基于荧光团的遗传编码生物传感器用于微生物中的比率荧光成像

摘要

本方案描述了在受控条件下，将基于荧光团的遗传编码生物传感器应用于微生物中，进行定量比率荧光成像的方法。通过将这些生物传感策略与先进成像技术相结合，该方法可在单细胞水平实现高分辨率、实时分析，从而更深入地揭示小分子动态变化规律。

摘要

研究微生物内小分子动态对于全面理解微生物功能至关重要。生物体内及生物体间的小分子动态在微生物生理、共生关系及疾病过程中发挥着关键作用。然而，利用现有大多数技术对这些动态进行监测仍极具挑战性。基于荧光蛋白的基因编码生物传感器是追踪小分子动态的有力工具。 体内 具有推动新发现的巨大潜力。这些生物传感器最常用于荧光成像，通常与灌注装置联用，以实现对环境条件的精确控制。当与先进的成像技术相结合时，该方法可提供高分辨率、时空分辨的数据，有助于揭示微生物单细胞水平的响应机制。尽管前景广阔，此类生物传感器的实际应用在技术上仍具挑战性。理解其中关键步骤对于其更广泛的应用至关重要。本文介绍了一种实验方案，旨在支持将新近构建的生物传感器有效导入微生物中，用于在受控条件下进行定量比率荧光成像。

引言

基于单荧光蛋白强度的生物传感器和双荧光蛋白生物传感器被研究人员广泛应用于多种实验场景¹一些研究采用多重生物传感器分析，在同一细胞内同时追踪多个信号²许多此类生物传感器依赖于配体结合域，配体结合事件会引发构象变化，从而改变荧光特性^3,4基因编码的生物传感器已成为 体内 在多种系统中进行成像⁵，实现对离子和代谢物浓度在时空尺度上的高分辨率监测¹然而，早期的生物传感器在动态范围和信噪比（SNR）方面存在局限性⁶近年来，基于构象敏感型荧光蛋白（csFPs）的单荧光探针强度型生物传感器取得了显著进展，性能大幅提升。然而，蛋白质表达水平的差异仍可能影响其检测结果 体内 使用基于基因编码荧光蛋白的生物传感器进行测量⁶，这些方法常用于在活细胞中可视化信号分子和代谢物^7,8单荧光探针强度型生物传感器无法对生物传感器的表达水平进行归一化，而表达水平可能存在波动 体内然而，通过引入一种....

方案

1. 比值型生物传感器的理性设计（图1）

注意：根据相关标准选择目标结合蛋白作为感应结构域，这些标准包括：(i) 特异性，(ii) 亲和力，(iii) 结构信息，以及 (iv) 配体结合后发生的构象重排。特异性确保生物传感器仅对目标分子产生选择性响应，避免交叉反应。亲和力需与目标分子在生物学环境中的预期浓度范围相匹配。结构信息来源于实验数据或计算模型（例如 AlphaFold 生成的模型），可揭示感应结构域的三维结构及配体诱导的构象变化。这些信息用于确定荧光团的合适插入位点。随后，根据预期应用设计验证策略，以评估生物传感器的响应能力与动态范围。

1. 构建俄罗斯套娃设计 计算机模拟 通过插入 Green-Apple Matryoshka 装置¹² 将盒式结构插入感知结构域，使得对构象变化敏感的环状重排绿色荧光蛋白（cpGFP）能够响应配体结合所诱导的感知结构域重排。
   1. 使用分子可视化软件（如 Chimera）分析结合结构域的结构。如果三维结构不可用，则使用 AlphaFold 生成可靠的模型。
   2. 将蛋白质结构中的柔性环识别为薄弱位点，并作为双荧光报告基因盒的潜在插入位点，选择这些位点时应避免破坏蛋白质的整体功能或稳定....

结果

为了在微生物系统中成功实现生物传感器的比率成像，必须解决若干技术挑战。

表达系统：首要挑战在于表达系统的选择，包括基于质粒的表达、染色体整合表达、由组成型或诱导型启动子驱动的表达，以及是否带有亚细胞定位标签。这些因素会显著影响生物传感器在细胞内的稳定性、毒性及定位（图1）。必须确保表达水平处于最佳状态，以避免因过表达导致的假象，或因信号不足而无法检测。此外，生物传感器的表达方式必须能够维持宿主细胞的正常生理功能。

培养密度：第二个瓶颈是培养密度。 微生物的生长阶段和细胞浓度直接影响成像质量。培养腔室中细胞过于密集可能导致细胞重叠和信号干扰，从而降低分辨率；相反，密度过低则可能导致信噪比不足。获得能够清晰成像单个、不重叠细胞的最佳密度至关重要，这需要对培养条件进行精细优化，并持续监测细胞生长情况（图2）。

灌流系统：第三个.......

讨论

基于遗传编码荧光蛋白的生物传感器能够实时监测活细胞内分析物的浓度¹。这些生物传感器通常通过将构象变化转化为光学信号来发挥作用，信号可通过比率法或强度法进行检测。强度法生物传感器依赖于单一荧光蛋白（FP）的荧光强度变化，因此对生物传感器表达量的变化较为敏感，可能导致测量偏差。该问题可通过使用比率法生物传感器加以缓解，此类传感器可同时检测两种光谱上 distinct 的荧光蛋白的荧光信号。这两种发射光信号的比值可提供更为可靠的读数，且不受生物传感器表达量的影响^9,12。然而，比率法的应用受限于有限的光谱空间，从而限制了多种生物传感器或额外荧光标记物的共表达。

在微生物系统中，基因编码的生物传感器能够以极小的侵入性提供高时空分辨率。尽管现有多种生物传感器可供选择，但其在微生物中的应用仍然有限。使用这些工具时最关键的步骤之一是确保生物传感器的适当表达；表达过高或过低均可能影响实验结果。在本实验方案的开发过程中，我们进行了多项优.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	Sigma-Aldrich Co.	A5306-250G
用于单倍体酵母细胞的 CellASIC ONIX 培养板	Merck KGaA	Y04C-02-5PK
CellASIC ONIX2	Merck KGaA	CAX2-S0000
CSM-Ura	Thermo Fisher Scientific	11387899
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich Co.	G8270-100G
D-山梨醇	Sigma-Aldrich Co.	S1876-10MG
NaCl	Sigma-Aldrich Co.	S9888-25G
pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6s	NA	7	用于在酵母中表达 GA-MatryoshCaMP6s
TCS SP8 STED	Leica	NA
酵母菌株 K601/ W303-1A MAT-a	NA	8	ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1-1 leu2-3 leu2-112 can1-100
YNB	BocaScientific	GCM16.0500
α-交配因子乙酸盐	Sigma-Aldrich Co.	T6901-.5MG