基于荧光团的遗传编码生物传感器用于微生物中的比率荧光成像

摘要

本方案描述了在受控条件下，将基于荧光团的遗传编码生物传感器应用于微生物中，进行定量比率荧光成像的方法。通过将这些生物传感策略与先进成像技术相结合，该方法可在单细胞水平实现高分辨率、实时分析，从而更深入地揭示小分子动态变化规律。

摘要

研究微生物内小分子动态对于全面理解微生物功能至关重要。生物体内及生物体间的小分子动态在微生物生理、共生关系及疾病过程中发挥着关键作用。然而，利用现有大多数技术对这些动态进行监测仍极具挑战性。基于荧光蛋白的基因编码生物传感器是追踪小分子动态的有力工具。 体内 具有推动新发现的巨大潜力。这些生物传感器最常用于荧光成像，通常与灌注装置联用，以实现对环境条件的精确控制。当与先进的成像技术相结合时，该方法可提供高分辨率、时空分辨的数据，有助于揭示微生物单细胞水平的响应机制。尽管前景广阔，此类生物传感器的实际应用在技术上仍具挑战性。理解其中关键步骤对于其更广泛的应用至关重要。本文介绍了一种实验方案，旨在支持将新近构建的生物传感器有效导入微生物中，用于在受控条件下进行定量比率荧光成像。

引言

基于单荧光蛋白强度的生物传感器和双荧光蛋白生物传感器被研究人员广泛应用于多种实验场景¹一些研究采用多重生物传感器分析，在同一细胞内同时追踪多个信号²许多此类生物传感器依赖于配体结合域，配体结合事件会引发构象变化，从而改变荧光特性^3,4基因编码的生物传感器已成为 体内 在多种系统中进行成像⁵，实现对离子和代谢物浓度在时空尺度上的高分辨率监测¹然而，早期的生物传感器在动态范围和信噪比（SNR）方面存在局限性⁶近年来，基于构象敏感型荧光蛋白（csFPs）的单荧光探针强度型生物传感器取得了显著进展，性能大幅提升。然而，蛋白质表达水平的差异仍可能影响其检测结果 体内 使用基于基因编码荧光蛋白的生物传感器进行测量⁶，这些方法常用于在活细胞中可视化信号分子和代谢物^7,8单荧光探针强度型生物传感器无法对生物传感器的表达水平进行归一化，而表达水平可能存在波动 体内然而，通过引入一种参考荧光蛋白，可将单荧光生物传感器转化为双荧光比率型传感器，从而实现更可靠的定量分析⁹由于非辐射过程导致能量损失，荧光发射光谱相对于吸收光谱发生偏移，这一现象称为斯托克斯位移¹⁰大斯托克斯位移荧光蛋白（LSSFPs）已被用作双荧光团比率型生物传感器中的理想参考荧光探针^9,11一种最新进展是开发出可单色激发的Green-Apple（GA）Matryoshka生物传感器，称为GA-MatryoshCaMP6s，该传感器包含一种名为LSSmApple的红色长斯托克斯位移荧光蛋白（LSSFP）。¹²将基于荧光蛋白的基因编码生物传感器与微流控系统等微装置结合，可利用共聚焦显微镜等技术实现定量比率成像，且具有最小侵入性。该整合方法能够实现单细胞在环境胁迫下小分子动态的高速成像与实时监测。例如，cAMP 和葡萄糖生物传感器已在酵母中成功应用。当与突变菌株联用时，这些生物传感器有助于阐明调控糖类吸收的关键调控网络。^13,14尽管取得了显著进展，这些技术在探究涉及小分子动态的关键生物学问题方面尚未充分发挥其潜力 体内¹⁵因此，这些方法在各实验室中的广泛应用仍然有限，且尚缺乏用于广泛推广的标准化操作流程。

与依赖非比率型单荧光探针生物传感器或整体水平测量的传统方法相比，我们基于GA Matryoshka生物传感器的方案能够实现高分辨率的单细胞成像，并进行定量的比率分析。通过引入具有大斯托克斯位移的荧光蛋白作为内部参比，该方法克服了早期设计中生物传感器表达水平不一致这一关键局限性。此外，结合微流控装置可精确控制环境条件，相较于传统的灌流室或静态培养系统具有明显优势¹²。该方法在研究微生物与其宿主之间的动态相互作用方面也具有显著优势，例如植物-病原体互作以及菌根等共生关系，其中细胞水平的空间和时间分辨率对于揭示分子通讯与养分交换机制至关重要。

在此背景下，我们提供了一种用于微生物中比率型生物传感器成像的详细分步实验方案。尽管该方案特别针对酵母的应用进行了优化，但也可调整用于其他微生物（包括细菌），并可拓展至植物相关微生物等非模式生物。例如，可将生物传感器与微流控系统结合，用于酵母中钙信号的定量荧光成像，从而实现对环境胁迫下钙响应的实时监测¹⁴。

本方案旨在指导研究人员有效使用新设计的生物传感器，从而通过基于生物传感器的荧光成像技术推进对微生物系统中生物学过程的探索。内容包括酵母培养条件、最佳激发/发射参数设置以及与常用酵母菌株（如K601 和 W303-1A MAT-a）。显著的局限性包括长时间成像过程中发生的光漂白，以及生物样本中生物传感器表达的相关挑战。由于多种因素均可影响实验结果 体内 生物传感器成像实验的逐步操作方案还旨在帮助研究人员预见并克服潜在挑战，从而促进可重复的实验实施。

方案

1. 比值型生物传感器的理性设计（图1）

注意：根据相关标准选择目标结合蛋白作为感应结构域，这些标准包括：(i) 特异性，(ii) 亲和力，(iii) 结构信息，以及 (iv) 配体结合后发生的构象重排。特异性确保生物传感器仅对目标分子产生选择性响应，避免交叉反应。亲和力需与目标分子在生物学环境中的预期浓度范围相匹配。结构信息来源于实验数据或计算模型（例如 AlphaFold 生成的模型），可揭示感应结构域的三维结构及配体诱导的构象变化。这些信息用于确定荧光团的合适插入位点。随后，根据预期应用设计验证策略，以评估生物传感器的响应能力与动态范围。

1. 构建俄罗斯套娃设计 计算机模拟 通过插入 Green-Apple Matryoshka 装置¹² 将盒式结构插入感知结构域，使得对构象变化敏感的环状重排绿色荧光蛋白（cpGFP）能够响应配体结合所诱导的感知结构域重排。
   1. 使用分子可视化软件（如 Chimera）分析结合结构域的结构。如果三维结构不可用，则使用 AlphaFold 生成可靠的模型。
   2. 将蛋白质结构中的柔性环识别为薄弱位点，并作为双荧光报告基因盒的潜在插入位点，选择这些位点时应避免破坏蛋白质的整体功能或稳定性。
   3. 再次使用 AlphaFold 预测包含插入的双荧光蛋白盒（dual-FP cassette）的嵌合蛋白结构，以确认插入不会引入不利的结构变化。
   4. 将生物传感器构建体克隆至可在酵母细胞中表达的质粒DNA中。具体而言，采用合适的克隆技术，将编码新设计生物传感器的基因插入含有酵母表达所需元件的酵母穿梭载体pAG416中。^12,13,14.
   5. 克隆完成后，将重组质粒转入细菌细胞中以扩增质粒DNA。使用纯化的质粒DNA进行酵母转化。
   6. 通过聚乙二醇（PEG）介导的转化方法将纯化的质粒导入酵母细胞，具体步骤参照已发表文献¹⁶将转化后的酵母细胞接种于缺乏尿嘧啶的培养基上，以筛选含有携带 URA3 筛选标记质粒的阳性克隆。

2. 样品制备

1. 将表达 GA-Matryoshka 生物传感器的酵母转化子划线接种于选择性培养基平板（例如 SC-Ura）上，在 30 °C 下培养 2–3 天，以促进菌落生长。
   注意：所用酵母菌株具有 ura3 营养缺陷型特征，该缺陷可通过质粒上的 URA3 基因互补，从而实现在缺乏尿嘧啶的培养基上进行筛选。编码生物传感器的质粒包含一个可互补该营养缺陷的表达盒（例如， pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6s）。
2. 使用菌株 K601/W303-1A MAT-a（基因型：ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1-1 leu2-3 leu2-112 can1-100）进行转化，获得酵母转化子。采用常用于 Saccharomyces cerevisiae 的表达载体进行转化，例如 pAG416¹²。
3. 转化后，在 SC-Ura 培养基中于 30 °C 培养酵母细胞，培养基每升配制如下：0.77 g CSM-Ura、6.7 g 含硫酸铵的酵母氮源基础培养基（YNB）、20 g 葡萄糖、20 g 琼脂，并添加腺嘌呤至终浓度为 150 µM，持续培养直至出现独立的转化菌落。
4. 按照已建立的实验方案¹⁶，制备感受态酵母细胞，并采用 PEG 3350 介导的转化方法进行转化。
5. 进行微流控细胞捕获实验时，将 25% 甘油保存菌种划线接种于 SC-Ura 平板上，在 30 °C 下培养 2 天，以获得独立的单菌落。挑取单菌落，悬浮于 5 mL 液体 SC-Ura 培养基中，在 30 °C 下振荡培养，直至 OD600 达到 0.5–1.0，此时菌液适用于灌注系统的上样。

3. 灌流系统的准备（图2）

1. 通过向微流控板中加入表达GA-Matryoshka生物传感器的50 µL单倍体酵母细胞，以及用于生长的终末SC-Ura培养基和用于处理的缓冲溶液（例如NaCl或山梨醇），准备用于单倍体酵母细胞的实验。
   1. 从第1-8号孔中移除保存液。吸出各孔中的磷酸盐缓冲液（PBS），并加入400 µL无菌水。
   2. 清洗第1-6号和第8号孔。第一次清洗：吸出第1-8号孔中的无菌水，并加入400 µL无菌水。第二次清洗：再次吸出并加入400 µL无菌水进行清洗。第三次清洗：重复一次，加入400 µL无菌水。
   3. 第1-6号孔的最终填充：吸出孔内水分，加入300 µL终末灌注/生长溶液，例如用于酵母生长的SC-Ura培养基，或含有目标分析物的缓冲溶液用于处理。
   4. 第8号孔加样：加入50 µL酵母细胞悬液（OD600=0.5-1.0）。
2. 将微流控平台的温控歧管密封于板上，并连接至活细胞成像系统。歧管可维持28 °C的稳定热环境，同时通过管路和泵确保良好的密封性及持续灌注。
   1. 将板对准歧管。打开真空。启动微流控平台。
   2. 按下密封按钮，等待绿灯亮起。打开微流控平台软件，创建新实验，并从下拉列表中选择合适的酵母板。
   3. 点击运行液体预灌注程序按钮。点击运行细胞加载程序，将第8号孔中的酵母细胞加载至培养腔室，在选择性培养基SC-Ura持续灌注条件下于28 °C、10 kPa压力下过夜培养，使细胞被捕获并生长。
   4. 在“手动模式”选项卡下，点击运行自定义程序，或使用协议编辑器设置实验参数，如温度30 °C、流速10 kPa、步长时间（例如10分钟）以及用于灌注的通道。
3. 在28 °C、10-17 kPa压力条件下，于培养腔室内通过选择性培养基SC-Ura持续灌注，过夜培养细胞。

4. 比值荧光成像（图3、图4及视频1）

1. 通过快速显微观察评估细胞生长和荧光。
   1. 将微流控板放置在倒置显微镜的载物台上。聚焦观察区域中心以定位细胞。
   2. 使用明场和/或荧光显微镜评估细胞形态、活力及生物传感器表达情况。
2. 利用微流控系统及兼容的微流控板，在精确控制的条件下研究钙稳态动力学^4,12,13,14。
3. 使用配备100倍放大倍数和数值孔径（NA）为1.40的倒置激光扫描共聚焦显微镜进行活细胞成像。采用氩离子激光在488 nm激发GFP和LSSmApple，监测双荧光探针生物传感器。在520 nm收集GFP发射信号，在610 nm收集LSSmApple发射信号（图5），并进行比率荧光成像实验以量化生物传感器的动态响应。通过测量发射光强度比值（GFP/LSSmApple）随时间的变化，监测分析物诱导的变化。

5. 使用开源软件进行图像分析（图6）

1. 从官方仓库获取 CellProfiler 或其他类似软件，并将其安装在本地工作站上。
2. 将延时荧光显微镜图像按顺序整理（例如，img_001.tif、img_002.tif 等），以确保与自动化批量处理兼容。
3. 启动软件，通过选择 新建项目 来初始化一个新的分析流程，并将延时图像序列导入流程工作区。
4. 添加 IdentifyPrimaryObjects 模块，基于荧光信号或形态学标准，在每一帧中识别单个细胞。
5. 添加 TrackObjects 模块，建立各帧之间细胞的时间对应关系，实现随时间推移的单细胞追踪。
6. 添加 MeasureObjectIntensity 模块，量化每个被追踪细胞的荧光强度参数（例如，平均强度、中位强度和总积分强度）。
7. 使用 ExportToSpreadsheet 模块将定量数据汇总并导出为表格格式（例如，CSV），以便进行后续分析。
8. 使用电子表格软件等统计或数据可视化工具分析导出的数据。

结果

为了在微生物系统中成功实现生物传感器的比率成像，必须解决若干技术挑战。

表达系统：首要挑战在于表达系统的选择，包括基于质粒的表达、染色体整合表达、由组成型或诱导型启动子驱动的表达，以及是否带有亚细胞定位标签。这些因素会显著影响生物传感器在细胞内的稳定性、毒性及定位（图1）。必须确保表达水平处于最佳状态，以避免因过表达导致的假象，或因信号不足而无法检测。此外，生物传感器的表达方式必须能够维持宿主细胞的正常生理功能。

培养密度：第二个瓶颈是培养密度。 微生物的生长阶段和细胞浓度直接影响成像质量。培养腔室中细胞过于密集可能导致细胞重叠和信号干扰，从而降低分辨率；相反，密度过低则可能导致信噪比不足。获得能够清晰成像单个、不重叠细胞的最佳密度至关重要，这需要对培养条件进行精细优化，并持续监测细胞生长情况（图2）。

灌流系统：第三个...

讨论

基于遗传编码荧光蛋白的生物传感器能够实时监测活细胞内分析物的浓度¹。这些生物传感器通常通过将构象变化转化为光学信号来发挥作用，信号可通过比率法或强度法进行检测。强度法生物传感器依赖于单一荧光蛋白（FP）的荧光强度变化，因此对生物传感器表达量的变化较为敏感，可能导致测量偏差。该问题可通过使用比率法生物传感器加以缓解，此类传感器可同时检测两种光谱上 distinct 的荧光蛋白的荧光信号。这两种发射光信号的比值可提供更为可靠的读数，且不受生物传感器表达量的影响^9,12。然而，比率法的应用受限于有限的光谱空间，从而限制了多种生物传感器或额外荧光标记物的共表达。

在微生物系统中，基因编码的生物传感器能够以极小的侵入性提供高时空分辨率。尽管现有多种生物传感器可供选择，但其在微生物中的应用仍然有限。使用这些工具时最关键的步骤之一是确保生物传感器的适当表达；表达过高或过低均可能影响实验结果。在本实验方案的开发过程中，我们进行了多项优...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	Sigma-Aldrich Co.	A5306-250G
用于单倍体酵母细胞的 CellASIC ONIX 培养板	Merck KGaA	Y04C-02-5PK
CellASIC ONIX2	Merck KGaA	CAX2-S0000
CSM-Ura	Thermo Fisher Scientific	11387899
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich Co.	G8270-100G
D-山梨醇	Sigma-Aldrich Co.	S1876-10MG
NaCl	Sigma-Aldrich Co.	S9888-25G
pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6s	NA	7	用于在酵母中表达 GA-MatryoshCaMP6s
TCS SP8 STED	Leica	NA
酵母菌株 K601/ W303-1A MAT-a	NA	8	ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1-1 leu2-3 leu2-112 can1-100
YNB	BocaScientific	GCM16.0500
α-交配因子乙酸盐	Sigma-Aldrich Co.	T6901-.5MG