方法文章

使用液滴转移法制备巨型单层囊泡的可靠方法

DOI：

10.3791/68340

⸱

2025年9月19日

 ,  ,  , 
1The Biorobotics Institute, Sant'Anna School of Advanced Studies - Pisa, 2Department of Excellence in Robotics & AI, Sant'Anna School of Advanced Studies

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本初学者指南介绍了一种通过液滴转移法制备巨大单层囊泡（GUVs）的通用实验方案，讨论了其中的关键步骤，并提供了相关见解，以帮助针对不同应用（包括合成生物学和微机器人技术）进行可能的调整。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在过去的二十年中，液滴转移法（也称为倒置乳液法、双重乳液法、相转移法或乳液转移法）在制备巨大单层囊泡（GUVs）方面展现出显著优势，尤其适用于将不同货物分子装载到GUVs中，因此在合成生物学领域发挥着关键作用。由于其封装效率高且操作简便，该方法已被广泛应用于人工细胞的构建。然而，在文献中可见多个参数存在较大差异，导致实验结果极不一致。这种差异部分源于该方法本身具有高度灵活性，需根据不同需求和应用场景进行调整，但对于初次接触该技术的研究人员而言，可能带来一定的困惑。

为了帮助初学者理解该方法以及关键参数的作用，本文在介绍通过液滴转移法制备大单层囊泡（GUV）的实验方案的同时，提供了有关其基本物理化学原理的提示。因此，这一制备GUVs的分步指南包含了基于文献和实践经验的思考与实用建议。

考虑到可能的变异来源，已确定几个关键因素：磷脂对光、氧化和水解的敏感性；用于溶解磷脂的油相选择（脂质溶液，LS）；以及离心后 giant unilamellar vesicles（GUVs）的回收。本文提出了一些成本效益较高的措施，以尽量减少大气氧和湿度的干扰。为了帮助确定合适的油相与磷脂组合，本文在通用实验方案基础上，进一步讨论了脂质溶液相关的物理化学性质。最后，为了避免操作繁琐的流程，本文提出了一种简单且安全的方法，可一次性彻底去除油相，获得纯净的 GUV 分散液。这些改进措施有助于加快针对新型 GUV 组成的优化过程，有望促进其在合成生物学及微机器人学等相关领域的更广泛应用。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

采用先前描述的技术制备脂质体1，Pautot 等人. 建立了一种制备直径在0.1至1 µm范围内的脂质囊泡的方案2液滴转移法在制备更大尺寸囊泡（直径超过1 µm）方面已迅速证明其有效性。3，由于操作简便且包封效率高，正日益受到青睐。事实上，与溶胀法（如凝胶溶胀或电形成法）相比，该方案在形成数量相当的囊泡时，所需货物溶液的体积更少，相应地也减少了废液产生4GUV 可通过其他方法在流体界面组装，其封装效率与基于微流控芯片的方法相当。然而，与基于微流控芯片的方法相比5,6 或连续液滴界面交叉封装（cDICE）7液滴转移法在任何配备基础设备的实验室中均可实现最简单的装置设置。此外，微流控方法可能导致GUVs膜中出现不期望的油相包埋。因此，在人工细胞领域，当需要将珍贵的货物分子装载到GUVs中时，液滴转移法已成为首选方法 3,8,9,10 以及近期的微机器人技术 11,12.

该方法基于磷脂介导的水/油界面稳定作用，从而形成膜的双层结构。首先，将磷脂溶解于油相中（脂质溶液，LS），然后将含有目标GUV内含物（内相溶液，IS）的水相溶液加入该油相LS中，制备成水包油乳液。随后，将该乳液转移至一根预先生有另一水相溶液（称为外相溶液，OS）的试管中，该OS已与LS预先平衡，以形成水-油界面。当通过离心迫使水相液滴穿过此OS/LS界面时，即形成GUV：GUV的内层在IS液滴表面形成，而外层则在OS与LS之间形成（图1）。

已有多种实验方案变体被报道，其参数根据具体的实验需求进行了调整。Moga 等人首次对这一过程进行了系统优化13，而 Zhang 等人则在近期的一篇综述中汇总了大多数相关实例14。尽管已有大量影响实验方案的参数被描述，但目前尚无针对新型 GUV 配方如何开展优化过程的明确指导，也缺乏 GUV 制备后回收与操作的最佳实践建议。基于现有的科学文献及我们的直接经验，本文提供了一种制备 GUV 的通用实验方案，并讨论了其基本原理。通过这种方式，我们为新型 GUV 配方的优化提供了实用建议，并提出了两条普遍适用于该方案的注意事项：一是在受控环境中配制 LS，二是采用一种简便方法去除上层油相以获得纯净的 GUV 样品。我们选取了两个示例：第一个示例中，IS 为 240 mM 蔗糖，LS 为含 0.2 mM DOPC 的硅油 AR20（条件 E [空白]，见表 1）；第二个示例中，IS 为含 0.2% 1.1 µm 聚苯乙烯微粒的 240 mM 蔗糖溶液，LS 为含 3.18 mM DOPC 的矿物油（条件 P [含微粒]，见表 1）。两个样品均使用 240 mM 葡萄糖作为 OS。我们选择这一渗透压条件，以获得在生理环境下具有松弛脂质膜（低膜张力）的 GUV。

脂质囊泡形成示意图；包括胶束化、双层相互作用和囊泡组装步骤。
图1：液滴转移法的示意图。（A）在三个独立小瓶中分别配制三种溶液：含磷脂的油相（黄色相）以形成脂质溶液，含蔗糖的溶液（青色）作为内相溶液，以及等渗葡萄糖溶液（白色）作为外相溶液。（B）将脂质溶液（LS）与内相溶液（IS）混合形成稳定的乳液，随后（C）使外相溶液（OS）与脂质溶液（LS）之间的界面达到平衡，然后（D）将乳液倾注于该界面上。（E）通过离心力驱动水相液滴穿过LS/OS界面，从而（F）促进GUV的形成。该图未按比例绘制，仅用于示意该方法的流程。缩写：LS = 脂质溶液；IS = 内相溶液；OS = 外相溶液；GUV = 巨大单层囊泡。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注意：除非另有说明，所有操作均在室温下进行。

1. 溶液的配制

  1. 水溶液的制备（IS 和 OS）
    1. 在两个不同的称量舟中，分别称取 2.16 g 葡萄糖和 表 1 中指定量的蔗糖。将粉末加入两个 150 mL 烧杯中，各加入 40 mL 超纯水，通过搅拌混合均匀。
    2. 将溶液转移至两个 50 mL 量筒中，并用超纯水定容至 50 mL，得到 240 mM 葡萄糖溶液和 表 1 所示浓度的蔗糖溶液。用封口膜覆盖量筒口，通过反复倒置量筒数次以混匀溶液。
    3. 使用 50 mL 注射器和 0.22 µm 滤膜过滤溶液，防止微生物污染。
    4. 对于条件 P，配制如下混合液：100 mg/mL 的 1.1 µm 聚苯乙烯颗粒分散液 2 µL，步骤 1.1.1 中制备的蔗糖溶液 24 µL，再用超纯水定容至 100 µL（最终悬浮液：0.2% 微粒悬浮于 240 mM 蔗糖溶液中）。溶液可在 +4 °C 下保存最多 1 周，或分装为 1 mL 等份至 1.5 mL 离心管中，在 -20 °C 长期保存。
  2. 在受控环境中搭建手套箱以制备脂质溶液（LS）
    1. 裁剪五段硅胶管，内径为 7 mm，外径为 13 mm，长度如 表 2 所示（管道 1 至 5）。
    2. 裁剪四段硅胶管，内径为 3 mm，外径为 7 mm，长度如 表 2 所示（管道 6 至 9）。
    3. 将管道 1 的一端连接至一个双向阀，另一端连接至三通接头（图 2A）。
    4. 将管道 2 连接到双向阀的另一端口，再将管道 3 和管道 4 连接到三通接头，其中管道 3 连接至与管道 1 相对的端口（图 2A）。
    5. 将管道 4 的自由端连接至手套箱的进气口（进气管，图 2B）。
    6. 将手套箱附带的三通阀连接至出气口，再将该阀连接至管道 5（出气管，图 2C）。
    7. 将管道 6 的一端连接至 18 G 针头，另一端连接至一个双向接头。对管道 7 和 21 G 针头重复此操作（图 2D）。
    8. 将两根针头插入带隔垫的瓶盖中：此带针头的瓶盖可用于控制氮气的流入以及氮气和氯仿的流出。将该瓶盖存放在一个无盖的空 50 mL 离心管中，以避免针头接触其他物体（图 2D）。
    9. 从手套箱内部，分别将管道 8 和管道 9 挤压并插入进气口和出气口（图 2E）。
  3. 脂质溶液（LS）的制备
    1. 将手套箱置于通风橱内或旁边。打开手套箱，在其底部放入一个底部装有硅胶颗粒的干燥器（图 2F）。用白色支撑板盖住干燥器，并在其上方覆盖纸巾。
    2. 将所有必需材料放入手套箱内（图 2G）：一个湿度计、氯仿中的 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DOPC）溶液、油类（表 1）、洁净的 20 mL 棕色玻璃瓶（已打开并配有相应瓶盖）、Hamilton 注射器（表 1）、P10000 移液器及吸头。将装有氯仿溶液的玻璃瓶放置在软木环架、150 mL 烧杯或其他合适的支架上，尽可能靠近操作者一侧。
      注：此预防措施可防止因抽真空和通氮气循环过程中手套膨胀和收缩而导致瓶子倾倒。
    3. 关闭手套箱，确保两半部分不会滑动，并使用手套箱附带的塑料螺钉将其密封。
    4. 关闭出气阀，并将管道 5 浸入装有约半杯水的 500 mL 烧杯中（图 2H）。
    5. 将进气管（管道 2）的阀门控制端连接至真空管线，另一端连接至氮气源（管道 3，图 2A）。此时手套箱已完全组装完毕，如 图 2J 所示。
    6. 打开阀门和真空管线，直至减压使手套膨胀至难以弯曲的刚硬状态。随后关闭真空管线和阀门。
    7. 打开氮气，使压力降低至手套完全从手套箱中缩回。关闭氮气管线。
    8. 重复步骤 1.3.6 至 1.3.7 至少 10 次，确保内部湿度降至 40% 以下。
    9. 通过调节真空和氮气控制内部压力，以便操作者佩戴手套时操作顺畅。
    10. 使用 Hamilton 注射器，将 表 1 中指定体积的氯仿 DOPC 溶液转移至棕色玻璃瓶中。用步骤 1.2.9 中制备的带针头瓶盖密封该瓶。
    11. 通过双向接头将管道 6 与管道 8 连接，管道 7 与管道 9 连接（图 2I）。
    12. 脱下手套，打开出气阀。
      注：第二位操作者可在步骤 1.3.13 至 1.3.15 中协助操作，以加快流程。
    13. 缓慢开启氮气流，通过观察之前放置管道 5 的烧杯中的气泡来检查气体流速。逐步调节氮气流速，直至达到较高流速但仍可清晰观察到单个气泡的程度。让氮气持续通入 3 分钟后关闭氮气管线。
      注：过高的氮气压力可能导致氯仿中的 DOPC 溶液在瓶内飞溅，减少可用于后续脂质溶液（LS）的磷脂量。此外，高压会增加针头从瓶中弹出的风险。因此，必须谨慎调节氮气流速至最佳水平，使氯仿轻微搅动而不引起不可控的飞溅。
    14. 在此期间，准备一个干燥器作为水浴，并在加热板上将其加热至 80 °C。
    15. 等待烧杯中最后一个气泡逸出后，关闭出气阀。重新戴上手套，断开管道 8 和管道 9 与双向接头的连接。
    16. 确认棕色瓶中所有氯仿均已蒸发后，打开瓶盖，将瓶盖移回 50 mL 离心管中。打开油瓶，将所需体积的油（表 1）转移至棕色瓶中，盖上瓶盖。脱下手套并打开手套箱。
    17. 用封口膜密封 LS 溶液。剧烈涡旋振荡至少 30 秒。在步骤 1.3.14 中准备的水浴中于 80 °C 孵育 30 分钟。再次剧烈涡旋振荡至少 30 秒。室温下静置孵育过夜。
    18. 继续进行 GUVs 的制备，或将样品在 +4 °C 下保存最多 1 周。
      注：在非对称 GUV 制备中，可在界面和乳液中使用两种不同的 LS，以形成具有不同脂双层的膜结构15。

2. GUV 的制备

  1. 设置便于移除油相的容器
    1. 使用剪刀剪掉一个5 mL离心管的管盖。在管盖中心钻一个约8 mm的孔，并检查孔径是否足够大，以允许P1000吸头插入并锁定（图3A）。如果孔太窄，请重复前两个步骤；如果孔太宽，则丢弃该管盖，并从步骤2.1.1重新开始使用新的管盖。
    2. 剪下一小块2 × 5 cm的砂纸，打磨孔的边缘。将带孔的管盖重新盖回5 mL离心管上，在3,000 × g条件下离心5分钟，以去除孔中残留的所有塑料碎屑。取下管盖并丢弃离心管。
    3. 取一个新的5 mL离心管，剪掉其管盖，并换上已打孔的管盖。将一个O型圈放在管盖顶部，通过孔插入一个P1000吸头。将O型圈卡在吸头与管盖之间，并确认吸头无法进一步推入管内（图3B）。通过吸头向5 mL离心管中加入5.5 mL的OS。
  2. OS/LS界面的形成
    1. 在结晶皿中准备水浴，并在加热板上将其加热至50 °C。
    2. 对第1.3节中制备的LS小瓶进行涡旋振荡，剧烈振荡至少30秒。将LS置于50 °C水浴中加热30分钟。
    3. 将第1.1节中制备的水溶液在室温下平衡至少10分钟。
    4. 用移液器将300 µL的OS加入1.5 mL离心管或按步骤2.1改装过的5 mL离心管中。缓慢地将100 µL的LS加在OS上方，确保在管中形成两个明显且连续的相。让界面平衡10分钟。
      注意：为了形成均匀的磷脂单分子层，LS应均匀分布在OS上方（图4A）。如果LS层不连续，可用微量移液器重新分布LS体积，或增加LS的体积（对于石蜡等高粘度油类特别有帮助）。
  3. 水包油乳液的形成
    1. 在2 mL离心管中，按顺序加入250 µL的LS和6.25 µL的IS，以制备2.5%的水包油乳液。
      注意：根据我们的经验，该水包油比例最有可能形成稳定的乳液，从而提高实验方案的成功率（图5）。为提高GUV产率，建议增加乳液体积，而非提高IS/LS比例。
    2. 使用以下一种或多种方法混合两相，直至混合物呈现均匀且稳定的状态：涡旋振荡、在标准微量离心管架上进行机械震荡，或用手指轻敲离心管（参见图5中均匀乳液的示例）。
    3. 将200 µL乳液转移至第2.2节中制备的OS/LS界面上方。
    4. 若使用1.5 mL离心管，直接盖紧管盖即可；若使用第2.1节改装的5 mL离心管，则在吸头顶部加盖橡胶帽，并小心地将离心管转移至50 mL锥形管中。
  4. 通过离心实现液滴转移
    1. 按照表1的指示，在室温下对离心管进行离心。离心结束后，检查管底是否存在不透明的沉淀物，以及上部是否为清晰的油相。

3. GUV 恢复

  1. 去油步骤
    注意：根据实验需求，去油操作可在以下三个不同且可相互替代的步骤中进行。
    1. 若GUVs是在标准的1.5 mL离心管中制备的，请使用P1000移液器缓慢吸除油相，最后几滴使用P200移液器完成，注意不要扰动沉淀。
      注意：较细的吸头有助于更彻底地去除油相，因此将小体积吸头（10–200 µL）插入P1000吸头中可提高该步骤的准确性。
    2. 若需同时处理多个在不同1.5 mL离心管中制备的GUV样品，可借助布氏漏斗进行去油。将一段粗硅胶管（内径7 mm，外径13 mm）连接至真空泵，另一端插入布氏漏斗的接口，并用橡胶垫圈密封。在该管的另一端插入一个P1000吸头，用Parafilm封口膜包裹后，剪去约3 mm的尖端，再插入一个P200吸头中。打开真空泵，用P200吸头抽吸油相，随后关闭真空泵，并使用P200移液器吸除残留的最后几滴油。
    3. 若GUVs是在步骤2.1中所述容器中制备的，请从管上取下吸头，确保橡胶帽不脱落（图3D）。然后丢弃吸头，保留橡胶帽、O型圈和带孔盖子以供重复使用。
    4. 使用P1000微量移液器将管中的OS溶液吸除（图3E），保留约50 µL液体体积，注意不要扰动沉淀。
    5. 更换吸头，将沉淀重悬于剩余液体中，并转移至一支洁净的2 mL离心管中。
  2. GUV洗涤
    注意：这些步骤的目的是去除在步骤3.1中未能完全清除的油相残留。如有需要，应重复步骤3.2.1和3.2.2，直至在管中观察不到任何油滴为止。
    1. 向离心管中加入2 mL OS溶液，在室温下以1,500 × g 离心5分钟。
    2. 吸除OS溶液，保留约50 µL液体体积，注意不要扰动沉淀。
    3. 重复上述两个步骤。
  3. 体积平衡
    注意：本步骤旨在便于比较不同GUV制备方法的产率。
    1. 使用P200微量移液器，将沉淀重悬于上一步骤3.2.2最后一次重复后剩余的约50 µL液体中。
    2. 通过将移液器设定为20，并将吸头浸入GUV分散液中（不接触管壁），逐步增加体积，使液体自然流入吸头，从而准确测量该体积。
    3. 加入OS溶液，使最终体积达到100 µL。

4. 观察与尺寸分析

  1. 显微图像采集
    1. 用手指轻弹试管，轻轻混匀GUV分散液。
    2. 取10 µL GUV样品加入血球计数板腔室中，静置至少5分钟，使GUV沉降到腔室底部。
    3. 在相差显微镜下观察样品。以血球计数板的刻度线为参考，移动观察区域，至少采集20张图像，确保各观察区域不重叠。
  2. 尺寸分析
    1. 将图像导入ImageJ软件。
    2. 为计算像素/µm换算系数，选择一张显示血球计数板50 × 50 µm方格的图像（参考制造商数据表以正确识别），然后选择直线选择工具，在方格两个相邻角之间画一条直线，并点击分析 | 测量进行测量。重复此操作3次，计算平均值。
    3. 点击分析 | 设置尺度以设定换算系数。将步骤4.2.2中得到的数值填入像素距离框中，将数值50填入已知距离框中，并在长度单位框中填入µm。
    4. 点击分析 | 设置测量，勾选面积选项。选择椭圆选择工具，单击鼠标左键并按住Shift键，使生成的圆形与GUV轮廓重合。点击分析 | 测量以测定其直径。对每张图像中的每个GUV重复此操作。
    5. 在结果窗口中，点击文件 | 另存为…导出GUV面积的csv文件，然后使用GitHub上提供的脚本分析尺寸分布16。
      注意：可以跳过步骤4.2.3，在运行脚本时直接指定像素/µm换算系数。该系数的计算方法为：将步骤4.2.2中获得的数值除以50。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

理想的GUV制备表现为形成清晰的油相和明显的沉淀物（图4A）。当水滴未能转化为GUV时，通常会坍塌并在OS/LS界面处留下磷脂碎片（图4C）。这种现象很可能是由于磷脂在水/油界面处未充分平衡，导致油相中的磷脂及其他分子发生聚集所致。然而，即使没有可见的沉淀物或界面处存在碎片，GUV仍可能形成，因此可继续进行后续操作。尽管洗涤步骤无法完全去除所有磷脂碎片，但其能显著帮助消除油滴，从而提高样品的整体质量（比较图6A与图6B）。

使用陈旧的脂质溶液（LS）或在高湿度条件下制备的脂质溶液，通常会导致巨型脂质体（GUV）分散液的质量下降，产率降低，并含有较多无序聚集体，这些聚集体很可能由来自油相的磷脂及其他分子形成（图6C）。对于在高湿度条件下制备的脂质溶液，我们在GUV生成中观察到变异系数超过0.8（部分样品中GUV数量极少），而在改良的手套式密闭箱中制备的脂质溶液，其变异系数则低于0.5。

不同的离心条件可能影响GUV的产率和质量。通过定性分析发现，3,300 × g 离心20分钟是制备负载蔗糖的GUV（样品E）的良好条件。降低离心速度（500 × g 离心45分钟）会导致产率下降，而提高离心速度（16,600 × g 离心5分钟）则会形成更多无序的磷脂聚集体。离心力过弱可能使大量液滴无法穿过OS/LS界面，从而导致产率降低；而离心力过强则可能在液滴穿越界面时，因时间不足而影响磷脂在外层叶的有序排列（图7）。通过调整离心参数，也可优化微粒的包封效果，前提是微粒的质量密度大致与IS相匹配。为此，降低离心加速度（相应延长离心时间）可避免固体微粒对磷脂膜施加过大的力而导致膜破裂，从而实现更均匀的微粒包封（图6D展示了良好的包封示例），目前对最佳离心参数的探索仍在进行中17）。

由于磷脂的扩散可能受到油相的影响，因此可以进行一项简单的定性测试来评估乳液的稳定性（图5）。通过在内水相（IS）中溶解显色染料（亮蓝FCF）以增强可视化效果，可制备不同水/油比例的乳液并随时间观察其变化。乳液稳定性的降低可通过水相液滴的聚集以及随后与油相的分离现象进行观察。由于较大的液滴（肉眼可见）较难转化为GUVs，因此我们建议选用相分离程度最小的乳液条件。

通过第4节所述的粒径分布分析，可以验证实验方案中各种参数变化的影响：可使用ImageJ从相差显微镜图像中测量GUV的直径，并利用GitHub上提供的脚本分析其粒径分布16。例如，按照本方案操作，可观察到当使用矿物油替代硅油AR20时，直径较大的GUV数量有所增加（图8）。

用于化学过程的氮气、真空、双向阀、管道系统的手套箱装置示意图。
图2：手套箱装置示意图。 本图展示了用于脂质溶液制备的手套箱主要改装部分。(A) 氮气和真空进气连接口；(B) 与手套箱连接的进气口；(C) 出气阀；(D) 带针头的瓶盖，用于溶剂蒸发；(E) 用于溶剂蒸发的细管；(F) 用于吸收湿气的硅胶颗粒；(G) 需放入手套箱内的物品：数字温湿度计（1）、有机溶剂中的脂质溶液（2）、软木环支架（3）、玻璃注射器（4）、带隔膜和针头的敞口瓶盖（5）、油溶液（6）、带盖的敞口避光小瓶（7）、10 mL吸头（8）、P10000移液器（9）；(H) 浸入水中的出气管末端；(I) 用带针头的瓶盖密封并连接进气和出气管路的小瓶；(J) 改装后手套箱的示意图。请点击此处查看该图的放大版本。

GUV 分离过程；离心步骤和相识别；囊泡的显微图像分析。
图 3：便于去除油相的容器。 按照第 2.1 节实验方案，在便于去除油相的容器中制备 GUV 的主要步骤。（A）在 5 mL 管盖上钻孔，使 P1000 吸头能够插入；然后（B）将管盖安装在一个空的 5 mL 离心管上，吸头通过 O 形圈插入孔中。（C）按照实验方案第 2.2 和 2.3 节将溶液加入离心管中，盖上吸头，并将该管放入一个 50 mL 离心管中。使用硅油中 0.2 mM DOPC 制备的 GUV 被装载了 230.7 mM 蔗糖和 3.1 mM 亮蓝 FCF 以增强可视化效果。（D）离心后，上层油相被截留在吸头内部，同时包含部分 GUV 缓冲液（由于部分液滴未能转化为 GUV，染料释放到油相中，因此呈现青色）。得益于橡胶帽的设计，吸头可连同其中液体内容物一起轻松从 5 mL 管中取出，从而实现整个油相的快速简便去除。（E）GUV 沉淀物可轻松从管底收集，形成清晰的分散液，无明显油污染，这一点通过（F）相差显微镜观察得到验证。比例尺 = 20 µm。缩写：LS = 脂质溶液；IS = 内部溶液；OS = 外部溶液；GUV = 巨型单层囊泡；DOPC = 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱。请点击此处查看该图的放大版本。

离心过程；油相/脂质溶液界面，试管中沉淀物的形成；分离实验。
图 4：GUV 的形成。 示例包括（A）油相/脂质溶液（OS/LS）界面，（B）具有清晰油相的干净 GUV 沉淀，以及（C）在 OS/LS 界面处含有碎片的 GUV 沉淀（沉淀和碎片呈红色，因为该 GUV 群体的内相溶液（IS）中添加了 1.65 mM 新红染料以增强可视化效果）。缩写：LS = 脂质溶液；IS = 内相溶液；OS = 外相溶液；GUV = 巨型单层囊泡。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示试管中乳液随时间变化的相分离实验；乳化剂为 AR20。
图 5：不同油相和水/油比例下的乳液稳定性。该图展示了乳液随时间变化的稳定性，取决于所用油的类型及水/油（w/o）比例。内水相（IS）由 230.7 mM 蔗糖和 3.1 mM 亮蓝 FCF 组成，以增强乳液的可视化效果。使用矿物油制备的乳液比使用硅油 AR20 制备的乳液更不稳定。随着 w/o 比例的增加，这种差异进一步加剧。尽管在硅油 AR20 中制备的乳液显著更稳定，但其稳定性也随 w/o 比例的增加而下降，在乳化后立即可见相分离现象（硅油 AR20，10% w/o 比例时）。请点击此处查看该图的放大版本。

显示囊泡尺寸变化的显微图像；标注区域 A-D 为放大细节。
图6：使用相差显微镜观察GUVs。 由矿物油中含3.18 mM DOPC的脂质溶液（LS）制备的蔗糖负载GUVs的20倍放大图像。(A) 去除油相后回收的样品；(B) 洗涤步骤后回收的样品；(C) 在未控制氧气和湿度环境中制备的脂质溶液所获得的GUVs产率较低；(D) 负载微粒的GUVs。比例尺 = 10 µm；油滴以圆圈标出，磷脂与油分子的无序聚集体以箭头指示。缩写：LS = 脂质溶液；GUVs = 巨型单层囊泡。请点击此处查看该图的放大版本。

显微镜图像，细胞培养物的比较 A-C，显示细胞密度和形态。
图7：不同离心条件对GUV形成的影响。 使用由0.2 mM DOPC溶于硅油AR20中组成的脂质溶液（LS）制备的负载蔗糖GUV的相差显微图像。该图展示了在以下条件下GUV的定性比较：（A）16,600 × g 离心5分钟，（B）3,300 × g 离心20分钟，以及（C）500 × g 离心45分钟。高离心速度会导致磷脂聚集体更多出现，而低离心速度则导致产率降低。比例尺 = 50 µm。缩写：LS = 脂质溶液；GUV = 巨型单层囊泡；DOPC = 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱。请点击此处查看该图的放大版本。

粒径分布、对数正态拟合、直方图、直径分析、图表、样品A与B的比较。
图8：粒径分布分析。比较两种负载蔗糖的GUV样品，分别来自（A）矿物油中的0.2 mM DOPC和（B）硅油AR20中的0.2 mM DOPC（*该样品稀释了10倍，以便在相差显微镜下清晰区分GUV）。根据第4节实验方案进行的分析显示，与硅油AR20样品相比，矿物油样品的粒径分布向更大直径方向偏移。然而，硅油样品的产率几乎高出20倍。缩写：GUV = giant unilamellar vesicle（巨大单层囊泡）；DOPC = 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱）。 请点击此处查看该图的放大版本。

步骤条件 E条件 P描述
1.1.14.11 g 17.11 g蔗糖质量
1.1.12.16 g2.16 g葡萄糖质量
1.1.2240 mM1000 mM蔗糖浓度
1.1.2240 mM240 mM葡萄糖浓度
1.3.2Silicone oilMineral oil用于液相分离的油相
1.3.20.1 mL glass syringe0.5 mL glass syringe用于转移氯仿中的DOPC溶液的玻璃注射器
1.3.1063 µL500 µL氯仿中DOPC溶液的体积
1.3.1610 mL5 mL油相体积
2.4.13300 g 20分钟500 g 45分钟离心条件

表1：实验方案的变异条件。 本表列出了用于制备两种不同GUV群体的实验步骤（第一列所示）的各种变异条件：负载蔗糖的GUV（条件E）和负载微粒的GUV（条件P）。

ID涉及的步骤内径（mm）外径（mm）长度（mm）)
11.2.1; 1.2.371350
21.2.1; 1.2.4; 1.3.571350
31.2.1; 1.2.4; 1.3.5713100
41.2.1; 1.2.4; 1.2.57132000
51.2.1; 1.2.6; 1.3.137132000
61.2.2; 1.2.7; 1.3.113750
71.2.2; 1.2.7; 1.3.113750
81.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.1537200
91.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.1537200

表2：手套箱中用于气体和真空连接的管道。 该表格列出了用于将手套箱连接至氮气和真空管路的硅胶管尺寸。提供了参考编号以方便组装过程。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GUVs 的制备方法可分为两大类：一类是基于底物水合溶胀的方法，另一类是基于流体界面组装的方法。第一类方法在提供大量 GUV 用于脂质膜或跨膜蛋白的生物物理表征方面非常高效。相比之下，诸如液滴转移等方法则因对货物用量较少且包封效率更高，主要被选择用于货物的包封18。

由于这一原因，大量不同类型的货物已被封装到GUV中，使得液滴转移成为人工细胞的参考性制备过程3,8,9,10，以及构建新型仿生微机器人的一种可能方案11,12。为了调控GUV膜的理化性质，可掺入多种不同分子，例如离子型磷脂10、脂肪酸19、聚乙二醇（PEG）等聚合物20，或胆固醇21（尽管胆固醇等疏水性分子对油相具有高亲和性，导致与溶胀法相比，对膜组成的控制能力较低22）。该实验方案具有足够的灵活性以支持这些修饰，但其中某些步骤的影响更为显著。

为了探讨该方法的关键要点，本文描述了一种制备两种不同GUV群体的方案：一种是含有蔗糖溶液的GUV制备，另一种是包封微粒的GUV制备。表1中详细列出了该方案的差异，分别对应条件E（空载）和条件P（含微粒）。该方法通过在由磷脂驱动的双稳态过程中，将水相液滴从油相转移至另一水相，从而实现GUV的形成，此过程受到内水相（IS）、外水相（OS）和油相（LS）三种相态的理化性质影响23。

在这三种因素中，光、氧化和水解对磷脂的影响使其对光敏感性最强24,25,26。因此，用于长期在-20°C下储存磷脂的有机溶剂（通常为氯仿或甲醇）的初始蒸发步骤必须在棕色小瓶中，并在氮气或氩气气流下进行。如果实验环境中湿度较低未得到保障，磷脂可能受到破坏13, 14, 27。因此，应于密闭环境（如手套箱）或本方案中所述经济型改良手套腔室内制备脂质体。一旦将油相加入脂质膜中，即可将脂质体从手套腔室中取出，并通过涡旋振荡和加热使磷脂完全溶解。

尽管某些方案在此步骤中包含超声处理13，但局部温度升高可能导致某些脂质体（LS）制剂发生尚未描述的损伤。因此，在水浴中加热溶液可能提供一个更可控且更均匀的过程。为进一步降低损伤脂质体（LS）的风险，本方案建议使用两种不同的温度：由于新制备的脂质体溶解所需的能量高于先前已溶解的脂质体（这是由于玻璃小瓶表面铺展的磷脂分子膜排列更为致密），首次脂质膜溶解采用80 °C，而在使用前重新溶解磷脂时则采用50 °C。由于通常观察到3.18 mM DOPC在矿物油中的性能随时间推移而变异性增加（图4C），一般建议在一周内使用脂质体（LS）。然而，某些油类与磷脂的组合可能具有更长的稳定性，且使用手套箱似乎也能随时间推移提高脂质体（LS）的稳定性。

根据特定的磷脂组合定制GUV膜可能需要对本方案进行个性化调整。为了在所有可能的变异中进行选择，可参考轻相溶液（LS）的物理化学性质提供指导。磷脂在轻相溶液中的临界胶束浓度（CMC）及其扩散性会受到溶液中分子间化学相互作用的影响28。因此，IS/LS乳液中水滴的形成受到磷脂在油相中扩散速度及其到达水/油界面形成稳定单层（即膜的内层）能力的影响。在本方案所使用的两种油中观察到扩散性的差异，其中硅油AR20可使IS/LS乳液具有更高的稳定性（图6）。由于在两种油中，当水以2.5%的比例分散时均观察到最稳定的乳液（与先前在矿物油中的观察结果一致13），我们将其确定为一个普遍适用的比例。

尽管如此，较高的比例可能提供一些有用特性（例如，矿物油中的POPC表现出向更大GUVs转变的趋势13），我们建议进行一次如图6所示的初步定性测试，以了解乳液的稳定性，从而预估包封效率。在此，我们建议读者不要依赖精确的时间控制或操作步骤的重复次数来形成乳液，因为其效果严格依赖于操作者或所用仪器。相反，我们提供一个检查点，以帮助操作者判断乳液质量是否已足够好，从而至少在理论上最大化液滴转化为GUVs的可能性。磷脂在油相中的扩散性也会影响其在液滴转移过程中重排并形成GUV膜外层的能力2,7,18,29。适当的LS/OS界面平衡有利于这一步骤。虽然本方案采用的孵育时间与一般建议相符18，并与先前报道的界面张力测量结果7及我们的初步实验一致，但使用不同LS制备的GUVs可能受益于更长的孵育时间。

外层的形成还受到水滴穿过LS/OS界面速度的影响，这一步骤与三相的密度和黏度相关30。密度差异必须始终满足以下顺序：IS > OS > LS。这是必要的，以便IS液滴首先沉降至LS/OS界面，随后穿过该界面转化为GUVs，并进一步沉降至管底。尽管即使使用去离子水作为IS和OS时该过程也能自发进行23，但引入IS与OS之间的密度差异有助于促进GUV的形成31。最常用的组合是在IS中使用蔗糖，在OS中使用葡萄糖：在需要维持等渗浓度以防止渗透压应激损伤新生GUVs的条件下，蔗糖溶液的密度高于葡萄糖溶液。由于密度差异随这些溶液渗透浓度的增加而增大，GUV的产率也随之变化，在渗透浓度超过600 mOsm时未再观察到进一步提升13。

最佳离心条件与三相体系的密度、黏度以及磷脂的扩散性密切相关。在缺乏对三相体系进行全面表征的情况下，必须筛选多种条件。通过定性测试（图4E 和 图5）以及初步的系统性分析17，已可为本实验方案中所述的两个样品确定较为理想的离心条件；然而，若进一步筛选更多条件，样品质量仍有提升空间。当磷脂在轻相（LS）中的扩散性与三相体系的密度和黏度之间未能保持适当平衡时，磷脂将没有足够时间在轻相/油相（LS/OS）界面处达到平衡，并在水相液滴向油相移动过程中正确重排。这种情况常导致在界面处或界面下方形成白色沉淀物，该沉淀物可能由磷脂及其他油相分子组成，这些分子被未能在离心过程中成功组装成大单层囊泡（GUVs）的液滴拖拽所致。

均相溶液的包封可通过提高内相（IS）密度同时保持与外相（OS）的渗透平衡来实现（如蔗糖-葡萄糖体系），但微粒分散液的包封则要求水相的密度与微粒的密度相匹配32。货物包封效率还受到货物溶液或分散液化学组成的影响。先前的研究表明，多种碱金属卤化物33或pH值变化13会对GUV产率产生负面影响，这很可能是因为这些条件与磷脂分子中两性离子型亲水头部基团的净电荷发生相互作用或导致其电荷状态改变所致。因此，在包封生物反应（如酶促反应或无细胞蛋白合成）时通常需要权衡，因为pH值和盐浓度（如KCl或NaCl）必须调整至对反应本身而言并非最优的水平。尽管如此，即使是无细胞蛋白合成等复杂的反应混合物，也可经过适当调整以构建具有功能的基于GUV的人工细胞34。

从实际角度来看，尽管液滴转移法提供了一种非常直接的操作流程，但从油相（OS）中回收GUVs仍可能存在一些局限性。为了在离心步骤后更有效地去除上层油相，可以使用两个移液枪头进行更精细的移除（方案步骤3.1.1），或在制备多个样品时使用布氏漏斗以加快去除速度（方案步骤3.1.2）。然而，由于油相无法完全去除，因此必须进行洗涤步骤，以获得纯净的GUV分散液（方案步骤3.2）。尽管洗涤步骤能够有效去除残留的油滴，且GUVs的损失可忽略不计（图4A，B），但在使用高黏度油相时该操作可能较为困难，且当制备多种GUV配方时，该过程可能非常耗时。已有研究描述了一种替代方法，即跳过油相去除步骤，通过针头在管底打孔后从管底回收GUV35。然而，该方法若未在正确位置打孔，则可能导致GUV沉淀无法完全回收，此外还可能对操作人员造成潜在危害。

为了促进GUV的回收，我们在此介绍一种新的简单方法，可快速去除油相。该方法基于将上层密度较低的油相捕获在带盖的移液器吸头中，从而在离心后能够以不产生液滴的方式移除吸头。这种简单的策略可一次性快速、简便地去除整个油相，显著简化了这一耗时的步骤。

为了评估该方案的效率，已采用多种方法实现GUV的自动检测，以加快计数和粒径分布分析的速度。使用荧光探针对GUV进行标记，是一种简单且有效的策略，可应用于流式细胞术36,37以及结合圆环检测算法的显微成像技术13,37,38,39。近年来，基于人工智能的目标检测工具也正在被探索以进一步优化该过程40,41。然而，荧光染料可能会影响GUV的性质，从而在分析中引入人为假象。若排除可检测的荧光信号，显微镜观察仍是较为可靠的选择，其中相差显微镜因其能够实现最佳可视化效果18并适用于圆环检测算法38，成为首选方法。

此外，也可以利用特定配方的独特性质来实现独特的检测策略。例如，Hadorn 等人利用 IS 中存在的电解质，通过基于阻抗的细胞计数器检测 GUVs33。当这些自动化或针对特定配方的方法均不可行时，手动圈选注释仍是一种普遍适用的备用方法。在此类情况下，ImageJ 提供了一种实用工具，可加快处理速度，并轻松提取原始直径测量数据，具体操作如本方案所述。

尽管液滴转移法已被广泛采用，但对于新型GUV配方所需的优化过程却鲜有关注。在本研究中，我们收集了文献中可用的信息，制定了一套系统性方案，以指导并简化这一优化过程。本实用指南考虑了新型GUV配方制备过程中涉及的基本原理，以及获得油污染最少样品的方法——这一环节常被忽视13,14。虽然无法准确预测任何GUV配方所需的优化条件，但本指南提供了实用建议和深入见解，有助于加快新型GUV的构建，有望推动其在人工细胞和微机器人等领域的应用。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无竞争利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这些结果属于项目CELLOIDS（细胞启发的基于颗粒的智能微型机器人），该项目获得了欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划（资助协议号：948590）下的资助。本工作部分得到了欧洲委员会通过NextGenerationEU BRIEF项目的支持。我们感谢Michele Ibrahimi在搭建手套箱方面提供的技术支持，以及在设计便于去除油的容器过程中提出的有益讨论。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 µ混合纤维素酯膜  注射器滤器默克SLGSVR255F
1.5 mL 离心管生物分类06.0279.00
100 μL型玻璃注射器默克20737
150 mL 烧杯Avantor 213-1123至少 3
20 mL 棕色玻璃瓶 ND24Avantor 548-9001A
2 mL 离心管生物分类07.3534.99
50 mL 量筒Avantor 612-3843
500 μL型玻璃注射器Hamilton549-1166
50 mL Falcon管默克CLS352070
50 mL 注射器 Fisher Scientific8SS50L1
5 mL 离心管Greiner bio-one622201
600 mL 烧杯Avantor 213-1126
Bü陈氏烧瓶默克Z740682
用于圆底烧瓶的软木环Avantor 217-1000
结晶器Dutscher080474A
D-(+)-葡萄糖Sigma-AldrichG8270
D-(+)-蔗糖Sigma-AldrichS9378
数字温湿度计BohlenderV1863-07
DOPC阿凡提研究850375C
钻孔Dremel4000
二钠盐酸刺槐素（亮蓝FCF）Sigma-Aldrich861146
G18 注射器针头TerumoAN1838R1
G21 注射器针头TerumoAN2138R1
手套箱Bel-ArtF50030-0000如有条件，可使用手套箱，但在湿度较低的实验室中可能无需使用
加热磁力搅拌器LLG实验耗材6.263 448
轻质矿物油Sigma-Aldrich330779
新珊瑚红Sigma-Aldrich199737
丁腈橡胶O形圈，8 mm内径，12 mm外径RS196-4863
打开带有隔垫的ND24螺口盖Avantor 548-0031A
P1000 微量移液器Fisher Scientific12346132
P10000 微量移液器Avantor 89079-978
P200 移液器Fisher Scientific12326132
纸巾Avantor KIMB6657
ParafilmAvantor 291-1214
移液器吸头（1000）Eppendorf0030000919
移液器吸头（10000）Eppendorf0030000765
移液器吸头（200）Eppendorf0030000870
聚苯乙烯颗粒，1.1 µmSigma-AldrichLB11-1ML
橡胶帽Bioclass S.r.l.12.2300.05
橡胶锥形垫圈Avantor 217-0211
螺旋盖  ND24Avantor 548-0161A
硅油 AR20Sigma-Aldrich10836
硅胶管（内径 1.6 mm，外径 3 mm）RS667-8441
硅胶管（内径6 mm，外径12 mm）RS273-2541至少 6 m
三向连接处RS795-405
双通连接RS419-7287
双向阀Claber91280
超纯水赛默飞世尔科技 22934如有需要，可使用 Milli-Q 系统纯化的水替代本产品
通用剪刀博赫姆4154

参考文献

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