方法文章

利用光片荧光显微镜对再灌注急性心肌梗死中心脏损伤与免疫反应进行同步三维分析

DOI：

10.3791/68347

⸱

2025年9月26日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology and Vascular Medicine, West German Heart and Vascular Center, University Hospital Essen, 2Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG, 3Institute for Experimental Immunology and Imaging, University Hospital, University Duisburg-Essen

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

再灌注急性心肌梗死（repAMI）中心脏损伤的三维（3D）重建可实现对相关疾病影响模式的精确量化与共定位。本文提供了一种可自动化的光片引导成像方法，用于同时测量心脏损伤、风险区域以及免疫细胞反应。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

复杂细胞相互作用决定了再灌注急性心肌梗死（repAMI）期间功能性和结构性的组织重塑。这些过程表现出明显的空间分布特征，因为受损心肌可分为不同区域（损伤区、风险区（AAR）和远端区）。对这些区域进行三维（3D）可视化，对于分析常驻心肌细胞与浸润性免疫细胞之间的多种相互作用至关重要，有助于识别潜在的治疗靶点。本文介绍了一种可在repAMI后对心肌损伤区、AAR及浸润性免疫细胞（如中性粒细胞）进行同步且可自动化的3D可视化与定量分析的实验方案。该方案包括通过活体抗体介导标记心肌损伤区（CD31阴性）和中性粒细胞浸润（Ly6G+) 之后 离体 通过逆行抗体灌注可视化AAR，并结合无毒组织透明化技术用于光片荧光显微镜（LSFM）成像。该技术可实现对完整小鼠心脏中靶细胞（如浸润的免疫细胞）及损伤区域的空间分析，适用于心肌缺血再灌注损伤（repAMI）后的研究。在完成无毒组织透明化处理后，可进一步进行传统组织学和免疫组织化学分析，并结合计算机辅助的后期图像处理进行成像。该方法可在同一只小鼠心脏中实现多组信息的整合，提高数据的可靠性，对于repAMI这类高度复杂的损伤模型尤为重要。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

再灌注急性心肌梗死（repAMI）中的组织损伤是心脏重构和心力衰竭发展的主要驱动因素1。多种局部介质、心脏固有细胞以及浸润的免疫细胞通过复杂的相互作用共同影响组织损伤的扩展2,3。理解这些过程的空间组织对于深入认识再灌注后心肌损伤的机制、识别新的治疗靶点并改善心脏功能至关重要。

由于心肌本身由不同类型的细胞组成，因此对心脏损伤进行详细分析具有挑战性，因为每种细胞类型在缺血和再灌注损伤期间表现出各自特有的耐受能力4,5。在再灌注急性心肌梗死（repAMI）背景下，一个重要特征是血管系统显著丢失，并伴随内皮细胞功能恶化6。目前用于显示小鼠和人类血管结构以及分析内皮功能障碍的最成熟标志物是CD31（也称为PECAM-1），这是一种表达于内皮细胞表面的黏附分子7。在不同的缺血/再灌注模型中，CD31的丢失已被证明是区分内皮组织损伤的良好替代标志物8,9,10。此外，在repAMI过程中，整个心脏可区分出三个主要的损伤区域。未受缺血/再灌注（I/R）损伤影响的心脏组织称为远端区域。血管闭塞下游的心肌定义为风险区域（AAR）11,12。再灌注开始后，可在AAR内部进一步区分出一个明确的心肌组织区域，该区域因先前的缺血而受损（损伤区域）13。传统的小鼠心脏I/R损伤评估方法采用连续厚切片的氯化三苯基四氮唑（TTC）染色，以显示受损心肌细胞代谢活性降低13,14。同时，可结合ex vivo伊文思蓝染色以确定AAR15。然而，这些成熟的方法存在若干局限性，包括难以同时评估免疫细胞浸润、难以区分细胞类型特异性损伤，以及无法实现精确的三维组织重建。

光片荧光显微镜（LSFM）能够对经透明化处理的完整小鼠器官进行成像，其荧光信号分辨率可达细胞水平。近期，一种改进的无毒组织透明化方法被引入，利用肉桂酸乙酯（ECi）实现完整小鼠心脏的三维可视化8为克服TTC/伊文思蓝染色的局限性，采用活体抗体标记的CD31荧光染色法，显示心脏内皮损伤区域为无CD31染色（CD31缺失）的区域。阴性) 在再灌注急性心肌梗死期间8额外给药 离体 通过使用另一种荧光光谱的荧光标记抗CD31抗体进行逆行主动脉注射，可实现对AAR的活体染色及同步三维成像。此外，该方法可通过增加中性粒细胞染色进行拓展，从而分别分析远端区域、AAR及心肌内皮损伤体积中的细胞分布，有助于深入理解再灌注急性心肌梗死（repAMI）过程中中性粒细胞的功能。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有实验动物操作均经当地负责的政府机构批准（批准号：81-02.04.2023.A059 — 自然、环境与消费者保护局（LANUV）），并符合动物实验与研究相关的所有伦理规定。实验使用雄性C57BL/6J小鼠（9至30周龄）。动物饲养和使用均在当地动物房的特定病原体-free（SPF）条件下进行，光照周期为12小时光照/12小时黑暗循环。

注意：所有外科手术均在腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉诱导，并以异氟烷（1.5 Vol%）维持麻醉的条件下实施。为减轻动物痛苦，所有动物在麻醉前后当天均接受皮下注射0.1 mg/kg的丁丙诺啡，并在夜间提供含丁丙诺啡的饮用水。诱导再梗死性急性心肌梗死（repAMI）的手术方案此前已在其他文献中详细描述。16,17在开始体内抗体注射之前，准备两个用于此目的的6 cm培养皿 离体 在后续步骤中进行逆行抗体注射。需要一个盛有冰上PBS的浅培养皿，用于粗略去除心脏周围多余的组织（建议在培养皿中放置裁剪成合适大小的纱布片，以方便后续操作）。另一个培养皿用于主动脉插管，其中放置一根浸没在冰上PBS中的20 G钝头不锈钢插管针，插管切迹处预先套有5-0缝线松结。应避免或清除插管内的气泡，因为气泡可能阻塞冠状血管，导致灌注不完全。

1. 活体抗体注射

  1. 使用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）对小鼠进行麻醉。
  2. 通过尾静脉注射，将各10 µg直接标记的小鼠抗CD31抗体（克隆号：MEC13.3；荧光染料：AlexaFluor 790）和小鼠抗Ly6G抗体（克隆号：1A8；荧光染料：AlexaFluor 647）溶于PBS中，总注射体积为每克体重5 µL（例如20 g小鼠注射100 µL）。
    注意：该抗体注射可标记心脏内所有血管内皮，用于量化再灌注心肌梗死（repAMI）损伤范围。
  3. 注射抗体后，等待10分钟使其充分循环，再继续后续操作。

2. 心脏采集

注意：第 2 和第 3 部分具有严格的时间要求，必须在 6 分钟内完成。

  1. 注射抗体10分钟后，通过颈椎脱位法处死动物。通过评估反射确认死亡。
    注意：如果需要采集血样，应在进行下一步之前完成采样。
  2. 将小鼠置于体视显微镜下。
  3. 打开胸腔，并在上腔静脉从胸廓进入颈部的出口附近切开暴露的血管。
    注意：保持主动脉完整，因其后续步骤需要 离体 逆行性抗体注射
  4. 灌注心脏 原位 使用含肝素（20 IE/mL）的PBS，通过27 G针头和滚轴泵（70 µL/s），经左右心耳灌注，持续3分钟。心脏血液充分清除的表现为心表血管影逐渐消失，以及肺和肝脏变白。
    注意：避免通过右心室或左心室进行心脏灌注，因其可能在光片荧光显微镜成像过程中产生成像伪影。
  5. 切除心脏以及至少5 mm的残余主动脉，并连同周围肺组织一起取出。
    注意：切除过程中切勿直接抓握心肌组织，以免造成组织损伤，并避免在光片荧光显微镜成像过程中产生伪影。

3. 离体 逆行抗体注射

  1. 将心脏转移至预先准备好的含有冰冻 PBS 和纱布的 6 cm 培养皿中。
  2. 切除残留的周围肺组织、脂肪和血管组织，直至仅剩带有约 5 mm 主动脉的心脏。
  3. 将心脏转移至已准备好的培养皿中，用于主动脉插管。
  4. 将残留的主动脉套入 20 G 钝头不锈钢插管上，并用预先打结的 5-0 缝线在插管凹槽处结扎固定。
    注意：应将插管尖端推至靠近主动脉瓣的位置，以确保灌注液无泄漏。
  5. 使用 6-0 缝线在之前用于诱导再灌注急性心肌梗死（repAMI）的相同位置，永久性重新结扎左前降支动脉（LAD）。
  6. 通过插入的插管逆行注入 400 µL 含有 20 µg 小鼠抗 CD31 抗体（克隆：MEC13.3）的 PBS 溶液，该抗体标记有 AlexaFluor 546。
    注意：用封口膜封闭注射器与插入插管之间的连接处，以确保抗体通过冠状动脉完全灌注。该抗体注射仅会标记风险区（AAR）以外的内皮细胞，因此可用于风险区的定量分析。
  7. 从主动脉中拔出插入的插管。
  8. 将心脏转移至含有 10 mL 4% 多聚甲醛（PFA）的 15 mL 聚丙烯离心管中，在 4 °C 避光条件下静置孵育过夜。

4. 样品处理与透明化

  1. 在室温（RT）避光条件下，将固定的心脏置于5 mL聚丙烯反应管中，用5 mL PBS溶液洗涤三次，每次10分钟，始终以接近顶部旋转的方式轻轻振荡。
  2. 在室温（RT）避光条件下，将固定的心脏置于5 mL聚丙烯反应管中，依次使用50%、70%和100%的乙醇（溶剂为去离子水）进行梯度脱水，每步至少2小时，始终以接近顶部旋转的方式轻轻振荡。
    注意：50%和70%乙醇孵育时间可延长至次日，100%乙醇孵育时间可延长至3天。
  3. 将脱水后的心脏转移至15 mL聚丙烯反应管中，加入含5% DMSO和5% H2O2的10 mL 100%乙醇进行漂白处理，在4 °C避光条件下静置孵育4小时（不振荡）。
    注意：漂白过程中管内可能产生压力，后续打开管盖时需小心操作。
  4. 将漂白后的心脏置于5 mL聚丙烯反应管中，用5 mL 100%乙醇洗涤三次，每次12小时，室温（RT）避光条件下始终以接近顶部旋转的方式轻轻振荡。
    注意：每步孵育时间可延长至最多3天。
  5. 将心脏转移至含有4 mL肉桂酸乙酯（ECi）的5 mL聚丙烯反应管中，进行组织透明化处理，在室温（RT）避光条件下静置孵育3天（不振荡）。
    注意：透明化后的心脏在正确保存（室温避光）条件下，可在ECi中存放至少3个月而不出现荧光强度下降。请勿将ECi或存于ECi中的样品置于6 °C以下环境中，因ECi在此温度会冻结，从而损伤样品。

5. 凝胶多糖块的制备

  1. 将1 g结冷胶粉末加入100 mL加热的自来水（50–60 °C）中混合。
  2. 使用磁力搅拌器搅拌至完全溶解。
    注意：若粉末未能充分溶解，可将溶液在微波炉中加热至沸腾。
  3. 用100 µm细胞筛过滤结冷胶溶液。
  4. 将过滤后的溶液倒入浅底10 cm培养皿中。
  5. 静置冷却，直至凝胶完全固化。
  6. 将凝胶切成15 mm × 15 mm × 5 mm的块状。
  7. 将凝胶块置于50 mL聚丙烯反应管中，加入去离子水配制的50%和70%梯度乙醇溶液进行脱水处理，每步至少2小时，室温下持续近似顶部旋转振荡。
    注意：加入凝胶块后，需用乙醇充满反应管。凝胶块体积不得超过反应管容量的一半。
  8. 将脱水后的凝胶块在50 mL 100%乙醇中孵育，每次12小时，共三次，室温下持续近似顶部旋转振荡，使用同一50 mL聚丙烯反应管。
    注意：加入凝胶块后，需用乙醇充满反应管。凝胶块体积不得超过反应管容量的一半。脱水后的凝胶块可在最后一次含100%乙醇的反应管中长期保存，直至进行ECi透明处理。
  9. 将凝胶块转移至含有25 mL ECi的50 mL聚丙烯反应管中，室温下静置孵育3天，不进行振荡。
    注意：每个反应管中仅放入少量凝胶块，以避免透明过程中产生伪影。透明后的凝胶块可在ECi中保存至少6个月，室温储存即可。

6. 成像

  1. 将透明化的结冷胶块切割至所需大小，以在显微镜样品 holder 中稳定固定透明化的心脏组织。
    注意：结冷胶块可多次重复使用。
  2. 使用适当的激发和发射滤光片设置，检测目标荧光信号（自发荧光、AAR 染色 [与 AlexaFluor 546 标记的抗 CD31 抗体]、与 AlexaFluor647 偶联的抗 Ly6G 抗体以及 CD31neg 染色 [与 AlexaFluor 790 标记的抗 CD31 抗体]）。图像采集时，使用数值孔径为 0.1 的物镜，工作距离为 17.6 mm。
    注意：使用白光激光器（200 mW；480–2400 nm）进行信号检测。检测结缔组织来源的自发荧光时，采用 470/30 nm 带通激发滤光片和 525/50 nm 带通发射滤光片；检测与 AlexaFluor 546 偶联抗体标记的 CD31 染色时，使用 520/40 nm 带通激发滤光片和 585/40 nm 带通发射滤光片；检测与 AlexaFluor 647 偶联抗体标记的 Ly6G 染色时，使用 630/30 nm 带通激发滤光片和 680/30 nm 带通发射滤光片；检测与 AlexaFluor 790 偶联抗体标记的 CD31 染色时，使用 740/40 nm 带通激发滤光片和 824/55 nm 带通发射滤光片。照明时间与激光衰减百分比需根据信号质量进行调整。
  3. 选择以下设置进行光片显微成像：
    1. 选择光片数值孔径（sheet NA）为 0.079，由此产生的光片厚度为 5 µm。
    2. 选择相邻两个 z 层面之间的距离为 10 µm。
      注意：这会导致采样不足，进而影响轨迹追踪和体积测量的精度。为避免此问题，相邻两个 z 层面之间的距离应等于光片厚度的一半，即本例中应为 2.5 µm。本研究选择欠采样数据，因为成像时间缩短和数据堆栈体积减小所带来的优势超过了分析精度的轻微损失。
    3. 将光片宽度设为 100%，以实现样品的均匀照明。

7. 图像后期处理

注意：所获取的数字图像数据进一步使用下述列表中的科学三维图像处理与分析软件进行处理 材料表.

  1. 启动 Imaris 文件转换器 10.1 软件，通过将包含图像文件的文件夹拖放到 Imaris 文件转换器窗口中，或点击浏览并导航至包含图像文件的文件夹，将原始数据集加载到软件中。
  2. 通过选择文件夹来指定输出文件夹。
  3. 点击全部开始，等待文件被转换为 .ims 格式的 Imaris 文件。
  4. 启动软件，在左上角选择Surpass模式。
  5. 通过选择打开并选中相应的 .ims 数据文件，来加载图像堆栈。
  6. 为创建整个心脏的自动生成表面，选择3D 视图和表面功能。
  7. 在算法设置部分，选择仅分割感兴趣区域，最终处理整幅图像和对象-对象统计，同时禁用分类表面。
    注意：启用对象-对象统计可实现不同表面及斑点功能的叠加计算。
  8. 点击创建面板右下角的蓝色箭头按钮，进入下一步操作。
  9. 使用图像视图内出现的操作手柄，确定三维感兴趣区域。
  10. 进入下一步，选择源通道（自发荧光通道）。
  11. 启用平滑功能，并选择默认设置 11.8 µm。
  12. 进入下一步，确定用于生成视觉上满意的三维表面的阈值，该表面将显示在图像视图中。
  13. 在最后一步中，调整表面滤波器，选择体素数量作为滤波器类型，并将阈值设为 10。
  14. 点击创建部分右下角的绿色箭头按钮以生成表面。通过使用颜色面板，根据需要更改所创建表面的材质和颜色。
  15. 再次选择3D 视图和表面，手动创建另外两个表面：分别为 AAR（AlexaFluor 546 通道中的 CD31neg 体积）和心肌内皮损伤体积（AlexaFluor 790 通道中的 CD31neg 体积）。
  16. 在算法设置部分，选择仅分割感兴趣区域，最终处理整幅图像和对象-对象统计，同时禁用分类表面，然后点击跳过自动创建，手动编辑。
  17. 在面板面板中，选择XY作为方向，无作为可见性，并手动将分辨率控制器调整至最大。
  18. 进入模型面板，点击距离图标，并将顶点间距设为 100 µm。
  19. 启用绘制功能，并每隔 10 个图像切片，在 AlexaFluor 546 通道或 AlexaFluor 790 通道中圈出 CD31neg 区域。
  20. 完成所有相关区域的圈选后，选择自动拟合并点击执行自动拟合。
  21. 点击创建表面，并在颜色面板中调整所生成表面的材质和颜色。
  22. 为将中性粒细胞显示为 Ly6G+ 斑点，选择3D 视图和斑点功能以生成斑点分析。
  23. 在算法设置部分，选择仅分割感兴趣区域，最终处理整幅图像和对象-对象统计，同时禁用分类斑点。
  24. 使用创建面板右下角的蓝色箭头按钮，进入后续步骤。
  25. 如前所述，使用图像视图中出现的操作手柄确定三维感兴趣区域。
  26. 进入下一步，使用源通道（AlexaFluor 647 通道）。
  27. 将估计的 XY 直径设为 10 µm，启用沿 Z 轴建模 PSF 延伸，并将估计的 Z 直径设为 20 µm。
  28. 禁用背景减除。
  29. 进入下一步，选择强度最小值作为滤波器，并设置合适的阈值。
    注意：为估算阈值水平，点击程序窗口上方区域的切片，并选择 AlexaFluor 647 通道。将光标移至代表阳性 Ly6G 染色的原始图像切片中的不同斑点上，读取程序窗口左下角显示的强度值。
  30. 点击创建面板右下角的绿色箭头按钮以生成斑点。
  31. 在创建面板的点样式/质量部分，将半径比例设为 3.0。
  32. 进入颜色面板，根据需要调整斑点颜色。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

利用光片荧光显微镜（LSFM）的本方法可同时分析再灌注急性心肌梗死（repAMI）后的风险区面积（AAR）、内皮损伤及中性粒细胞浸润。图1A展示了repAMI诱导后24小时C57BL/6J小鼠的活体及ex vivo抗体染色情况。在处死前10分钟，通过静脉注射针对心肌内皮损伤（AlexaFluor 790标记的抗CD31抗体）和中性粒细胞浸润（AlexaFluor 647标记的抗Ly6G抗体）的抗体。在充分清除血液后，通过逆行主动脉灌注AlexaFluor 546标记的抗CD31抗体对AAR进行染色，并将心脏在4 °C条件下用4%多聚甲醛（PFA）固定过夜。图1B进一步说明了用于LSFM成像的组织处理流程。固定后，心脏依次经梯度乙醇脱水，并使用过氧化氢和二甲基亚砜进行漂白以降低组织自发荧光。最后，使用ECi对完全脱水的组织进行折射率匹配，从而实现全器官LSFM成像。图1C展示了利用透明化的结冷胶块以增强器官稳定性，将透明化后的心脏正确放置于样品...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在小鼠再灌注急性心肌梗死（repAMI）期间，有多种成像方法可用于检测心肌组织损伤。这些技术各有优势，但也存在局限性。利用氯化三苯基四氮唑（TTC）染色检测心肌细胞代谢活性降低是最常用于量化心肌缺血/再灌注（I/R）损伤的方法，可与伊文思蓝（Evan's blue）染色结合使用，以区分风险区（AAR）13,14,15这是一种快速且经济高效的方法，但由于需要制备连续的组织切片，因此在精确的三维重建方面存在局限性。这一限制同样适用于心脏组织损伤的传统组织学方法，例如苏木精-伊红染色或戈莫里三色染色，这些方法虽可实现更高空间成像分辨率的分析18,19另一方面，再灌注急性心肌梗死（repAMI）期间的组织损伤可通过磁共振成像（MRI）进行评估12,

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elias Haj-Yehia 报告从阿斯利康（AstraZeneca）获得的个人酬金及其他报酬，这些利益关系与本提交的研究无关。Simon F. Merz 和 Lea Bornemann 目前受雇于 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG。Matthias Totzeck 和 Tienush Rassaf 报告从 Edwards 和 Novartis、Bristol Myers Squibb、拜耳（Bayer）、第一三共（Daiichi Sankyo）以及阿斯利康（Astra Zeneca）获得的个人酬金及其他报酬，这些利益关系与本提交的研究无关。Tienush Rassaf 和 Ulrike B. Hendgen-Cotta 共同创立了 Bimyo 公司，该公司致力于心脏保护肽的开发。Matthias Gunzer 收到了来自 Miltenyi BioTec B.V. & Co. KG 的常规研究资助。其余所有作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢以下资助来源：德国研究基金会（UMEA 临床科学家项目，FU 356/12-2，Elias Haj-Yehia；HE6317/2-1，Ulrike Hendgen-Cotta；RA969/12-1，Tienush Rassaf）以及德国心脏病学会（DGK，Deutsche Gesellschaft für Kardiologie - Herz- und Kreislaufforschung e.V.，DGK02/2022，Elias Haj-Yehia）。部分研究工作在德国杜伊斯堡-埃森大学医学院影像中心埃森（IMCES）完成，该中心为医学院下属公共服务核心设施。我们感谢 IMCES 工作人员提供的持续技术支持及其仪器设备的使用许可。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
27 G 针头Becton Dickinson305889BD Eclipse
三维图像处理 &和分析软件Bitplane版本 10.1.0Imaris
5-0 缝合线Serag-WiessnerIC108000丝蛋白
6-0 缝合线EthiconEH7814Prolene
AlexaFluor 546 抗体标记试剂盒InvitrogenA20183
AlexaFluor 790 抗体标记试剂盒InvitrogenA20189
抗小鼠 Ly6G 抗体（AlexaFluor 647）Biolegend127610克隆：1A8
细胞滤网（100 µm)康宁431752
二甲基亚砜（DMSO）卡尔·罗斯7029.1
乙醇卡尔·罗特0911.4
肉桂酸乙酯（ECi）Sigma-Aldrich112372
文件转换软件Bitplane版本 10.1.0Imaris
纱布Fuhrmann10021
结冷胶粉末Sigma-AldrichP8169Phytagel
肝素（25,000 IE/5 mL）LEO Pharma15261203
过氧化氢（H₂O₂）2O2, 30%)卡尔·罗特8070.2
注射器B Braun9161502SOmnican F
氯胺酮（100 mg/mL）bela-pharma402581.00.00
光片显微镜系统Miltenyi Biotec-UltraMicroscope Blaze
鲁尔锁式注射器Becton Dickinson303172BD Plastipak
磁力搅拌器VWR444-0572
Neo sCMOS 相机（4.2 MP）Andor TechnologyZL41 细胞 4.2
目标Miltenyi Biotec130-133-625MI Plan 1.1x NA 0.1，WD 17.6 mm
多聚甲醛（PFA，4%）Sigma-Aldrich1.0049610% 甲醛，中性缓冲液
培养皿Greiner Bio-One632181
磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco14190-094不含 MgCl₂2/CaCl2
聚丙烯管（15 mL）Greiner Bio-One188261
聚丙烯管（5 mL）卡尔·罗斯EKY9.1黑色
聚丙烯管（50 mL）Greiner Bio-One227261
小鼠心脏插管准备皿Hugo Sachs Elektronik73-4327包含套管针
纯化的抗小鼠 CD31 抗体Becton Dickinson53369克隆：MEC13.3
滚轴泵IsmatecISM597-230
封口膜贝米斯PM-996Parafilm
体视显微镜LeicaS6D
试管旋转仪HeidolphPolymax 1040
白光激光器NKT PhotonicsSuperK extreme200 mW，480–2400 nm
野生型小鼠品系Janvier Labs-C57BL/6JRj
赛拉嗪（2%）Ceva 动物保健6324464.00.00

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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