显微镜可提供关于活体组织中脂滴形成、生长和降解动态的实时信息，例如以高空间分辨率对脂滴进行可视化和定量，并直接关联脂滴蓄积与其他细胞和生理过程13。尽管具有上述优势，活体显微镜在技术上仍具挑战性：它需要专用设备和技术专长
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方案
所有动物实验均在美国国立卫生研究院的动物实验设施中进行，遵循伦理委员会动物实验批准的指南和方案（方案编号：LCMB-037）。所有人员在实施以下实验方案前，必须接受适当的培训。动物操作均遵守机构相关指南。
RHIT 实验方案概述了可重复使用肝脏成像工具（RHIT）在活体显微镜（IVM）实验中的制备与使用流程。实验操作需在无菌的显微镜室或超净台中进行，包括一系列步骤：首先打印 RHIT，对小鼠实施麻醉并进行荧光标记，随后设置显微镜，接着进行外科手术，最后实施 RHIT 辅助的 IVM 成像。图 1 和 图 2 展示了使用共聚焦显微镜对活体样本成像所需的组件，包括用于放置 RHIT 的金属插件5,6,7（活体样本成像用显微镜适配器），以及适用于高级或可控性脂肪变性研究的 RHIT。为测试该系统，选用 6 至 10 周龄的雄性 C57BL/6J Mus musculus，在实验前喂养标准饮食或西方饮食 8 至 10 周。
1. 设计经修饰的 RHIT
- 要重现 RHIT，请使用 3D ....
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结果
RHIT 使用计算机辅助设计（CAD）软件设计（图1）。RHIT 的尺寸经过缩放，以适配小型、中型和大型小鼠（表1）。RHIT 的结构由一段长为 107.50 mm 的 ABS 平板材料构成，其上设有用于肝脏成像的开口。在最优条件（使用 RHIT）和次优条件（无插入物或使用纸板）下进行了体内显微成像（IVM）（见 图3A-C）。这展示了可能结果的范围以及使用 RHIT 时所实现的稳定程度。RHIT 在约 50–70 只不同体型的小鼠中进行了测试，这些小鼠按体型分为小型、中型和大型，涵盖广泛的生理状态。RHIT 的尺寸相应地进行了调整以适配不同体型的小鼠（表1），从而能够在多种实验场景下对 RHIT 的性能进行严格验证。图3 所示数据为这些实验的一部分，且与整体数据集一致。在所有测试动物中图像质量的一致性提升，证明了 RHIT 的稳健性和可重复性。为了定量评估这.......
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讨论
肝脏活体显微成像已被广泛研究，然而，以往的方法通常需要高度侵入性且缺乏标准化的外科手术，以实现稳定的终末期成像5,6,7,9,31,32。运动是阻碍肝脏活体显微成像可重复性的最主要难题。避免呼吸伪影最有效的解决方案是进行气管插管并实施受控通气，同时实现明确的呼吸暂停57。以往的研究成功使用硬纸板垫片，在小鼠身体与显微镜载物台之间创造空间4,5,6,7
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）、国家癌症研究所和NIH图书馆的院内研究计划资助。H. Sanchez Cornejo 感谢秘鲁科学技术委员会（CONCYTEC）通过资助编号 PE501087367-2024-PROCIENCIA 提供的经费支持。我们感谢 Porat-Shliom 实验室成员以及剑桥大学量子物理小组的合作者在稿件审阅方面给予的宝贵意见，同时感谢 NIH 图书馆工作人员以及 Geneti Gaga 在技术方面提供的协助。图2A 中的三维渲染图像使用 Biorender 软件生成。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ½-英寸遮蔽胶带 | 3M 通用遮蔽胶带： | b40069428 | |
| 40 毫米盖玻片 | Bioptech | 40-1313-03191 | |
| 70% (v/v) 乙醇 | 赛默飞世尔科技 | BP2818-4 | 体积分数为 70% 的乙醇和体积分数为 30% 的水 |
| 麻醉机：AMD-3 Plus | Somni | AMD-17106 | |
| Aquasonic 100 超声耦合凝胶 | Parker Laboratories | 01 08 | |
| BODIPY 665/67 | 赛默飞世尔科技 (Invitrogen) | B3932 | 见表 2 |
| CAD 软件（Autodesk Inventor 或同等软件） | Autodesk（代表性的 CAD 软件） | n/a | 软件 |
| 电凝系统 | Gemini | GEM 5917 | |
| Clidox 消毒剂 | Pharmacal Research Laboratories Inc. | VWR, MSPP-96118F | |
| 共聚焦显微镜（Leica SP8 或同等设备） | Leica | SP8 | |
| 棉签 | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
| 定制铝制载物台插件（3 mm 厚，35 mm 凹槽） | N/A | N/A | |
| FORANE（异氟烷，USP）吸入用液体，250 mL | Baxter | 10019-360-60 | |
| 毛发剪（可选） | Onyx Fine Instruments | ASWRHC | |
| 带直肠探针的加热垫 | ALA Scientific Instruments | HEATINGPAD-1/2 | |
| 肝素钠，1000 USP U/mL | Hikma | 0641-0391-12 | |
| Hoechst 33342 | 赛默飞世尔科技 (Invitrogen) | 62249 | 见表 2 |
| 小鼠加热垫 | ALA Scientific Instruments | HEATINGPAD-1/2 | |
| Mus musculus | 杰克逊实验室 | C57BL/6 | 实验小鼠 |
| 生理盐水（0.9% 氯化钠） | 赛默飞世尔科技 | 7210-16 | |
| RHIT（可重复使用肝脏成像工具），适用尺寸 | 提供 | N/A | 见表 1 |
| 手术镊，弯头 | Fine Science Tools | 11251-23 | |
| 手术纱布 | Mckesson | 6939 | |
| 手术剪刀 | Fine Science Tools | 14001-14 | |
| 四甲基罗丹明葡聚糖 | 赛默飞世尔科技 (Invitrogen) | D7139 | 见表 2 |
| 超细 U-100 胰岛素注射器，31 G | Betty Mills | BD326730 |
参考文献
- Scheele, C. L. G. J., et al. Multiphoton intravital microscopy of rodents. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 89(2022).
- Hor, J. L., Germain, R. N. Intravital and high-content multiplex imaging of the immune system. Trends Cell Biol. 32 (5), 406-420 (2022).....
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重印与许可
