可重复使用的肝脏成像工具：一种用于肝脏活体显微成像的可重复使用3D打印工具

摘要

本方案介绍了一种用于活体小鼠体内显微成像的前沿可重复使用肝脏成像工具（RHIT），该工具可增强组织稳定性，适用于快速和急性实验。RHIT采用3D打印设计，生产成本低，具有可扩展性和多功能性，能够实现对不同体型小鼠代谢过程的长期观察。

摘要

利用基于共聚焦的活体显微镜（IVM）直接观察肝脏的动态过程，可评估肝脏功能与功能障碍。特别是，该方法在获取定性和定量信息方面具有优异的空间和时间精度。在显微镜载物台上，如何在实现稳定性和可重复性的同时维持组织的生理状态，仍是技术上的挑战。在2型糖尿病（T2D）和非酒精性脂肪性肝病（MAFLD）的动物模型中，体重增加和肝脏脂质含量升高会对该过程产生不利影响。为克服这些限制，我们开发了RHIT——一种革命性的成像仪器设计，可改善组织通达性和稳定性。RHIT是一种可重复使用、可扩展的肝脏成像装置，通过高效的一步式3D打印技术制造而成，其尺寸可根据不同体型的小鼠进行调整。简而言之，RHIT是一种3D打印装置，用于在活体肝脏显微成像过程中对实验动物进行定位和稳定，仅需短暂的手术准备即可最大限度减少操作、应激和实验变异性。其可重复使用且标准化的设计便于生产与定制，支持多种尺寸和潜在的实验设计。初步结果表明，RHIT显著提高了肝脏活体成像的稳定性和可靠性，实现了对脂滴等亚细胞结构的精细可视化。这种更高的精度有助于开展更清晰、可重复性更强的代谢与生理学研究，并为纵向实验设计提供了可能。本方案提供了一种标准化且易于实施的方法，解决了肝脏IVM领域长期存在的技术难题。

引言

活体显微镜是一种强大的工具，可动态地在活体（in vivo）条件下可视化生物学过程^1,2,3，这与传统的固定组织免疫荧光组织学、分离细胞的活细胞成像及流式细胞术分析形成对比。在肝脏研究中，活体显微镜已被用于检测胆汁分泌与流动^4,5、葡萄糖动员^6,7、非实质细胞^8,9,10以及肝脏疾病^11,12。此外，在脂质蓄积研究方面，活体显微镜可提供关于活体组织中脂滴形成、生长和降解动态的实时信息，例如以高空间分辨率对脂滴进行可视化和定量，并直接关联脂滴蓄积与其他细胞和生理过程¹³。尽管具有上述优势，活体显微镜在技术上仍具挑战性：它需要专用设备和技术专长¹⁴，可能造成组织损伤、改变细胞行为，并需侵入性操作。依赖行为观察、生理监测和遗传分析的传统活体（in vivo）研究虽能提供有价值的信息，但缺乏活体显微镜所具备的空间和时间分辨率。

IVM面临的第一个主要挑战是控制因被检动物心跳和呼吸引起的人工伪影的不稳定性，这会降低图像质量，导致所观察的生物过程图像模糊或失真¹⁵。尝试通过图像处理来校正这一问题，往往会导致丢失重要的空间和时间信息，或需要先进的外科设备和维护条件^16,17。其次，用于肝病研究的小鼠模型（如MAFLD和T2D）通常为肥胖型，因其体型增大及组织脂质含量升高而更难稳定^16,18。在肥胖型NAFLD和T2D小鼠模型中，增加的体重会因超出标准显微镜载物台的承载能力并对动物固定造成困难，从而给活体成像带来机械性挑战¹⁹。这种额外重量会增加运动伪影和组织受压的风险，二者均会损害成像精度²⁰。

同时，肝脏脂质含量升高会增加组织不透明度和光散射，从而降低图像的分辨率和对比度。这些影响常因代谢性合并症（如灌注改变和炎症）而加剧，进一步减少染料分布和信号清晰度²¹。此外，在成像过程中维持稳定的体温以保持组织生理状态和生物活性，操作上可能较为困难，并影响实验的可重复性。同时，在体内显微成像（IVM）过程中，肝脏在显微镜载物台上的稳定固定至关重要，以避免机械应力或组织损伤⁷。暴露肝脏组织是一项精细的操作，需要较高的技术精度，以防止严重出血和肝实质损伤⁷。为了减少运动伪影，以往通过硬纸板将小鼠肋骨抬离显微镜载物台，利用重力使肝脏远离身体其他部分²²。尽管该方法已被证明可成功获取可量化的数据，但硬纸板材料不可持续，因其易变形且难以清洁。此外，难以调节硬纸板垫片的尺寸以适应肥胖小鼠模型。

近年来，多种先进的肝脏活体显微技术相继出现，包括扫描光场显微镜和计算增强型光学系统，这些技术在时空分辨率²³、光毒性降低²⁴、成像深度增加^25,26以及运动伪影抑制²⁷等方面展现出显著提升。正如近期多项研究^28,29,30所证实的，这些进展代表了该领域重要的技术进步。本文介绍了可重复使用的肝脏成像工具（Reusable Hepatic Imaging Tool, RHIT），这是一种用于小鼠肝脏活体显微成像（IVM）的创新性工具。RHIT通过提供一种可扩展且可重复使用的装置，增强了多种动物模型（包括代谢性疾病模型）中的机械稳定性与组织可及性，从而推动了该技术领域的发展。其设计通过整合解剖适配性、可重复的定位以及操作便捷性，解决了长期存在的运动干扰、实验变异性及装置复杂性等挑战。RHIT与传统及先进成像模式均具有良好兼容性，有助于拓展这些新兴技术的应用，促进实现可靠且生理状态稳定的肝脏活体成像。

尽管已有多种用于在活体显微成像（IVM）过程中稳定组织的方法被提出，例如手术窗口^{9,31,32,33,34,35,36} 和定制组装的丙烯酸载物台^6,37，但这些方法在可扩展性、可重复性以及对外科操作技能的要求方面仍存在诸多局限性和复杂性。相比之下，RHIT 在设计目的和功能上具有本质区别。它不依赖于直接压迫或基于凝胶的包埋³⁸。相反，RHIT 是一种可扩展、可重复使用、符合解剖形态的工具，通过重力定位实现肝脏的分离，能够在不压迫或扭曲组织的前提下维持其生理方向。关键的是，RHIT 能够显著提高在不同体型小鼠中获得数据的可重复性、成像保真度以及操作的一致性。该工具无需使用凝胶、粘合剂或复杂的手术接口，同时简化了组织对准和温度控制过程。此外，RHIT 是一种专门设计的工具，可有效连接动物与显微镜之间的界面，旨在同时提升生理支持能力和成像精度。

RHIT 通过其可扩展的几何结构，直接解决了代谢功能受损模型在机械和光学方面的挑战，该结构可适应更大的动物体型，同时均匀分布重量，以最大程度减少平台不稳定性。凹陷的肝脏开孔利用重力稳定组织，无需施加压迫力，从而实现稳定的访问，并在成像过程中减少组织移动。其可重复使用且化学性质惰的设计确保了与生物组织的相容性，同时支持卫生条件下的重复使用。通过实现稳定的定位、最小化运动伪影并维持组织完整性，RHIT 为活体显微成像工作流程提供了基础性进步。其良好的适应性以及开源获取的便利性，进一步促进了该装置在不同实验室和动物模型中的广泛应用，为同时支持样本和成像系统的成像工具树立了新标准。

此外，市面上可购买的加热显微镜载物台可能需要复杂的显微镜配置和操作³⁹。这类设备无法根据样本尺寸灵活调整，且通常价格较高，导致许多研究人员难以获得。因此，一种可重复使用且可扩展的插入装置对于在不同动物模型中标准化活体显微成像（IVM）至关重要。3D打印技术，也称为增材制造，近年来在科研实验室中日益普及⁴⁰，正在改变生物化学、物理学和生物学实验的操作流程。在活体显微成像中，3D打印技术已被用于制造轻质成像光学窗口^41,42，改善组织可及性⁴³，以及促进组织修复与重建⁴⁴。因此，开发一种用于组织稳定的定制化工具——据我们所知，此前尚未见报道——为利用3D打印技术克服肝脏活体显微成像中的一些挑战提供了良好契机。

RHIT 采用一步式 3D 打印方法制备，显著延长了组织稳定的持续时间。RHIT 具有高度可及性，适用于对手术操作要求较低的急性 IVM 实验。此外，RHIT 可根据动物体型轻松缩放，且生产成本低廉。最后，我们证明 RHIT 能够实现稳定的荧光延时成像，并相较于先前使用的纸板插件显著提高了组织稳定性。RHIT 在不直接接触或对生理状态产生可测影响的前提下，简化了肝脏脂质稳态的 IVM 研究。因此，RHIT 作为一种快速、可重复使用且适应性强的工具，在 IVM 领域具有显著优势^34,36,45。

图1：RHIT设计。（A）适用于肥胖小鼠的3.0 mm RHIT的设计与尺寸。正面视图（左）显示了组织开窗的尺寸、位置和大小，以及成像过程中小鼠的体位。侧面视图（右）包含尺寸信息，并标明了加热垫和温度探针插入口的位置。不同体型小鼠的缩放参数见表1。（B）根据开源STL文件生成的RHIT三维正面视图，显示直肠探针导线通过定制端口插入的位置（右上角标注了直肠探针插入口的尺寸）。（C）RHIT的技术组装图，展示加热装置与适用于不同尺寸RHIT的定制结构插件的集成情况，导线已安装至直肠探针插入口，以便接入温度探针。缩写：RHIT = 可重复使用肝脏成像工具。请点击此处查看该图的放大版本。

RHIT最初设计为使用ABS（丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物）制造的单部件组装结构，ABS是一种在熔融沉积成型3D打印中广泛使用的热塑性聚合物⁴⁵。ABS在该应用中具有多项优势：质量轻、耐热性好（熔点约200 °C），且具有良好的抗冲击性能^46,47,48。RHIT的设计利用了ABS可调节密度的特性，使其能够吸收心跳和呼吸等生理运动。提高填充密度可增强运动阻尼效果，从而提升成像稳定性并改善图像质量。

RHIT 旨在通过调节化学惰性材料（如 ABS）的密度来吸收运动。在此背景下，密度特指 3D 打印过程中所使用的内部填充百分比，该参数会影响平台的刚性及其抑制振动的能力^49,50,51。已观察到，增加 ABS 的密度可减少由心跳和呼吸引起的运动传递，从而为成像提供稳定的平台，并提高图像质量。我们测试了具有不同内部填充密度（20–100%）的 RHIT 结构，定性观察发现，在小鼠肝脏活体成像过程中，较高密度的结构明显减少了运动伪影。由于高密度配置在所有测试的 RHIT 尺寸中均表现出足够的坚固性和有效性，并且在常规成像条件下始终提供可靠性能，因此未进行正式的量化分析。对于大多数用户而言，此默认密度无需进一步调整即可适用。然而，对于需要特定机械特性的实验，可对填充密度和设计参数进行修改，且已提供完整的 3D 打印说明以支持此类定制。

可用于打印的替代材料有多种；然而，ABS 是 RHIT 制备的首选材料，因其具备多项关键优势。它具有化学惰性，可最大限度降低与组织或体液发生相互作用的风险，并且不溶于水，便于高效清洁、储存和重复使用。这些特性使 ABS 成为实验应用中可靠且耐用的选择。当无法便捷获取熔融沉积成型打印机时，也可采用其他 3D 打印技术与材料。光固化立体成型、选择性激光烧结和多射流熔融均为可行方案，适用材料包括尼龙、光敏聚合物树脂或复合粉末。尼龙具有良好的耐用性和柔韧性，而光固化树脂则可提供高分辨率，适用于需要精细结构细节的应用场景。RHIT 的设计可轻松适配不同材料的公差与限制，因而兼容多种打印平台。用户应根据机械稳定性、生物相容性、与成像工作流程的兼容性以及可用的打印资源来选择合适的材料。

方案

所有动物实验均在美国国立卫生研究院的动物实验设施中进行，遵循伦理委员会动物实验批准的指南和方案（方案编号：LCMB-037）。所有人员在实施以下实验方案前，必须接受适当的培训。动物操作均遵守机构相关指南。

RHIT 实验方案概述了可重复使用肝脏成像工具（RHIT）在活体显微镜（IVM）实验中的制备与使用流程。实验操作需在无菌的显微镜室或超净台中进行，包括一系列步骤：首先打印 RHIT，对小鼠实施麻醉并进行荧光标记，随后设置显微镜，接着进行外科手术，最后实施 RHIT 辅助的 IVM 成像。图 1 和 图 2 展示了使用共聚焦显微镜对活体样本成像所需的组件，包括用于放置 RHIT 的金属插件^5,6,7（活体样本成像用显微镜适配器），以及适用于高级或可控性脂肪变性研究的 RHIT。为测试该系统，选用 6 至 10 周龄的雄性 C57BL/6J Mus musculus，在实验前喂养标准饮食或西方饮食 8 至 10 周。

1. 设计经修饰的 RHIT

1. 要重现 RHIT，请使用 3D 产品设计软件（参见 材料表）。打开设计软件并创建一个新的标准零件。使用适当的描述保存文件。
2. 在前平面上创建 RHIT 的草图 创建二维草图 特征
   1. 点击 矩形 图标并将其左下角置于草图平面的原点。
   2. 在第一个矩形内部绘制第二个矩形，以表示RHIT的成像窗口。
   3. 使用以下方法为两个矩形添加尺寸 维度 特征，确保所有长度和宽度均相对于原点且彼此相对。
   4. 根据小鼠体型调整RHIT的尺寸。
   5. 仅选择外侧矩形并点击，以增加RHIT的厚度 挤出当弹出窗口出现时，选择草图使用 挤出 使用工具在中心留出一个开口。
   6. 选择拉伸后的RHIT底面，并使用该面开始一个新的二维草图 开始二维草图 特征。
3. 绘制一个矩形以确定暖手袋的口袋位置。使用所获取的尺寸进行应用 维度 特征。
   1. 退出二维草图，使用材料去除操作 拉伸切除 用于为加热垫创建深腔的工具。
4. 在与腔体相同的面上为温度探针创建一个新草图。单击 开始一个二维草图 并选择 圆形 将圆放置在平面上，并相应地标注其尺寸。退出 草图 模式。
   1. 点击 挤出 并选择圆的草图。在 e挤出 模式下，单击剪切 挤出，等待弹出窗口出现，其中包含一个“全部通过”选项，用于移除材料。单击该选项 好的退出 挤出 模式。
   2. 单击圆角图标，选择窗口的所有八个锐边，在边缘上添加圆角。设置圆角尺寸后退出 去皮去骨 模式。
      注意：如果需要更高的减震效果，用户可在3D打印准备过程中提高内部填充密度。
5. 通过导航至 环境 标签并选择 3D 打印 表。
   1. 使用 设置方向 确保模型平放在打印平台上，而非垂直放置。
   2. 点击 打印选项 配置单位设置，并在需要时调整比例尺。
   3. 使用以下方法将最终完成的模型以 STL 格式保存 STL 输出功能。
   4. 退出 环境 标签，然后单击 保存以将 RHIT 保存为实体零件.
6. 关闭设计程序。
   注意：确保打印机兼容 .STL 文件格式，或根据 3D 打印机软件的要求转换为相应的格式。

2. 从 STL 文件上传和打印 RHIT

1. 通过点击图1A或补充文件1中的.stl文件，将其导入3D计算机辅助设计（CAD）软件中，然后点击导入并选择该.stl文件。点击准备按钮，将模型切分为薄层以进行3D打印。
2. 选择合适的商用3D打印机，点击打印。随后监控打印进度，打印完成后，根据需要取出并清洁3D打印物体。

小鼠体型	小鼠体重（g）	RHIT厚度（mm）	成像窗口尺寸 长×宽（mm）
小型（S）	17–20	1.5	17 × 17
中型（M）	22–25	2.5	21 × 21
大型（L）	35–40	3	26 × 26

表1：小鼠体型与RHIT的对应关系。 小鼠体重与RHIT厚度成比例，体重超过30 g（箭头）对应最大尺寸的RHIT（3.0 mm）。最轻的小鼠对应最薄的RHIT，肥胖小鼠则由最厚的RHIT表示。这些尺寸可在计算机辅助设计（CAD）软件中进行调整。RHIT的长度和成像孔径可根据样本所用器官的位置而变化；本研究中，三种RHIT均采用相同的长度和成像孔径。缩写：RHIT = 可重复使用肝脏成像工具；CAD = 计算机辅助设计。

3. 显微镜准备及RHIT的使用

图 2：使用 RHIT 技术对肝脏进行活体显微成像（IVM）。（A）倒置共聚焦显微镜装置示意图，小鼠处于麻醉状态。（B）使用金属显微镜适配器（插件）将小鼠固定在显微镜载物台上以进行活体成像。（C）使用纱布条配合3D打印的RHIT，便于操作肝实质组织。（D）在放置RHIT前，肝脏尚未外置时的图像。鼻罩用于手术前及手术过程中维持麻醉。（E）急性实验过程中，在放置RHIT前外置肝脏的图像。无需剃毛。（F）小鼠最终俯卧于RHIT上进行成像时的倒置图像。（G）RHIT牢固地固定在显微镜载物台上。（H）小鼠放置于RHIT和金属适配器上的整体装置图。（I）瘦小鼠（蓝色箭头）和肥胖小鼠（绿色箭头）分别配有相应比例的RHIT插件，其对应的宏观解剖图像如图 J–L 所示。高分辨率的活体显微成像图像 M、N 分别显示了肥胖和瘦小鼠的肝脏，其中使用BODIPY（绿色，粉红色箭头所示）标记脂滴，Hoechst 33342（白色，青色箭头所示）标记细胞核。缩写：RHIT = 可重复使用肝脏成像工具（Reusable Hepatic Imaging Tool）；IVM = 活体显微成像（intravital microscopy）。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 按照图2所示，准备一台常规的倒置共聚焦显微镜用于肝脏活体成像（IVM）。
   1. 插入适配载物台的支架以固定样品。按照本方案，使用定制的金属支架，其具有直径35 mm的圆形开口和一块40 mm的盖玻片。
   2. 每次成像前后，根据需要使用70%乙醇彻底清洁盖玻片的两面。
2. 根据小鼠体型选择合适的RHIT（见表1），用胶带（可选）将其固定，使RHIT的开口与物镜对齐，并平行覆盖在金属支架上的成像盖玻片上，胶带覆盖于盖玻片之上（图2G）。
3. 根据成像区域大小、空间分辨率和成像时间选择合适的物镜，例如25倍/0.95数值孔径的水镜。
   注意：虽然更高倍率可提高分辨率，但也会增加运动伪影的发生概率。
   1. 将物镜调至接近盖玻片的位置。
4. 用胶带将一条纱布（约1 cm × 8 cm，图2C、D）固定在RHIT窗口上，以帮助定位组织并将其与其他腹腔器官分离（图2C）。
5. 将加热垫插入RHIT的插槽中，预热RHIT，并将温度探头固定在RHIT附近（图2G、H），以在成像过程中维持小鼠体温。

4. 荧光标记与小鼠麻醉

1. 通过清洁麻醉诱导舱，去除任何残留的动物气味，以减少小鼠的应激反应。
2. 打开氧气冷凝器、环境控制系统（EPS）和异氟烷蒸发器。
3. 将小鼠放入诱导舱中，使用2-3%异氟烷麻醉约3-5分钟，或直至动物出现稳定的呼吸，并丧失翻正反射和足底反射。
   1. 麻醉成功后，将小鼠转移至加热垫上，并通过鼻罩以1-2%异氟烷维持麻醉（图2D），根据需要调整浓度，确保整个手术过程中维持稳定的外科麻醉深度。
   2. 通过脚趾夹捏试验评估麻醉深度，观察是否存在自主运动。
4. 为标记富含脂质的结构，使用31 G胰岛素注射器经尾静脉注射200 nmol BODIPY 665/676（溶于PBS中，总体积200 µL）。
   1. 为获得最佳信号，建议在成像前连续两天每天注射一次BODIPY。第二次注射后至少等待3-4小时，以确保背景物质的全身清除及组织信号的稳定。
5. 为提供细胞核对比，使用31 G胰岛素注射器经眶后窦注射Hoechst 33342（2 µg/g体重），该染料已稀释于1×肝素溶液中（通过将120 µL肝素与180 µL生理盐水混合，配制成400 U/mL）。
   注意：Hoechst需单独注射，以避免与其他染料混合时发生沉淀。
6. 为可视化血管系统，使用31 G胰岛素注射器经对侧眶后窦注射荧光标记葡聚糖（70 kDa，18 µg/g体重），该染料已稀释于步骤4.5中所述的相同1×肝素溶液中（表2）。
   ​注意：加入肝素可减少血凝块形成，促进成像期间血流稳定。
7. 在注射Hoechst和葡聚糖后，等待10-15分钟，再开始手术和成像。

荧光报告分子	用途	每单位体重剂量（或浓度）
Hoechst 33342	标记细胞核	2 µg/g：用肝素溶液将注射液体积补足至 50 µl
Bodiby 665/676	标记脂滴	0.8 µg/g：用生理盐水将注射液体积补足至 200 µl
2M 四甲基罗丹明-葡聚糖（Dextran）	标记血管系统	18 µg/g：用肝素溶液将注射液体积补足至 50 µl

表2：荧光报告基因选项本表详细描述了用于标记小鼠组织的方法 在体o 成像。首先配制肝素溶液，然后用其配制 DAPI-肝素和葡聚糖-肝素溶液⁷Hoechst 33342 通过眶后注射入一只眼睛，而 BODIPY 则在2-3天前直接注入尾静脉，肥胖小鼠需使用较高浓度。右旋糖酐（Dextran）通过眶后注射入另一只眼睛。必须分别对每只眼睛单独进行眶后注射。缩写：DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚。

5. 小鼠手术操作

1. 使用毛发修剪器和/或脱毛膏剃除腹部毛发。清除残留毛发，并用70%乙醇清洁暴露的皮肤。
   注意：根据各机构IACUC的要求，可交替使用聚维酮碘和乙醇进行擦拭，以确保手术部位得到适当准备。
2. 手术前重新评估麻醉深度。
3. 从剑突开始，用手术剪在肋缘下方做一条2-3 cm的横向月牙形切口，直至上腹部左侧，以暴露肝脏。
4. 完成初始切口后，小心地在肌肉层做较小的二次切口，以暴露肝脏左叶，并根据需要进行电灼止血（可选）（图2E）。
   1. 使用电灼器时，为防止对肝脏造成热损伤，可在肝脏与肌肉层之间放置浸有生理盐水的纱布，以吸收来自肌肉层的热量。
   2. 避免任何过度出血、手术或机械性创伤，以及外部压迫。
5. 肝脏暴露后，将小鼠转移至显微镜载物台上。

6. 将小鼠放置在显微镜载物台上

1. 将麻醉后的小鼠腹部朝下放置在显微镜RHIT平台上方。
   1. 调整鼻罩，使小鼠保持麻醉状态。
   2. 使用生理盐水浸湿的棉签轻轻将肝脏左外叶推至盖玻片下方，同时对胸腔施加轻柔的外部压力。
      注意：利用重力作用，小心地将肝脏移出并置于盖玻片上。
   3. 使用纱布条轻轻将肝脏与小鼠体内组织分离（ 图 2E- H).
2. 再次检查鼻罩，以确保小鼠在成像过程中仍处于麻醉状态。
3. 通过在暴露腔隙边缘涂抹水性凝胶并避免与加热垫直接接触，防止组织脱水。
   注意：配备封闭式加湿培养室的显微镜也有助于维持温度和湿度^5,6,7.
4. 涂抹眼药膏以防止角膜干燥。
5. 设置延时成像以开始显微观察^7,52.
   1. 打开激光快门，评估荧光标记情况，并识别具有明显血流的稳定感兴趣区域。选择合适的图像采集参数，包括图像格式、采集速度、成像间隔、总采集时长以及线/帧平均（512 × 512 像素；每区域 1–5 帧 s⁻¹；成像间隔 5–30 s；总采集时间 5–20 min；线/帧平均 2–8，根据实验需求而定）。优化荧光激发曝光以适配所用荧光染料。
   2. 定义上下边界 Z轴图像序列 通过选择Z-Stack中的 采集 面板，使用Z轴位置控制调节顶部和底部焦平面，并通过以下方式确认范围： 首项/末项 然后通过点击启动延时录像 开始实验 或 开始采集成像结束后，按照机构动物护理和使用委员会批准的方案对动物实施安乐死。

图3：利用SSIM评估RHIT对肝脏活体显微成像稳定性的提升效果。 在三种不同稳定条件下对左下肝叶进行肝脏活体显微成像：（A）无插入装置（无），（B）纸板插入装置，以及（C）RHIT。组织经BODIPY（品红色，脂质）、Hoechst 33342（绿色，细胞核）和Dextran（青色，血管系统）标记；图A和B显示明显的形变和运动伪影，而图C使用RHIT后成像清晰度显著提高。（D）采用结构相似性指数（SSIM）量化图像稳定性。柱状图表示均值±标准误（SEM），每个彩色圆点代表一个独立的生物学重复：RHIT组（n = 14），纸板组（n = 10），无插入组（n = 8）。这些分组来源于总体约50–70只小鼠的实验队列。仅符合特定成像标准（如帧间对齐一致、图像质量良好）的成像会话被纳入SSIM分析。RHIT组持续产生更高的SSIM值（均值0.511 ± SEM），表明在各种成像条件下均具有更优的稳定性和分辨率。比例尺 = 15 µm。图中展示的是代表性图像；SSIM反映的是连续活体显微成像过程，未观察到组织损伤或结构破坏。缩写：RHIT = 可重复使用肝脏成像工具；IVM = 活体显微成像；SSIM = 结构相似性指数；CARD = 纸板插入装置。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

RHIT 使用计算机辅助设计（CAD）软件设计（图1）。RHIT 的尺寸经过缩放，以适配小型、中型和大型小鼠（表1）。RHIT 的结构由一段长为 107.50 mm 的 ABS 平板材料构成，其上设有用于肝脏成像的开口。在最优条件（使用 RHIT）和次优条件（无插入物或使用纸板）下进行了体内显微成像（IVM）（见 图3A-C）。这展示了可能结果的范围以及使用 RHIT 时所实现的稳定程度。RHIT 在约 50–70 只不同体型的小鼠中进行了测试，这些小鼠按体型分为小型、中型和大型，涵盖广泛的生理状态。RHIT 的尺寸相应地进行了调整以适配不同体型的小鼠（表1），从而能够在多种实验场景下对 RHIT 的性能进行严格验证。图3 所示数据为这些实验的一部分，且与整体数据集一致。在所有测试动物中图像质量的一致性提升，证明了 RHIT 的稳健性和可重复性。为了定量评估这...

讨论

肝脏活体显微成像已被广泛研究，然而，以往的方法通常需要高度侵入性且缺乏标准化的外科手术，以实现稳定的终末期成像^{5,6,7,9,31,32}。运动是阻碍肝脏活体显微成像可重复性的最主要难题。避免呼吸伪影最有效的解决方案是进行气管插管并实施受控通气，同时实现明确的呼吸暂停⁵⁷。以往的研究成功使用硬纸板垫片，在小鼠身体与显微镜载物台之间创造空间^4,5,6,7

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
½-英寸遮蔽胶带	3M 通用遮蔽胶带：	b40069428
40 毫米盖玻片	Bioptech	40-1313-03191
70% (v/v) 乙醇	赛默飞世尔科技	BP2818-4	体积分数为 70% 的乙醇和体积分数为 30% 的水
麻醉机：AMD-3 Plus	Somni	AMD-17106
Aquasonic 100 超声耦合凝胶	Parker Laboratories	01 08
BODIPY 665/67	赛默飞世尔科技 (Invitrogen)	B3932	见表 2
CAD 软件（Autodesk Inventor 或同等软件）	Autodesk（代表性的 CAD 软件）	n/a	软件
电凝系统	Gemini	GEM 5917
Clidox 消毒剂	Pharmacal Research Laboratories Inc.	VWR, MSPP-96118F
共聚焦显微镜（Leica SP8 或同等设备）	Leica	SP8
棉签	Puritan Medical Products	25-806 1WC
定制铝制载物台插件（3 mm 厚，35 mm 凹槽）	N/A	N/A
FORANE（异氟烷，USP）吸入用液体，250 mL	Baxter	10019-360-60
毛发剪（可选）	Onyx Fine Instruments	ASWRHC
带直肠探针的加热垫	ALA Scientific Instruments	HEATINGPAD-1/2
肝素钠，1000 USP U/mL	Hikma	0641-0391-12
Hoechst 33342	赛默飞世尔科技 (Invitrogen)	62249	见表 2
小鼠加热垫	ALA Scientific Instruments	HEATINGPAD-1/2
Mus musculus	杰克逊实验室	C57BL/6	实验小鼠
生理盐水（0.9% 氯化钠）	赛默飞世尔科技	7210-16
RHIT（可重复使用肝脏成像工具），适用尺寸	提供	N/A	见表 1
手术镊，弯头	Fine Science Tools	11251-23
手术纱布	Mckesson	6939
手术剪刀	Fine Science Tools	14001-14
四甲基罗丹明葡聚糖	赛默飞世尔科技 (Invitrogen)	D7139	见表 2
超细 U-100 胰岛素注射器，31 G	Betty Mills	BD326730