方法文章

使用嘧氧甲烷和葡聚糖硫酸钠诱导结肠炎相关结肠癌的优化小鼠模型，用于肿瘤免疫学和治疗研究

DOI：

10.3791/68351

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2025年7月25日

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1Department of Pharmacology and Therapeutics, University of Florida College of Medicine, 2Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida College of Medicine, 3Department of Immunology, H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute, 4University of Florida Health Cancer Center

本文内容

摘要

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嘧啶甲烷 （AOM）/葡聚糖硫酸钠 （DSS） 诱导的结肠炎相关结肠癌是一种成熟且具有成本效益的小鼠大肠本土肿瘤建模方法。我们提出了更新的方案，并讨论了性别特异性 DSS 剂量优化的关键考虑因素以及微生物组对严谨性、稳健性和可重复性的贡献。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

嘧啶甲烷（AOM，一种DNA损伤剂）和葡聚糖硫酸钠（DSS，一种结肠炎促进剂）可以诱导小鼠大肠肿瘤，外显率高。AOM/DSS 诱导的小鼠结肠炎相关结肠癌 （CAC） 模型是研究炎症相关结肠癌的黄金标准，因为它在概括人类 CAC 临床特征方面的准确性。该模型的优点包括其起源和发展自内源性组织、保留完整肿瘤-免疫相互作用的免疫能力、对多种小鼠品系的适应性、3 个月潜伏期的便利性以及相对较低的成本。尽管有这些优点，但仍存在一些挑战限制了该协议的有效性。不同研究中 DSS 剂量和肿瘤外显率的差异导致观察结果不一致。此外，肠道微生物群的变化会导致实验变异性增加，从而对统计能力产生负面影响。对 AOM/DSS 反应的性别差异使结果的解释进一步复杂化。此外，DSS批次间变异性阻碍了结果的可重复性。应对这些挑战对于提高该模型在临床前研究中的可靠性和适用性至关重要。为了解决这个问题，我们以C57BL / 6J小鼠为模型，通过有效优化策略完善了已建立的方案，以增强研究之间的可重复性和协调性。其中包括对雄性和雌性小鼠的 DSS 剂量滴定的建议，在每个 DSS 周期之前实施微生物群均质化以减轻笼子到笼子肠道菌群的异质性。这些步骤显着降低了变异性并提高了可重复性，从而实现了 CAC 的稳健诱导。认识到炎症和细胞免疫机制在 CAC 发展中的关键作用，该协议还描述了适用于分离 RNA 或蛋白质以及分析结肠肿瘤和周围结肠组织的炎症细胞因子的组织处理程序。最终，使用这种方法可确保更严格、稳健和可重复的 CAC 生产。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

结直肠癌 （CRC） 是全球第三大常见癌症，也是癌症相关死亡的主要原因 1,2。与散发性CRC相比，结肠炎相关结直肠癌（CAC）是炎症性肠病（IBD）患者长期、反复的肠道损伤的结果3,4，其特征是恶性级别较高，年轻时有多灶性表现的趋势。由于这些因素，CAC 通常需要更积极的治疗，但临床结果不太好5。尽管 CAC 被认为是一个独特的实体，至少部分是由于突变获得的独特时间以及炎症免疫机制和微生物组的巨大作用，但 CAC 和散发性 CRC 在整体基因组景观和发病特征方面有许多相似之处。为了增进我们对 CRC 特别是 CAC 的理解，并改进治疗策略，稳健的临床前模型至关重要。

在用于研究CRC的各种模型中，AOM/DSS诱导的CAC模型采用最广泛，被认为是当前的金标准6,7。该模型以 AOM 提供的强烈致突变损伤开始，依赖于 DSS 诱导的重复发作结肠炎，这些结肠炎与人类 IBD 非常相似，例如克罗恩病和溃疡性结肠炎，这些都是 CAC8 的公认危险因素。与其他体内方法相比，AOM/DSS 模型具有几个关键优势。与依靠注射外源性癌症起始材料建立侧翼甚至原位肿瘤的方法不同，AOM/DSS 诱导的 CAC 是本土的，这意味着肿瘤发生在内源性，癌症进展在天然组织微环境中展开，更密切地反映了其生物学和自然病程。与只能在免疫功能低下的小鼠中生长的人类细胞系或患者来源材料的异种移植物不同，它具有免疫功能，能够研究癌症-免疫相互作用。与产生具有特定遗传驱动因素的肿瘤的基因工程模型不同，它与预定义的突变无关，允许对癌症信号通路和免疫教育机制进行更广泛的建模。最后，AOM/DSS 模型可以很容易地适应许多不同的小鼠品系，无需冗长的育种方案，从而使其既省时又省钱。然而，动物性别、DSS 剂量和肠道微生物群差异等因素可能会引入变异性，影响可重复性并使其在转化研究中的应用复杂化。

我们的目标是完善该协议，以减轻这些因素的影响，这些因素支撑结肠炎症和 CAC 肿瘤发生程度的不一致。用于诱发急性炎症、结肠炎或慢性炎症的 DSS 浓度以及 CAC 9,10 存在显着差异。DSS 是一种聚合物，平均分子量可能因批次和制造商而异，从而影响实验结果的差异。因此，必须对每批 DSS 进行测试，以确保研究之间的一致性。此外，DSS诱导的炎症程度受肠道微生物组的高度影响，肠道微生物组在世界各地的小鼠设施之间可能存在显着差异，甚至在同一机构内的不同保存位置和菌落之间11,12。微生物组成的这种变异性会影响模型的结果，并导致结果不一致13。只要有可能，将来自不同实验组的动物共同饲养对于减少变异性至关重要，但可能不足以解决这种混杂因素，因为微生物群落会随着时间的推移经历随机漂移并导致慢性炎症模型中的笼子效应14。由于AOM / DSS方案涉及维持慢性炎症的长期治疗，因此我们通过定期混合饲养AOM / DSS处理动物的所有笼子中的垫料来实施微生物群均质化。这种做法有助于微生物群环境均质化，从而减少实验变异性。此外，观察表明，DSS 的影响可能因动物性别而异15,16，可能导致炎症和癌症发展的不同反应。我们通过分别滴定雌性和雄性小鼠的DSS来完善现有方案，为两性选择合适的DSS剂量，确保更均匀的结果，并为统计功效计算提供关键输入，以确定雄性和雌性小鼠的最佳样本量。

总体而言，为了增强 AOM/DSS 模型的可重复性，我们概述了一套标准化的协议指南，以考虑和减轻这些混杂因素。我们采用微生物组均质化技术，并描述精确的 DSS 剂量调整，以获得更一致和可重复的结果，从而提高 AOM/DSS 模型的实用性和不同研究之间的协调。我们的方案突出显示，微生物群均质笼的变异性降低，并为实施这些可重复性实践提供了清晰的分步说明。因此，这些方案改进所影响的较低组内变异性导致在检测实验组之间差异时实现所需统计功效所需的样本量减少。该优化方案专为旨在使AOM/DSS模型适应自己的小鼠模型和实验设计的研究人员量身定制，无论菌株或性别背景如何，以研究肿瘤发生机制，治疗靶点或探索免疫细胞动力学。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有动物程序都必须按照机构批准的协议进行，以确保人道处理和遵守道德标准。此处描述的研究已获得佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。

1. DSS剂量的优化

  1. 获得用于主要实验的年龄、品系和来源的小鼠，雄性和雌性分布相等。通过打耳器、尾巴标记或其他经批准的单独跟踪方法标记每只鼠标。测量并记录每只动物的初始体重。
    注意：雄性小鼠应在断奶前共同饲养，不应在笼子之间重新分配，以尽量减少战斗。
  2. 如果使用自动浇水，请在开始实验前一周将动物换成水瓶，并同时用无菌塞堵住笼子喷嘴（笼子中的金属吸管）。
    注意： 确保对供水的任何更改，例如自动饮用水喷嘴堵塞，都得到 IACUC 或监督动物人道使用的适当监管机构的批准。动物笼子可能需要每天检查，以确保不间断地获得饮用水。
  3. 使用磁力搅拌棒和搅拌板将DSS溶解在高压灭菌的无菌饮用水中，浓度为1.5%至5%（w/v），制备DSS溶液。在室温下等待 30 分钟，使 DSS 粉末完全溶解在水中。每周新鲜准备DSS水，并在4°C下储存长达一周。
  4. 用每种浓度的DSS水填充两个50mL锥形管（一个用于男性，一个用于女性），并牢固地连接一个高压灭菌的无菌饮水喷嘴以防止泄漏。
  5. 对雌性和雄性小鼠施用每种浓度的DSS水，每个笼子中的3只小鼠接受相同的浓度。使用不含 DSS 的无菌饮用水作为阴性对照。每隔一天更换一次 DSS 水。
  6. 施用 DSS 水 7 天。每天记录每只小鼠的体重。
  7. 在第 8 天，将所有动物换回正常饮用水。
  8. 在第 8 天，使用标准化评分系统根据粪便稠度评估腹泻的严重程度，如所述17 并记录分数。得分“1”为柔软但仍形成的粪便颗粒，“2”为非常软的粪便颗粒，“3”为腹泻。
  9. 在第 8 天，收集 2-3 个新鲜粪便颗粒并评估潜血的存在（参见 材料表）。记录样本中是否存在血液。
  10. 根据大便稠度 （0-3） 和便血 （0-3） 两个评分标准的组合评估肠道出血，总分范围为 0 到 6。
  11. 从第9天到第12天，每天记录每只小鼠的体重，并密切监测DSS处理的动物体重是否显着减轻和严重腹泻。根据经批准的动物使用协议和既定的伦理准则，通过二氧化碳 （CO2） 窒息或其他适当的方法，立即对达到或超过人道终点的动物实施安乐死。
  12. 从第 13 天到第 18 天，继续监测动物并每天记录每只小鼠的体重，直到完全恢复到实验前水平。
  13. 确定最佳 DSS 浓度，因为这会导致大约 20% 的体重减轻，并伴有柔软但仍然形成的粪便。最佳 DSS 剂量可能因雄性和雌性、小鼠品系、年龄、DSS 批次和动物设施而异。

2. CAC诱导

  1. 第 0-6 天：AOM 治疗 第 7-28 天：DSS 治疗的第 1 个周期
    1. AOM原液制备：将AOM粉末溶解在无菌盐水中，使原液浓度达到10mg/mL。通过0.45μm过滤器过滤溶液，将1mL等分试样分配到1.5mL微量离心管中，并在-80°C下储存长达一年。
      注意：AOM 是一种挥发性致癌物，必须按照制造商的安全建议，在带有适当个人防护装备 （PPE） 的生物安全罩下小心处理。AOM 和任何受 AOM 污染的材料应根据该机构的危险化学废物处置协议进行处置。研究者有责任提前获得必要的环境健康和安全批准。
    2. 如果使用自动笼式浇水，则在实验开始前1周，阻塞自动饮用水喷嘴并将动物切换到水瓶中以适应，如步骤1.2所示。
    3. 在第 0 天，称重并记录每只小鼠的体重，以计算所需的 AOM 总量。然后根据每只动物的体重计算AOM的总体积（1mg / mL最终工作浓度），以达到10mg / kg的剂量，例如，20g小鼠为200μL。
    4. 每次使用前，在冰上解冻所需数量的 10 mg/mL AOM 新等分试样。用 9 mL 无菌盐水稀释每个 1 mL 等分试样的 AOM，以达到 1 mg/mL 的工作浓度。
    5. 通过腹膜注射给小鼠施用AOM。在生物安全柜内执行此程序，同时佩戴适当的个人防护装备，例如双层手套和 N95 口罩，以获得最佳保护。
      注意： 根据危险化学废物处理要求丢弃任何剩余的 AOM 溶液。
    6. 在第3天，将AOM处理的动物转移到干净的笼子中。处理受 AOM 污染的笼子和其他材料时，请穿戴适当的个人防护装备进行保护。
      注意：根据机构批准的危险化学废物处理程序处理脏污的笼子床上用品和任何剩余食物。
      注意：AOM及其代谢物在给药18后72小时完全排出，此时可以处理脏污的笼子垫料。
    7. 在第 7 天，进行肠道微生物群均质化，以尽量减少笼子之间的变异性。为此，请从每个笼子中取样 25% 的垫料，彻底混合，然后将其重新分配回每个笼子中。
      注意：在 DSS 治疗的一周内和之后的五天内不要更换笼子。必要时与设施的饲养笼更换服务协调。
    8. 通过使用配备合适喷嘴的 50 mL 锥形管在饮用水中提供 DSS 来启动结肠炎诱导。每天检查小鼠，以确认动物可以不受限制地获得 DSS 水。每隔一天更换一次 DSS 水。每天记录每只小鼠的体重。
    9. 在第 14 天，用普通饮用水瓶代替 DSS 水。继续密切监测动物的疼痛和痛苦。
    10. 在第 14-19 天，每天称重每只小鼠。对体重减轻超过 25% 的动物实施安乐死，或者如果动物达到批准的动物护理和使用协议中概述的任何人道终点。此外，监测并记录任何直肠出血的情况。
  2. 第 7-28 天：DSS 治疗的第 1 个周期
    1. 在第 7 天，进行肠道微生物群均质化，以尽量减少笼子之间的变异性。为此，请从每个笼子中取样 25% 的垫料，彻底混合，然后将其重新分配回每个笼子中。
      注意：在 DSS 治疗的一周内和之后的五天内不要更换笼子。必要时与设施的饲养笼更换服务协调。
    2. 通过使用配备合适喷嘴的 50 mL 锥形管在饮用水中提供 DSS 来启动结肠炎诱导。每天检查小鼠，以确认动物可以不受限制地获得 DSS 水。每隔一天更换一次 DSS 水。每天记录每只小鼠的体重。
    3. 在第 14 天，用普通饮用水瓶代替 DSS 水。继续密切监测动物的疼痛和痛苦。
    4. 在第 14-19 天，每天称重每只小鼠。对体重减轻超过 25% 的动物实施安乐死，或者如果动物达到批准的动物护理和使用协议中概述的任何人道终点。此外，监测并记录任何直肠出血的情况。
  3. 第 29-49 天：DSS 治疗的 第 2 个 周期
    1. 重复微生物群均质化以及 DSS 给药，遵循与步骤 2.2.1-2.2.4 相同的程序。可选：在第二个和/或第三个 DSS 周期之后，如前所述进行结肠镜检查19。
  4. 第 50-70 天：DSS 治疗的第 3 个 周期
    1. 重复微生物群均质化以及 DSS 给药，遵循与步骤 2.2.1-2.2.4 相同的程序。由于小鼠在第三个 DSS 周期后三天往往体重减轻最多，因此在此期间密切监测所有动物的体重是否过度减轻或任何直肠出血迹象，并在有指征时提供湿润的食物以进行支持性护理。

3. 结肠炎严重程度和 CAC 大体病理的评估

  1. 在第 70 天，从每只小鼠收集 2-3 个新鲜粪便颗粒，以测试是否存在潜血和/或炎症标志物，例如脂质运载蛋白2 20 ，以评估结肠炎的严重程度。使用适当的试剂/试剂盒（参见材料和设备列表）并按照制造商的说明进行测定，简要概述如下。
  2. 为了制备粪便样本以评估炎症标志物脂运载蛋白-2水平，请将新鲜粪便颗粒放入1.5mL微量离心管中。使用涡旋混合器将沉淀溶解在 1 mL 无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中，直至获得均匀的溶液。将溶液在 4°C 下以 10,000 x g 离心 10 分钟。 上清液可立即用于脂质运载蛋白-2 ELISA，或储存在-80°C以备后用。
  3. 根据试剂盒制造商的说明执行小鼠脂质运载蛋白-2 ELISA。运行试点连续稀释实验，以确定粪便样品相对于标准品的最佳稀释度。
    注意：与水处理的对照动物相比，DSS处理的小鼠的脂钙蛋白-2水平预计至少增加1000倍20。
  4. 使用腹泻评分系统17 评估结肠炎的严重程度，如步骤 1.8-1.10 中所述。
  5. 在第 70 天，通过 CO2 窒息或使用任何其他经批准的人道方法对动物实施安乐死。
  6. 用70%乙醇喷洒每只动物的腹部区域，以尽量减少后续步骤中的污染。
  7. 使用细手术镊子提起皮肤和腹膜层。用剪刀做一个水平切口，露出腹腔。
  8. 将小肠拉到外面并识别盲肠。用镊子轻轻提起盲肠和结肠。用剪刀切开肠系膜和相关脉管系统，小心地解剖结肠，避免刺穿或切开结肠。
  9. 切开骨盆骨和直肠肛门区域周围的皮肤，露出完整的远端结肠。在远端完整的情况下解剖整个结肠非常重要，因为大多数肿瘤通常发生在该区域。
  10. 将解剖后的结肠放在干净的滤纸上，轻轻拉直。
  11. 用尺子测量结肠长度并用照片记录下来。在照片中包括尺子以获得比例。
  12. 清洁结肠外部的派尔氏斑，注意不要刺穿组织。
  13. 用冷无菌PBS冲洗结肠。
  14. 使用石蜡薄膜将 200 μL 微量移液器吸头（不带过滤器）固定到 3 mL 注射器上。使用此设置用无菌 PBS 填充注射器，将移液器吸头插入结肠腔，轻轻冲洗结肠内容物 2-3 次，确保完全清除粪便颗粒。
  15. 在干净、预先润湿的滤纸上轻轻拉伸结肠。纵向切开结肠，平放在滤纸上。
  16. 识别较大的肿瘤，这些肿瘤通常表现为从结肠壁突出的突出水泡，外观发炎，呈红色。
  17. 对于较小的肿瘤，在鉴定过程中要格外小心。利用无菌细菌播种环轻轻探测结肠表面是否有任何不规则或凸起。确认任何检测到的肿块都不是位于结肠壁外侧的淋巴结或血管的残余物。
  18. 使用数字卡尺测量每个肿瘤的宽度和长度。
  19. 在预先打印的结肠图上记录肿瘤计数以及每个肿瘤的大小和位置。

4. 组织学评估

  1. 使用两对细头镊子抓住远端结肠的两侧端。将结肠从远端滚动到近端，如其他地方所述21。确保远端位于卷的中心，近端形成最外层。
  2. 使用 271/2-G 针固定每个瑞士卷结肠。
  3. 将每个固定的瑞士卷结肠放入适当标记的组织盒中。
  4. 将含有瑞士卷结肠的组织盒浸入无菌PBS中的4%多聚甲醛（PFA）中。让组织在固定剂中停留24小时。
  5. 24小时后，将组织转移到70%乙醇中。组织可以在4°C的70%乙醇中保存长达三个月。
  6. Swiss-roll 可用于多种组织病理学检查，包括常规苏木精和伊红 （H&E） 染色、免疫组织化学和免疫荧光。

5. 组织采集，用于从肿瘤和周围结肠中分离蛋白质和 RNA

  1. 在冰上工作并使用预冷管和试剂来保持生物材料的完整性。
  2. 肿瘤评估后，解剖肿瘤并收集到预冷、预标记的管中，并带有适当的缓冲液（见下文）在冰上。根据实验设计，汇集来自同一动物的所有肿瘤或单独处理它们。如果需要，同样收集~1厘米周围的非肿瘤结肠组织碎片。
  3. 蛋白质分离
    1. 将 0.5 mL 的 800 μm 研磨玻璃珠和 400 μL 裂解缓冲液（1% NP-40 溶于 150 mM NaCl 和 20 mM Tris-HCl （pH 7.5） 和 1% 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物加入每个组织均质管中，并将结肠/肿瘤组织转移到每个管中。
    2. 使用基于珠子的组织均质器以 6 M/S 的速度均质结肠/肿瘤组织 30 秒，重复两次以完全均质化。
      注意：在循环之间将试管放在冰上，以防止样品因机械均质而过热。
    3. 均质化后，吸出 150 μL 裂解物（上清液）并转移到干净的 1.5 mL 微量离心管中。
    4. 在4°C下以10,000 g 旋转裂解物以沉淀任何不溶性物质。如果需要，将上清液转移到干净的管中。
    5. 通过二辛可宁酸 （BCA） 测定或其他适当的方法量化总蛋白浓度。
    6. 如果需要，使用相同的裂解缓冲液将每个样品的总蛋白质浓度调整为 4 mg/mL。
    7. 立即将蛋白质裂解物用于下游测定，例如免疫印迹或细胞因子分析，或储存在 -80 °C 以备后用。
  4. RNA纯化：
    1. 解剖后，将结肠/肿瘤放入1.5mL微量离心管中，并浸入200μL适当的RNA保存试剂中。
      注意：暂停点：新鲜结肠/肿瘤组织可以在液氮中速冻并储存在-80°C以备后期处理
    2. 在冰上解冻结肠/肿瘤组织。
    3. 将结肠/肿瘤转移到含有 500 μL 适合 RNA 分离的适当裂解缓冲液和 200 μL 研磨玻璃珠的组织均质管中。
    4. 使用基于珠子的组织均质器以6M / S的速度匀质30秒3次，每个循环之间休息两分钟。
      注意：在循环之间将试管转移到冰上，以防止在机械均质化过程中因过热而降解 RNA。
    5. 将 300 μL 裂解物转移到新的 1.5 mL 微量离心管中。
    6. 必要时使用适当的 RNA 纯化程序分离总 RNA。测量 RNA 浓度、纯度和质量/完整性，适合下游使用。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们针对我们的实验条件进行了 DSS 剂量优化。需要针对每个动物设施、小鼠品系、研究设计和 DSS 批次重新校准 DSS 剂量。在这项研究中，将C57BL / 6J小鼠饲养在通风笼中的特定无病原体动物饲养箱中，并随意使用标准辐照的18%蛋白质啮齿动物饮食。雄性和雌性小鼠在置于DSS水后从第5天开始体重减轻，在DSS停药后三天达到最低体重（图1A，C）。在体重减轻最大当天，雄性小鼠体重减轻约15%，而雌性小鼠体重减轻约20%（图1B，D）。基于这些结果，我们确定了特定实验条件的最佳剂量为女性 3.0% 和男性 3.25%。AOM/DSS的治疗方案如图2A所示，微生物组均质化发生在每个DSS治疗周期开始时，直到实验结束，以减轻笼子效应和变异性。整个实验期间动物体重减轻和恢复的典型动态如图2B所示。动物在停止DSS给药后两周内完全恢复到原始体重。经过良好校准的 DSS 结肠炎模型会导致柔软但仍形成的粪便颗粒而不是腹泻（粪便稠度评分 1-2），偶尔在粪便中检测到潜血表明亚临床出血，并且很少有粪便中可见血液的病例（血液存在评分 1-2）17。为了进一步评估结肠炎的严重程度，收集粪便样本以分析炎症标志物脂质运载蛋白 2 水平。与DSS处理的动物不同，在整个实验过程中接受常规饮用水的小鼠中未检测到潜血的存在（图2C）。与仅用水的对照相比，AOM/DSS处理的小鼠的脂质运载蛋白-2水平始终升高约1,000倍（图2D）。

在终点，我们解剖结肠并使用肿瘤记录图对肿瘤进行计数（图3A）。与AOM /纯水对照不同，DSS结肠炎导致结肠长度显着缩短（图3B）。此外，AOM / DSS处理的动物会出现可见的结肠肿瘤，其中大部分形成于远端（图3C）。H&E染色结肠切片的组织学检查显示AOM / DSS小鼠有明显的上皮细胞侵蚀，免疫浸润和溃疡（图4A）。结肠组织病理学的严重程度可以使用DSS诱导的小鼠CAC的已建立评分系统进行量化，基于四个参数（图4B）：免疫浸润和水肿（0-3），溃疡（0-3），结肠上皮形态（0-4）和肿瘤（0-4）22,23,24。应用于图4A中组织学示例的此类评估结果如图4C所示。通过使用Ki67染色的免疫组织化学分析评估结肠上皮增殖，表明DSS治疗促进结肠上皮细胞的增殖。此外，结肠切片可用于各种标志物的免疫荧光染色，例如血管生成标志物CD31（图4D，E）。

我们进一步评估了微生物群均质化对实验终点的影响，例如每只动物的结肠炎症程度、体重减轻和累积肿瘤负荷。一组小鼠被饲养在笼子中，在第 0 天对脏的垫料进行混合和重新分配，以实现微生物群均质化，与对照动物一起被饲养在笼子中，其中省略了这种作。两组动物均接受2.5%的DSS水，持续7天。虽然第 8 天每个笼子粪便中炎症标志物脂质运载蛋白 2 的平均水平在组间没有显着差异（韦尔奇的 t 检验），但我们观察到在经历微生物群均质化的笼子中数据点之间的变异性显着降低（图 5A，韦尔奇比较方差的 F 检验， p<0.0001）。一致地，到第 8 天，与第 0 天基线相比，所有动物的体重减轻程度相似。然而，与对照组相比，微生物群均质化组中的小鼠在体重减轻方面表现出较小的变异性（图5B）。此外，在为期10周的CAC诱导方案（图2A）中，在每个DSS周期之前有（微生物群均质化）和没有（对照）笼式垫料混合，与可变性明显更大的对照相比，微生物群均质组中每只小鼠的累积肿瘤负荷更一致（图5C）。总体而言，这些数据提供了强有力的证据，表明微生物群均质化极大地提高了AOM/DSS模型的稳健性和可重复性。

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图 1.雄性和雌性小鼠的 DSS 剂量滴定。（A-D）维持在指定DSS浓度（1%、1.5%、2%、2.5%、3%）的水中的14周龄雄性（A，B）和雌性（C，D）C57BL / 6J野生型小鼠与第0天相比的体重变化百分比（雄性为1%，1.5%，2%，2.5%，雌性为2%，3%，4%）。（A、C）对动物施用 DSS 7 天，并监测体重减轻长达 12 天。B和D显示雄性小鼠在DSS治疗开始后的第8天（B）和第9天（D）的雌性小鼠体重减轻。数据以 SEM ±平均值表示;在 A & B 中为 n=3，在 C & D 中为 n=4。请点击此处查看此图的大图。

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图 2.AOM/DSS 引起的 CAC 时间表和监控。 （A）AOM/DSS诱导的CAC实验时间表。（B）实验性AOM / DSS处理（红色）或对照（仅AOM，无DSS，黑色）雌性C57BL / 6J野生型小鼠相对于第0天的体重。所有动物都接受一剂AOM（10mg / kg），并随机分配到三个周期的3%DSS（红色）或正常饮用水（对照，黑色），总共70天。数据以 SEM ±平均值表示， n=2 和 11。（C）来自对照（仅AOM）或DSS处理（AOM和1.5%DSS）雌性小鼠的粪便造血试验。（D）第70天6只对照（仅AOM，黑色）或35只处理（AOM和1.5%DSS，红色）雌性小鼠的粪便脂质运载蛋白-2水平。数据以 SEM ±平均值形式呈现。 请点击此处查看此图的大图。

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图 3.结肠的宏观评估。（A） 肿瘤记录图示例。（B）第70天来自对照（仅AOM）或DSS处理（AOM和1.5%DSS）雌性小鼠的代表性结肠图片。结肠长度缩短表明 DSS 治疗的动物炎症较大。杆 - 5 毫米;，p=0.002，Mann-Whitney秩和检验;n=12 & 30。（C）用AOM和3%DSS治疗的雌性小鼠在第70天结肠有肿瘤的代表性大体病理图片（肿瘤被圈起来并用黑色三角形标记）。酒吧 - 5 毫米。标注 - 有肿瘤的远端结肠区域的放大视图;棒 - 1 毫米）。请点击此处查看此图的大图。

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图 4.CAC 组织学评估。（A）第70天AOM / DSS处理和对照（仅AOM）小鼠的瑞士卷结肠的代表性H&E染色切片，右侧显示了3只动物的扩大远端区域。对照结肠显示完整的结肠隐窝组织。AOM/DSS处理小鼠的结肠特征为粘膜下增厚（箭头），免疫浸润（箭头），隐窝结构破坏或丧失（星形），上皮层侵蚀，上皮增生或发育不良上皮（圆圈）伴腺瘤和腺癌形成（虚线勾勒）。条形 - 500 μm。（B） 用于评估 CAC 表型严重程度的组织病理学评分系统。（C）仅AOM或AOM / DSS处理的小鼠的结肠组织学评分示例，如A所示。（D）在1或3个DSS周期后，AOM处理动物的瑞士卷结肠中Ki67增殖标志物的代表性免疫组织化学染色。增殖的 Ki67 阳性细胞（棕色）位于结肠隐窝底部，但向上扩散并侵入隐窝内部，并伴有 CAC 启动和更晚期的病理。棒材 - 100 μm。代表性的免疫荧光染色，基于 CD31 内皮标志物（红色）评估血管形成，并用 DAPI 复染以可视化 AOM/DSS 处理的小鼠结肠切片中的细胞核（蓝色）。棒材 - 100 μm。请点击此处查看此图的大图。

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图 5.微生物群均质化减少了结肠炎症和 CAC 肿瘤负荷的变异性。（A）第8天用2.5%DSS处理的小鼠的平均粪便脂质运载蛋白-2水平。使用Welch's t检验进行统计分析，比较两组之间的平均粪便脂质运载蛋白-2水平（p=0.137，n=6和12个笼子）。此外，还对方差进行了 F 检验，得出 p 值为 0.0001，表明两组之间的方差存在显着差异。（B）在第8天接受DSS水的AOM / DSS处理动物的平均体重减轻。虽然两组之间的平均体重减轻没有显着差异（Welch t 检验，p=0.194，n=6 & 12），但组内的方差显着不同（F 检验，p=0.027）。（C） AOM/DSS 治疗 10 周后每只小鼠的肿瘤负荷。使用 Welch 的 t 检验进行统计分析以评估组间平均肿瘤负荷的差异 （p=0.211， n=8 和 18），并使用 F 检验来评估方差之间的差异 （p=0.013）。（A-C）蓝色小提琴图描绘了经过微生物群均质化的组，而绿色小提琴图代表对照组（没有微生物群均质化），ns - 不显着。请点击此处查看此图的大图。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AOM/DSS 方案于 1996 年由 Okayasu 等人首次提出 25，此后被认为是忠实模拟结肠癌从正常组织到腺瘤变化并最终癌的开始和进展的优秀模型，正如 Suzuki 等人在 2006 年证明的那样26，特别是在结肠炎症的背景下。随后的研究评估了AOM和AOM/DSS对不同小鼠品系的影响，以及不同治疗持续时间对肿瘤表型和外显率的影响26,27,28。2018 年，克里斯托弗·威廉姆斯 （Christopher Williams） 和他的团队发布了更新的协议29，为该方法的发展奠定了重要基础。最近的进展进一步证明了AOM/DSS模型在粘膜免疫研究中的效用，通过整合了肠道免疫浸润的分离方法和通过流式细胞术进行免疫表型分析的方法30。

AOM/DSS 协议的主要优势之一是易于适应几乎任何小鼠品系，从而促使研究不同遗传背景的影响。因此，Suzuki等人使用结肠腺瘤外显率作为读数，比较了四种不同小鼠品系对AOM/DSS诱导的结肠癌变的易感性，结果如下：BALB/c > C57BL/6N > DBA/2N = C3H/HeN26。其他研究发现，与 C57BL/6J 和 129/SvJ 菌株相比，FVB/N 小鼠在重复 AOM 治疗后更容易发生结肠肿瘤27。值得注意的是，在为期10周的AOM / DSS CAC诱导方案中，FVB / N小鼠报告了外显率接近100%的高分化结肠腺癌的发展31。这些发现共同表明，不同的小鼠品系可能对 AOM/DSS 治疗的敏感性不相同，从而导致肿瘤发生的变化，并进一步强调需要一套一致的指南来协调 AOM/DSS 协议，以及跨小鼠品系、住房设施和其他变量的可重复性。其中，肠道微生物组的显着变异阻碍了专注于炎症和肿瘤外显率的研究的可重复性 9,10。具体来说，肠道微生物组的组成，包括 Duncaniella muricolitica 和 Alistipes okayasuensis 物种，会对 DSS 结肠炎的严重程度产生巨大影响13。另一项研究强调了微生物群组成在 CAC 诱导中的重要性，证明 NLRP3 缺陷小鼠表现出恶化的结肠炎表型，其特征是拟杆菌门（特别是 Prevotellaceae）和 TM710 的存在增加。

尽管该方法很受欢迎，但现有的AOM / DSS方案尚未解决实验组32中在动物之间观察到的高变异性的重要问题。为了应对这一挑战，我们提出了一套通过实施 DSS 滴定（考虑动物性别）和微生物群均质化来优化和协调方案的建议。我们的方法旨在减少AOM/DSS模型在动物品系、实验设计和终点之间的变异性并增强其可重复性。虽然我们无法提供有关样本量的具体建议，但实验重复的数量将以具体的研究设计和每个实验的预期效应大小为指导。这些细化实现的较低组内变异性需要在每种条件下更少的动物才能在检测这些差异时获得相同的统计功效。我们预计这些改进将进一步促进动物的道德使用、负责任地管理研究资金以及减少劳动力，从而提高效率。

AOM/DSS模型在研究人类结肠炎相关结直肠癌方面具有重要的转化价值。鉴于人类 CRC 的复杂病因而建模的挑战，需要强调的是，尽管 AOM/DSS 模型可能为散发性 CRC 的发病机制提供一些见解，但它最适合研究炎症相关恶性肿瘤。此外，AOM/DSS诱导的癌症转移发生率低33,34，因此不适合研究转移扩散。尽管存在这些局限性，AOM/DSS 模型具有高度渗透性、可靠性，展示了与人类相关的组织病理学，并准确模拟了从炎症到异型增生再到腺癌的疾病进展，同时保持了成本效益。在该协议中，我们提供了基于现有工作流程生成可重复结果和最小化混杂因素的建议8,35。

通过剂量反应试点实验确定最佳DSS剂量，将动物性别作为生物学变量16,36,37，是建立稳健的AOM / DSS方案的第一个关键步骤（图1）。我们发现，与男性 （~15%） 相比，用 3% DSS 治疗 7 天导致女性 （~20%） 的体重下降更显着（图 1B，D）。然而，与雌性小鼠相比，雄性小鼠对 DSS 的敏感性可能更高、更低或同样敏感。这可能归因于不同的小鼠品系和动物设施中肠道微生物组组成的变化，因此需要根据每组特定的实验重新调整 DSS 浓度。最佳 DSS 浓度是在最大化结肠炎症和肿瘤诱导而不超过可耐受毒性之间的权衡。根据我们的经验，这种平衡很可能在 DSS 剂量下实现，导致第一个周期后体重减轻约 20%。动物在第二个治疗周期中体重减轻较少，但在 DSS 的第三个周期中通常观察到体重减轻幅度更大，这可能是由于结肠中肿瘤的形成。因此，25% 的体重减轻可以作为机构动物使用协议的人道终点。此外，经过良好校准的 DSS 结肠炎会导致柔软但仍形成的粪便颗粒，而不是腹泻和偶尔的血腥试验阳性，但粪便中很少有可见血迹的病例，预计动物将在停止 DSS 给药后两周内完全康复。

DSS 是一种分子量范围为 36,000 至 50,000 Da 的聚合物。由于 DSS 生产中的批次间差异，必须对每批新产品进行 DSS 剂量重新校准实验。为了保持一致性，估计从同一批次购买整个研究所需的 DSS 总量是可行的。此外，该协议还描述了在CAC诱导期间标准化整个小鼠实验队列的微生物群组成的步骤，从而减轻潜在的笼子效应以减少变异性。作为尽量减少笼子效应的额外预防措施，建议尽可能将来自不同实验组的动物共同饲养。根据具体的实验目标和道德动物使用政策，这些考虑因素应反映在试点实验中。水瓶泄漏的湿笼子中的垫料变化也可能引发微生物群漂移。最好在 DSS 分娩期间和之后的五天内不要更换笼子。使用 50 mL 管进行 DSS 水管理可降低泄漏风险并最大限度地减少 DSS 浪费。这些后勤考虑可能需要研究人员和执行笼子更换和饲养服务的动物护理技术人员之间的密切合作。

在该协议中，我们还提供了组织和细胞收获以及数据收集的基本工作流程。这包括检测潜血的存在（图2C）和定位肿瘤（图3A）。AOM/DSS模型适用于免疫功能正常的小鼠，与异种移植方法相比，由于免疫系统38,39完全完整，因此使其成为探索肿瘤免疫微环境的理想系统。值得注意的是，它适用于免疫系统或基质成分的实验扰动，无论是通过用于细胞类型特异性基因敲除/敲除或报告盒的遗传 Cre-Lox 系统，还是特定细胞群的植入或耗竭。例如，通过将AOM/DSS模型与骨髓移植相结合，我们之前研究了造血系统突变如何调节CAC的严重程度和负担40。为了协助此类研究，有已发表的优秀方法用于分离适合进一步分析的活肿瘤浸润白细胞，例如免疫表型分析、功能测定和单细胞多组学41。最后，由于外显率高且潜伏期一致，AOM/DSS 模型适用于使用总肿瘤负荷作为主要读数的临床前治疗研究。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

提交人声明没有竞争的经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作部分由 NIH 奖 R01 DK121831 （OAG） 和 R01 AI067846 （DA） 资助。OAG 还得到了 Edward P Evans 基金会和 Oxnard Family Foundation 的支持。DA 得到了优秀协会奖的支持。UFHCC 是 NCI 指定的癌症中心 （P30 CA247796）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
嘧啶甲烷粉Sigma-AldrichCAS 25843-45-2， Cat# A4586诱发结肠肿瘤致癌物
台式微量离心机NA NA用于样品制备 
C57BL/6J 小鼠杰克逊实验室000664每项特定研究的适当菌株和年龄
锥形管，50 mLFisher14955239施用 DSS 水
葡聚糖硫酸钠盐，MW 约 40,000Cayman Chemical 23250导结肠充血 
乙醇，70%费舍尔 43655223工作表面和解剖工具进行消毒
研磨玻璃珠，800 和微粒;m VWR12621-148促进结肠/肿瘤组织的均质化
HemoCue America Beckman Coulter Heoccult ICT 免疫化学粪便潜血检测试剂盒HemoCue America 395065A货号 23280010用于检测粪便中的潜血
胰岛素注射器 27GX5/8 1CC BD 3294-12用于AOM注射液
Lixit 阻滞剂NANA阻止自动向小鼠笼子输送水，如果存在（由动物设施提供，无菌） 
磁力搅拌棒和搅拌板 NANA溶解 DSS 
微管珠均质机，BeadBlaster 24 准D2400用于均质结肠/肿瘤
小鼠脂质运载蛋白-2/NGAL DuoSet ELISAR&D Systems货号 DY1857检测粪便样品中的脂质运载蛋白 2
NP-40 溶液，10%赛默飞世尔85124用于裂解肿瘤/结肠组织
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒默飞世尔科技A65453用于量化总组织裂解物中的蛋白质浓度，或任何其他适当的方法
蛋白酶和磷酸盐抑制剂混合物 FisherPI78440制备用于细胞因子/蛋白质分析的样品 
RLTplus 缓冲液Qiagen1053393分离 RNA，或任何其他适当的 RNA 分离方法
RNAlaterThermo Fisher ScientificAM7021在 RNA 分离前保存组织样本
RNeasy Microprep 试剂盒 QIAGEN74004分离 RNA，或酌情其他 RNA 分离和纯化方法
齿动物水瓶喷嘴 （30mm）视觉类型 E 用于施用水或 DSS 溶液
菌剪刀和镊子NANA用于组织解剖
注射器针头，27G x 1/2 英寸长（短）BD 305109用于结肠瑞士卷组织固定 
注射器，鲁尔锁，3 mLBD 309657解剖和分期之前冲洗结肠
TapeStationAgilent用于 RNA 浓度和质量/完整性评估
Teklad 2918Evigo BioproductsT.2918M.15标准啮齿动物日粮，18% 蛋白质，辐照
组织盒VWR#87002-472用于保存用于包埋的样品
顶部加载实验室天平，0-220 gNANA称重动物
Whatman 吸墨纸VWR InternationalCat# 28298-020用于分期解剖结肠，用于大体病理学和肿瘤计数
根据 诱 对基科技 赛 啮无 在

参考文献

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