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方法文章

在合成模块上自动化制备用于肿瘤微环境 PET 成像的 [68Ga]Ga-3BP-3940

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DOI：

10.3791/68356

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2025年4月25日

 ,  ,  , 
1Nuclear medicine department, Institut régional du Cancer de Montpellier (ICM), University of Montpellier, 2IBMM, University of Montpellier, CNRS, ENSCM

本文内容

摘要

本研究描述了使用GAIA V2合成仪自动化制备用于成纤维细胞激活蛋白PET显像的[68Ga]Ga-3BP-3940的过程，并展示了对三个测试批次进行质量控制检测的结果。

摘要

在GAIA合成模块上已开发出一种快速高效的自动化镓-68放射性标记方法，用于标记分子成像探针3BP-3940，该探针靶向成纤维细胞活化蛋白，可用于肿瘤微环境的正电子发射断层扫描成像。反应条件包括乙酸盐缓冲液（终浓度：0.1 M）、甲硫氨酸作为抗辐射分解剂（终浓度：5.4 mg/mL）以及30 µg的3BP-3940，在98 °C下加热8分钟。最终需经C18小柱纯化，以获得高纯度的放射性标记产物。相比之下，发生器产生的68Ga直接使用，无需经阳离子交换小柱进行浓缩。三批验证批次的制备结果证实了该方法的可靠性，可在22.3 ± 0.6 min内完成[68Ga]Ga-3BP-3940的合成，并具有高放射化学纯度（RCP），经放射性高效液相色谱法（radio-HPLC）测定为99.1% ± 0.1%，放射性薄层色谱法（radio-TLC）测定为99.2% ± 0.1%。基于radio-HPLC测定的RCP值，平均放射化学产率为74.4% ± 3.3%。放射性标记产物在配制后4小时内保持稳定。本方案为[68Ga]Ga-3BP-3940的制备提供了一种可靠、快速且高效的方法，可轻松转移至临床应用环境。

引言

近年来，以肿瘤微环境（TME）为靶点在诊断和治疗应用中引起了广泛关注1。TME中存在多种细胞类型、信号分子以及细胞外基质（ECM）大分子，提供了大量潜在的分子靶点2。在定植于TME的宿主细胞及浸润性宿主细胞中，癌症相关成纤维细胞（CAFs）是TME内一个独特的成纤维细胞亚群，其表型不同于正常成纤维细胞。CAFs通过其特有的细胞与分子特征，在肿瘤进展、转移、免疫逃逸和治疗耐药中发挥关键作用3。这些间充质细胞表现出活化的表型，其特征是表达成纤维细胞活化蛋白（FAP）。在分子层面，CAFs分泌多种复杂的细胞因子、趋化因子、生长因子（如TGF-β、IL-6和CXCL12）以及ECM蛋白（如胶原蛋白、纤连蛋白），从而重塑细胞外基质并促进促肿瘤微环境的形成4。

作为一种在癌相关成纤维细胞（CAF）膜的胞外表面高表达且定位于该位置的高度特异性蛋白，FAP 具备可靠分子靶点的所有特征，尤其适用于核医学和放射性药物应用5。在此背景下，基于喹啉结构的 FAP 小分子抑制剂（FAPI）被开发出来，并通过引入 DOTA 基团实现功能化，迅速进入临床应用6,7,8。特别是，使用镓-68（β+ 发射体，t1/2 = 68 min）标记的 FAPI-04 和 FAPI-46 用于正电子发射断层扫描（PET）成像，在纤维化疾病、心脏病学及肿瘤学中已显示出重要价值8,9，尤其适用于 [18F]氟脱氧葡萄糖（[18F]FDG）应用受限的癌症类型10。然而，尽管小分子 FAPI 在肿瘤及非恶性疾病成像中的贡献不可否认，但其在靶向放射性核素治疗（TRT）应用中仍存在某些局限性，尤其是由于其在肿瘤内部滞留时间不够理想，可能导致对健康组织的非预期照射11。为解决这一问题，已有多种策略被探索，例如设计多价配体11,12，或使用半衰期较短的治疗性放射性核素13,14,15。此外，还开发了具有高 FAP 亲和力并能引发高水平细胞内化的新型分子骨架。

其中一种是伪肽衍生物 FAP-2286。它包含一个7个氨基酸序列，通过1,3,5-苯三甲硫醇基团环化并与DOTA螯合剂连接16。一项初步的人体研究表明，[68Ga]Ga-FAP-2286 的生物分布特征与 [68Ga]Ga-FAPI-46 相似，在肝脏、肾脏和心脏中的生理性摄取略高17。在该研究中，64名患者（主要患有头颈部、肝脏、胃、胰腺、卵巢和食管癌症）接受了 [68Ga]Ga-FAP-2286 的 PET 成像，用于癌症分期或复发检测：在原发肿瘤、淋巴结转移灶和远处转移灶中，[68Ga]Ga-FAP-2286 的摄取明显高于 [18F]FDG，从而提高了图像对比度和病灶检出能力。所有原发肿瘤均能在 [68Ga]Ga-FAP-2286 PET/CT 中显示，而 [18F]FDG PET/CT 漏检了近20%的病灶。对于受累淋巴结、骨转移及内脏转移灶，[68Ga]Ga-FAP-2286 的检出率也更高。另一项针对21例不同类型癌症患者的小规模研究也证实了该显像剂优异的敏感性，反映出 [68Ga]Ga-FAP-2286 的诊断效能18。更特异性的研究则集中于单一癌症类型，如尿路上皮癌或肺癌，再次凸显了 [68Ga]Ga-FAP-2286 在临床分子影像中的巨大潜力4,5。在治疗方面，一项初步研究评估了使用镥-177（β- 发射体，t1/2 = 6.7 d）标记的 FAP-2286 在11例进展性、转移性癌症患者中的应用19。大多数患者接受了两个治疗周期，间隔8周，每个周期的平均给药剂量为 5.8 ± 2.0 GBq 的 [177Lu]Lu-FAP-2286。该药物表现出较长的瘤内滞留时间，在骨转移灶中的有效半衰期约为44小时。鉴于其可接受的不良反应，这些结果为更大规模的临床试验奠定了基础：目前，诺华公司（Novartis）赞助的 I/II 期 LuMIERE 临床试验（NCT04939610）正在评估 [177Lu]Lu-FAP-2286 的安全性和有效性7,8。文献中还记录了其他小规模的研究方案9,20，并已发表多份病例报告21,22,23,24,25,26，证明了这种靶向放射性核素治疗（TRT）的有效性和良好耐受性。

在FAP-2286基础上进行的最小结构修饰得到了优化的类似物3BP-3940（图1）27。尽管关于该载体分子的科学文献仍有限，但已有早期研究针对其成像和治疗应用展开。一项初步报告描述了在18例患有各种终末期转移性癌的患者中使用[68Ga]Ga-3BP-3940的情况，结论认为该放射性药物是一种合适的PET成像剂，突出表现为优异的肿瘤与背景比以及极低的肾脏摄取28。在另一项研究中，一名患有肝转移的胰腺癌患者接受了150 MBq的[68Ga]Ga-3BP-3940用于PET成像，结果显示原发肿瘤和转移病灶中均有强烈摄取29。同一名患者随后接受了单次剂量为9.7 GBq的[177Lu]Lu-3BP-3940靶向放射性核素治疗（TRT）。治疗耐受性良好，生命体征和生物学参数均无显著变化。另一项研究报道了使用3BP-3940进行诊疗一体化策略的首次人体研究结果：患者首先通过[68Ga]Ga-3BP-3940 PET成像筛选，随后接受用不同同位素标记的3BP-3940（177Lu、90Y或225Ac），单独或以串联组合方式（例如177Lu + 225Ac）给药，共进行1至5个治疗周期30。治疗结果包括1例完全缓解、4例部分缓解、3例疾病稳定和12例疾病进展。该队列（n = 28）自TRT开始后的中位总生存期为9个月。

化学结构，68Ga放射性标记化合物，有机分子图，核医学。
图1：[68Ga]Ga-3BP-3940的化学结构。请点击此处查看此图的放大版本。

实验性放射性药物（如 FAP-2286 和 3BP-3940）的 68Ga 放射性标记过程通常需要使用合成模块来实现制备步骤的自动化。值得注意的是，方法自动化可确保工艺的稳健性和符合 GMP 要求，并与手动制备方法相比显著降低操作人员的辐射暴露风险31,32,33。在许多情况下，监管机构在授权某中心生产相应实验性放射性药物之前，通常要求将此类自动化方案作为研究性药品档案（IMPD）的一部分提交34。迄今为止，文献中关于抗 FAP 假肽类化合物的自动化 68Ga 放射性标记的详细信息仍十分有限29,35,36,37,38。此外，已报道的数据通常仅适用于特定型号的合成仪。所使用的 68Ga 发生器类型也可能带来某些特异性，因为不同商业化产品所产出的 68Ga3+ 盐酸洗脱液体积（通常为 0.1 M）各不相同，这可能直接影响自动化放射性标记的条件。

在此背景下，我们介绍了一种利用GAIA V2合成模块对拟肽3BP-3940进行快速、高效自动化放射性标记68Ga的详细方案。该合成器采用一套由三个通道组成、每个通道包含五个歧管的管路系统，并通过蠕动泵控制液体流动。设备还配备用于加热反应介质的小瓶加热炉、多个放射性探头以及压力传感器，以实时监测系统内的相关参数。尽管该设备的普及程度不及某些其他型号，但在本中心已常规使用，并正在越来越多的机构中安装应用31,39,40,41,42,43,44。本研究中使用的GALLIAD 68Ge/68Ga发生器，其洗脱的68Ga未经过预纯化处理。该方法旨在为[68Ga]Ga-3BP-3940的制备提供一种稳定、快速且便捷的解决方案，同时优化放射性标记过程中操作人员的辐射防护。这也是首次针对该特定合成器型号报道的、如此详尽的该放射性药物制备方案。

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方案

注意：本方案涉及放射性同位素操作。任何执行此操作的人员必须接受过非密封放射性物质操作的适当培训，并获得所在机构辐射安全负责人批准。自动合成仪应置于指定的屏蔽热室中。任何涉及放射性物质的手动操作也必须在屏蔽热室中或适当的辐射屏蔽后进行。

1. 试剂的准备

注意：自动化合成 [68Ga]Ga-3BP-3940 所需的试剂（见材料表）需在放射性药物制备单元（GMP C级洁净室）中准备。试剂可在合成前任意顺序准备，且最迟不超过2小时。

  1. 缓冲液溶液（0.8 M 乙酸钠）的制备
    1. 获取以下原料：三水合乙酸钠 EMPROVE API Ph Eur, BP, JP, USP, FCC, E262。
    2. 在已正确标识的无菌容器（例如，5 mL 微量离心管）中，使用精密天平准确称取约 544.32 mg 的三水合乙酸钠。
    3. 使用经校准的微量移液器和无菌吸头，将乙酸钠溶解于接近 5 mL 的注射用水（WFI）中，WFI 体积按以下公式计算：
      ​WFI 体积 = (称取的缓冲剂质量 × 5) / 544.32
    4. 涡旋混匀溶液，并将其置于超声波水浴（40 kHz，约 1 分钟）中处理，以促进溶解。
    5. 使用配备 21G 针头的 10 mL 注射器抽取缓冲液溶液。在注射器与新针头之间安装 0.22 µm 滤器，消毒瓶塞后，将缓冲液直接过滤至已正确标识的无菌密封小瓶（例如，TC-ELU 5）中。
  2. 抗辐射分解化合物溶液（10 mg/mL 蛋氨酸）的制备
    1. 获取以下原料：L-蛋氨酸（Ph. Eur., USP），纯品，药用级。
    2. 在已正确标识的无菌容器（例如，5 mL 微量离心管）中，使用精密天平准确称取约 50 mg 的 L-蛋氨酸。
    3. 使用经校准的微量移液器和无菌吸头，将 L-蛋氨酸溶解于接近 5 mL 的注射用水（WFI）中，WFI 体积按以下公式计算：
      WFI 体积 = (称取的缓冲剂质量 × 5) / 50
    4. 涡旋混匀溶液，并将其置于超声波水浴（40 kHz，约 1 分钟）中处理，以促进溶解。
    5. 使用配备 21G 针头的 10 mL 注射器抽取蛋氨酸溶液。在注射器与新针头之间安装 0.22 µm 滤器，消毒瓶塞后，将溶液直接过滤至已正确标识的无菌密封小瓶（例如，TC-ELU 5, Curium）中。

2. 质量控制设备的准备

  1. 终产物的 pH 控制
    1. 在适当的防护屏蔽后，放置一条 pH 试纸，用于后续检测终产物的 pH 值。
  2. 通过放射性薄层色谱法（radio-TLC）控制放射化学纯度
    1. 准备两个含有适当流动相的薄层色谱展开槽。流动相 A：0.1 M 柠檬酸缓冲液（pH 4，水溶液），预期 [68Ga]Ga-3BP-3940 的 Rf 值为 0–0.2，游离 68Ga3+ 的 Rf 值为 0.8–1。流动相 B：1 M 醋酸铵缓冲液，溶剂为水与甲醇按 1:1 体积比（v/v）混合，预期 [68Ga]镓胶体的 Rf 值为 0–0.2，而 [68Ga]Ga-3BP-3940 的 Rf 值为 0.8–1。
    2. 在适当的防护屏蔽后，将两个薄层色谱展开槽放置在两块 iTLC-SG 板旁边，用于后续检测终产物的放射化学纯度（RCP）。
    3. 开启放射性色谱仪，并在操作计算机上打开相应的数据采集软件。预先输入即将进行的第一次分析的识别信息。
  3. 通过放射性高效液相色谱法（radio-HPLC）控制放射化学纯度
    1. 检查分析所需的色谱柱型号（C18 ACE 等效柱）是否已安装在系统上。
    2. 配制新鲜的 HPLC 流动相，即 HPLC 级水 + 0.1% 三氟乙酸（TFA）作为溶剂 A，乙腈 + 0.1% TFA 作为溶剂 B。将溶剂 A 和溶剂 B 的瓶分别连接至放射性高效液相色谱仪对应的管路。
    3. 开启操作计算机，并连接至控制软件。
    4. 如有必要，打开泵模块上的冲洗阀，冲洗将用于分析的管路（即 A 管和 B 管），操作完成后关闭冲洗阀。
    5. 使系统以梯度起始比例的流动相进行平衡，即 95% A / 5% B，流速为 0.6 mL/min，至少平衡 20 分钟。对于 [68Ga]Ga-3BP-3940 的 HPLC 分析程序，保持流速为 0.6 mL/min，并设定流动相梯度从含 0.1% TFA 的水（A）到含 0.1% TFA 的乙腈（B），具体如下：0–1 分钟，95/5 A/B；1–8 分钟，从 95/5 A/B 线性梯度变化至 60/40 A/B；8–9 分钟，60/40 A/B；9–10 分钟，从 60/40 A/B 线性梯度变化至 95/5 A/B；10–12 分钟，95/5 A/B。
    6. 选择步骤 2.3.5 中描述的流动相梯度分析方法，然后预先输入即将进行的第一次分析的识别信息。
    7. 在屏蔽容器内，准备一个带玻璃插管的 HPLC 进样小瓶，用于盛装待分析样品，并将其置于适当的防护屏蔽后。

3. 合成模块的制备

  1. 打开屏蔽舱的电源和照明。启动控制合成仪的笔记本电脑，并登录模块软件。
  2. 如有需要，从合成仪中移除旧试剂盒，并将废弃物放入相应的容器中处理。
  3. 根据适用的卫生标准，对装载合成模块的屏蔽柜内部及合成仪本身进行清洁。
  4. 在合成仪软件中，点击 用户，然后在弹出窗口中选择用户名并输入对应的密码。点击 方法，选择先前为 [68Ga]Ga-3BP-3940 合成配置的自动化程序。
  5. 点击 准备，在相应的文本框中输入合成标题、载体批次号、试剂盒批次号以及任何备注信息。此阶段还可设置并遵循各试剂盒准备步骤的核对清单（补充图 1）。

4. 合成卡盒的准备及卡盒安装

  1. 使用擦拭布和适当的消毒清洁剂清洁放射性药物实验室工作台，并在工作台上铺上无菌铺巾。
  2. 取一个无菌的[68Ga]Ga标记卡盒（货号 RT-01-H）和一个试剂盒（补充图2）。模块上管路组件的三个坡道从左至右分别为A、B和C；每个坡道上的多通阀从上至下编号为1至5（坡道A和C），或从左至右编号（坡道B）。
  3. 按照以下步骤组装卡盒。
    1. 打开[68Ga]Ga卡盒包装，检查是否有任何损坏，并拧紧卡盒上的每个鲁尔接头。取下所有穿刺盖帽。
    2. 使用5 mL鲁尔锁紧式注射器和21G针头，从试剂盒中抽取5 mL无水乙醇，缓慢流经C18固相萃取柱；然后抽取5 mL注射用水（WFI，未包含在试剂盒中），同样缓慢流经同一C18固相萃取柱，以进行预处理。
    3. 将管路组件的A坡道放置在合成模块上，并旋转两个卡扣以固定坡道位置。将垂直A1管路的自由端连接至19G针头，并插入废液瓶中。
    4. 在废液瓶上插入排气针，并将其向后放置，最好置于将接收洗脱液瓶的屏蔽容器后方。在A4位置安装一个0.22 µm滤膜。
    5. 将水平A1管路连接至模块前面板左下角的压力传感器。
    6. 使用阴阳接头，在水平A5位置连接一根30 cm长的延长管，末端接一个0.22 µm终端滤膜和一根80 mm长的20G针头。
    7. 将上述20G针头插入一个密封的无菌真空采血管（例如TC-ELU 5），插入通气针，并将该真空采血管置于其屏蔽容器中。
    8. 将连接垂直A1与垂直C1的管路放置在B坡道上方的固定钩后方。
    9. 使用已安装在A2位置的接头，通过一段短延长管（不在试剂盒内，或最初连接在C5水平位置的管路）连接水平多通阀A2与B1。
    10. 将B坡道放置在合成模块上，并旋转两个卡扣以固定坡道位置。
    11. 将已预处理的C18固相萃取柱连接至水平C2位置，保持连接水平B5阀门与C2的接头位于其左侧。
    12. 将C坡道放置在合成模块上，并旋转两个卡扣以固定坡道位置。
    13. 使用阴阳接头，将一根50 cm长的延长管从水平C5连接至GALLIAD 68Ga发生器。
    14. 将管路组件中的彩釉反应小瓶放入模块的加热炉中。小心地将从垂直A5到垂直C5的管路放入蠕动泵中，关闭泵盖，确认管路位置正确，并将管路穿过泵左侧的放射性活度传感器。
  4. 进行中间检查，确保卡盒和管路已按照图2所示方式装配在放射性合成仪上，但尚未加入试剂。

化学反应的自动合成流程图，包含歧管装置和连接表。
图 2：合成模块配置。（A）在合成模块上自动合成 [68Ga]Ga-3BP-3940 的装置设置。（B）使用 GAIA 合成模块自动生产 [68Ga]Ga-3BP-3940 的试剂位置详情。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 试剂安装

  1. 安装模块上的斜坡后，按以下说明安装试剂。
    1. 使用穿刺接头将试剂盒中的250 mL WFI袋连接到C4管路，并将袋子挂在模块右侧的专用挂钩上。
    2. 使用配备20G针头的3 mL三件式鲁尔锁紧注射器，吸取先前配制的1.5 mL L-甲硫氨酸10 mg/mL溶液，将注射器连接至水平C1管路，并将其悬挂在模块右侧的专用卡槽中。在液面与注射器活塞密封之间保留约2 mL空气，以确保液体完全转移。
    3. 使用带20G针头的1 mL注射器，吸取750 µL先前配制的10 mg/mL L-甲硫氨酸溶液，在消毒隔膜后注入试剂盒中的0.9% NaCl小瓶（蓝色压盖）中。
    4. 使用带20G针头的10 mL三件式鲁尔锁紧注射器，吸取0.9% NaCl + L-甲硫氨酸小瓶（蓝色压盖）中的内容物，调整至8.6 mL，取下B4位置的穿刺针，然后将注射器连接至B4位置。在液面与注射器活塞密封之间保留约2 mL空气，以确保液体完全转移。
    5. 使用带20G针头的3 mL三件式鲁尔锁紧注射器，在消毒隔膜后吸取60%乙醇小瓶（橙色压盖）中的内容物。检查体积是否至少为1.5 mL，取下B5位置的穿刺针，然后将注射器连接至B5位置。在液面与注射器活塞密封之间保留约2 mL空气，以确保液体完全转移。
    6. 使用低死体积的1 mL注射器和20G针头，吸取0.25 mL先前配制的0.8 M乙酸钠缓冲液，注入含有30 µg 3BP-3940的小瓶中，通过反复注射/回吸循环使其溶解。将0.25 mL溶液重新吸入同一注射器中，取下针头，并将缓冲液+载体的注射器置于B3位置。在液面与注射器活塞之间保留约0.25 mL空气，以确保液体完全转移。
  2. 在合成开始前进行最终检查，具体如下：
    1. 确认所有试剂均已按图3所示连接至反应盒或管路。
    2. 确保试剂盒的每个连接处均充分拧紧，且无任何管路受压或弯曲。
  3. 系统已准备就绪。关闭前面板，并启动屏蔽室的通风系统。

用于蛋白质纯化的流体色谱系统装置；可见的管路、泵和色谱柱。
图3：试剂盒装置。 将管路组件和试剂最终安装至合成仪上，用于使用68Ga对3BP-3940进行放射性标记。请点击此处查看该图的放大版本。

6. [68Ga]Ga-3BP-3940 制备的自动化放射性标记程序

  1. 当所有试剂已放置在斜坡上，且所有信息已在软件中正确记录后，点击 运行合成。
  2. 图 4 展示了在整个合成过程中，管路系统内放射性分布的典型情况。请按照以下描述的自动化方法，依次完成 [68Ga]Ga-3BP-3940 的制备步骤：
    1. 装置完整性测试：短暂向废液瓶方向吹扫管路（主要是为了清除 C18 柱中残留的液体）后，系统通过打开 A4 并利用蠕动泵泵入过滤空气，以提高内部压力。一旦连接至 A1 的压力传感器检测到管路压力 > 1500 mbar，系统即关闭，蠕动泵停止运行。若在 15 秒内压力下降不超过 400 mbar，则判定装置完整性测试成功，可开始合成；若测试失败，则怀疑系统存在泄漏，应中止合成程序。
    2. 向反应瓶中加入载体：确保缓冲液中溶解的 3BP-3940 通过 B2 多通阀在约 30 秒内被吸入反应瓶中。
    3. 向反应瓶中加入 L-甲硫氨酸：确保位于 C1 注射器中的甲硫氨酸溶液通过 B2 多通阀、沿 C 斜坡向下、再沿 A 斜坡向上，最终在 B 斜坡处分流至 A2 多通阀，进入反应瓶。
    4. 使用注射用水（WFI）活化 C18 柱：确保来自 C4 袋中的注射用水流经 C18 柱，同时冲洗载体和甲硫氨酸溶液所经过的 A、B 和 C 斜坡路径。随后用过滤空气冲洗相同路径，以确保后续步骤中管路内无残留水分。
    5. 发生器洗脱至反应瓶（需手动操作）：为洗脱 GALLIAD 发生器，先将发生器顶部的绿色旋钮旋转 90° 至加载位置，等待 10–20 秒，使发生器准备好固定体积为 1.1 mL 的洗脱液。随后将绿色旋钮恢复至初始位置，并点击控制软件中的提示按钮。蠕动泵将在 3 分钟内将 68Ga 洗脱液吸入反应瓶。在此期间，反应瓶温度在 1 分钟内逐步升至 60 °C，再在 2 分钟内升至 90 °C，以便更快达到放射性标记步骤的设定温度。
    6. 放射性标记：检查放射性标记步骤开始时，是否已设定 120 °C 的目标温度并维持 30 秒，以实现快速高效的加热；随后检查目标温度是否调整为 98 °C 并维持 2 分钟。由于反应瓶内温度和压力上升，部分反应液倾向于回流至连接 B2 的管路中。为减少此现象，在加热 2 分钟后设定一次 10 秒的管路吹扫；之后继续进行放射性标记约 5.5 分钟。
    7. C18 柱富集：确保通过 C3 向反应容器泵入过滤空气。液体表面所受压力使反应液经由 B2 连接管向上流动，进入固相萃取（SPE）柱。随后使用来自 C4 袋中的注射用水冲洗反应瓶，并以相同方式将冲洗液转移至 SPE 柱。最后用新鲜注射用水冲洗柱子，并用过滤空气吹干。
    8. C18 柱洗脱与制剂配制（加入 0.9% NaCl + L-甲硫氨酸）：SPE 柱最初保留放射性标记产物及任何镓胶体，允许游离的 68Ga3+ 通过。为洗脱柱子并将 [68Ga]Ga-3BP-3940 收集至终产物瓶中，需确保依次通过柱子吸取三份 60% 乙醇和含约 0.9 mg/mL 甲硫氨酸的 0.9% NaCl 溶液（每份 0.5 mL）。随后将 B4 注射器中的全部内容物通过 C18 柱进行制剂步骤，使终产物瓶中乙醇终浓度 <10%。
    9. 滤膜完整性测试（需手动操作）：合成结束后取下终产物瓶，根据提示将终端滤膜连接至废液瓶，并从废液瓶上移除排气滤膜，以便通过气泡点测试检查终端滤膜的完整性。在气泡点测试过程中，滤膜首先由注射用水润湿 30 秒。管路吹扫后，系统压力在 <2 分钟内缓慢升至 >2500 mbar，期间合成仪检测滤膜出口端是否无压力上升。随后系统继续缓慢加压以检测气泡点。合成仪最终记录滤膜出口端出现压力上升时的压力值，以确定气泡点压力。
  3. 合成结束后，自动化仪器软件将生成一份合成报告，描述放射性标记过程，并记录反应瓶温度、系统压力以及所涉及的放射性活度（见 图 4）。作为补充，需手动根据以下公式计算衰变校正后的放射化学产率（RCY）：
    RCY = 放射化学纯度方程，公式；用于放射分析化学中纯度测定。
    其中残余活度指合成结束时残留在反应瓶、C18 柱及废液瓶中的放射性活度。

放射性随时间（分钟）变化的图谱；活性峰的色谱分析结果。
图 4：模块内放射性典型的分布曲线。（A）反应小瓶；（B）在合成 [68Ga]Ga-3BP-3940 期间的 C18 固相萃取柱。68Ga 洗脱液在第 6 分钟进入反应小瓶。在整个放射性标记反应过程中，放射性保留在反应小瓶中。第 16 分钟后，放射性被转移至固相萃取柱。在第 19.5 分钟后对柱子进行洗脱，此后约有 150 MBq 的残留放射性保留在固定相上。请点击此处查看该图的放大版本。

7. [68Ga]Ga-3BP-3940 的分装与质量控制

  1. 将终末小瓶转移至适当的屏蔽容器中，用于放射性测量和患者剂量的制备。
  2. 使用经过适当校准的剂量校准仪测量终末小瓶的放射性活度，并在计算机上记录制备信息。
  3. 正确识别小瓶并将其放入适当的屏蔽容器中。采用适当的无菌技术和辐射防护技术，从终末小瓶中抽取约 0.5 mL 样品用于质量控制。
    1. 通过目视检查评估制备物的外观。将一滴产品溶液滴加到 pH 试纸条上，测定其 pH 值。
    2. 通过放射性薄层色谱法（radio-TLC）测定放射化学纯度：将一滴产品溶液分别点样于两张预先制备好的 iTLC-SG 板上。然后让薄层板在相应的流动相中展开，并用放射性色谱仪读取结果。通过测量产物信号和杂质信号的曲线下面积，对所得放射性色谱图进行积分，然后根据以下公式计算放射化学纯度：
      RCP (%) = 100 - %AUCimpurity 1 - %AUCimpurity 2
    3. 通过放射性高效液相色谱法（radio-HPLC）测定放射化学纯度：将约 50 µL 制备液注入预先准备好的 HPLC 小瓶中（见步骤 2.3.7）。将小瓶置于 HPLC 自动进样器的指定位置并启动分析程序。样品注入系统后，立即将小瓶从自动进样器中取出并放回其屏蔽容器中，以尽量减少辐射暴露。分析结束后，通过测量产物信号和各杂质信号的曲线下面积对所得放射性色谱图进行积分，然后根据以下公式计算放射化学纯度：
      ​RCP (%) = 100 - Σ(%AUCimpurities)
    4. 通过将约 5 µL 制备液加入含有 1 mL WFI 的伽马计数管中，使用伽马计数器检测制备物中放射性核素的半衰期。连续进行 10 次计数（每次计数 1 分钟）。根据 10 次测量中观察到的放射性衰变计算半衰期。
    5. 使用与半衰期测定相同的样品，通过伽马计数器进行伽马能谱分析，开展放射性核素鉴定试验，检测来自湮灭光子的 511 keV 和 1077 keV 峰。
    6. 在前述样品衰变 48 小时后，评估其放射性核素纯度。在伽马计数器中进行持续 120 分钟的测量，以检测是否残留因 68Ge 穿透而原位生成的 68Ga 活性及其他长半衰期放射性核素杂质。

[68Ga]Ga-3BP-3940 制品的稳定性

  1. 评估三个测试批次随时间的稳定性。为此，在合成结束（EoS）后立即从终端小瓶中取出约 200 µL 制备液，并在合成后每小时取样一次，直至 4 小时。
  2. 在每个时间点进行放射性高效液相色谱（radio-HPLC）分析，按照上述方法通过 HPLC 测定放射化学纯度（RCP）；同时在每个时间点进行放射性薄层色谱（Radio-TLC）分析，按照前述方法通过 TLC 测定放射化学纯度（RCP）。

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结果

在GAIA模块上开发的合成工艺可在21-22分钟内快速完成68Ga对3BP-3940的放射性标记。本方案设计用于与药物级68Ge/68Ga发生器GALLIAD配合使用，该发生器可产生1.1 mL浓度为0.1 M HCl的68Ga淋洗液。根据该酸量精确优化了反应缓冲液的体积和摩尔浓度，以获得3.5至4之间的反应pH值，这是实现最佳放射性标记所必需的条件45。因此，采用终浓度为0.1 M的醋酸钠。在反应体系中加入10 mg/mL的甲硫氨酸作为抗辐射分解剂，以限制加热步骤中载体分子的降解。初步测试在未进行末端纯化的条件下，将该抗氧化剂与16 mg/mL的龙胆酸和12 mg/mL的抗坏血酸进行比较，结果显示，使用甲硫氨酸所得的最终放射化学纯度（RCP）优于另两种化合物中的任意一种（图5）。

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讨论

本研究介绍了一种符合药品生产质量管理规范（GMP）的自动化制备方案，用于在GAIA模块和GALLIAD发生器上合成[68Ga]Ga-3BP-3940。该方法基于本中心用于临床PET成像中镓-68放射性标记配体（如PSMA配体44及其他FAP抑制剂43,46）的已有方案，并进行了轻微修改。

该生产过程设计得简单直接，可分为三个主要阶段：（i）将所有试剂转移至反应小瓶，（ii）使用68Ga对3BP-3940进行放射性标记，以及（iii）产物的纯化与制剂。重要的是，该自动化方法的一大优势在于其耗时短，三批测试的制备时间为22.3 ± 0.6分钟（未包括滤膜完整性测试时间）。相比之下，Hörmann等人报道了在GRP-3V模块上自动化合成[68Ga]Ga-FAP-2286的方法，其合成时间为35分钟38。

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披露

作者没有可能因本工作的商业合作关系或资金来源而产生实际或可感知的利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Yasmine Soualy、Stéphane Renaud 和 Élodie Gaven 在准备本文所述放射性标记反应过程中提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 µ 滤膜VWR514-0515用于缓冲液、抗氧化剂溶液及最终放射性标记产物的过滤
用于高效液相色谱的乙腈Sigma Aldrich34851-2.5L用于放射化学纯度的高效液相色谱检测
乙酸铵Sigma Aldrich238074用于制备薄层色谱检测的一种流动相
高效液相色谱用C18色谱柱VWREQV-3C18-1503用于放射化学纯度的高效液相色谱检测
校准过的剂量校准仪（CRC25）Capintec-用于测量终产物及合成后模块各组分的放射性活度
柠檬酸盐缓冲液，pH 4Thermofisher258585000薄层色谱检测的流动相
5 mL Eppendorf Biopur 离心管Sigma AldrichEP0030119479用于缓冲液和抗氧化剂溶液的配制
延长管（30 cm）Vygon1159.03用于将发生器连接至管路组件
镓-68发生器IRE Elit-用于原位生成[68Ga]氯化镓
γ计数器（Hidex AMG）Hidex-用于半衰期和放射化学纯度的测定
高效液相色谱系统Shimadzu-用于放射化学纯度的高效液相色谱检测
iTLC-SG 薄层色谱板AgilentSGI0001用于放射化学纯度的薄层色谱检测
L-蛋氨酸AppliChemA1340用于抗氧化剂溶液的配制
公对公接头Vygon893.00用于将发生器连接至管路组件
甲醇Sigma Aldrich320390-1L用于制备薄层色谱检测的一种流动相
针头（21G，Sterican）B Braun4657543B用于放射性标记前的溶液转移
pH试纸VWR85409.600用于检测放射性标记产物的pH值
1000 µL移液器（Gilson PIPETMAN）Fisher Scientific12346132-1000用于精确的液体量取和转移
200 µL移液器（Gilson PIPETMAN）Fisher Scientific12326132-200用于精确的液体量取和转移
移液器吸头，100–1000 μLCharles RiverD1000IW用于精确的液体量取和转移
移液器吸头，2–200 μLCharles RiverD200IW用于精确的液体量取和转移
放射性色谱仪Elysia-Raytest-用于放射化学纯度的薄层色谱检测
高效液相色谱用放射性检测器Elysia-Raytest-用于放射化学纯度的高效液相色谱检测
试剂盒ABXRT-101提供60%乙醇、0.9%氯化钠、注射用水袋、C18小柱、0.2 µ终端滤膜、通气针头、终端针头和废液瓶
屏蔽容器LemerPax用于放射性标记产物的辐射衰减
一次性塑料刮勺Corning3005用于试剂的配制
三水合乙酸钠 EMPROVESigma Aldrich1.28204用于反应缓冲液的配制
无菌密封小瓶（1型玻璃）CuriumTC-ELU-5用于缓冲液、抗氧化剂及放射性标记溶液的最终分装
无菌管路组件ABXRT-01-H用于[68Ga]Ga-3BP-3940的自动化合成
无菌冲洗用水B Braun0082479E用于制备薄层色谱检测的一种流动相
合成模块（GAIA）Elysia-Raytest-用于[68Ga]Ga-3BP-3940的自动化合成
注射器（1 mL，低死体积）B Braun9166017V用于肽在缓冲液中的配制以及向0.9%氯化钠溶液中添加蛋氨酸
注射器（10 mL）Becton Dickinson309649用于0.9%氯化钠中蛋氨酸的配制和分装
注射器（3 mL）Becton Dickinson309658用于蛋氨酸和60%乙醇的配制和分装
薄层色谱展开槽Fisher Scientific50-212-281用于放射化学纯度的薄层色谱检测
三氟乙酸（适用于高效液相色谱）Sigma Aldrich302031-100ML用于放射化学纯度的高效液相色谱检测
γ计数器用试管--用于半衰期和放射化学纯度测定的样品制备
超声波清洗仪Selecta3000683用于已配制溶液的超声处理
载体分子（3BP-3940）MedChemExpressHY-P10131 待进行放射性标记的载体分子
带玻璃插件的高效液相色谱用小瓶Sigma Aldrich29385-U 和 SU860066用于放射化学纯度的高效液相色谱检测
涡旋混合器VWR444-5900P用于搅拌已配制的溶液
用于高效液相色谱的水Sigma Aldrich34877-2.5L-M用于放射化学纯度的高效液相色谱检测
注射用水，10 mL 瓶装Aguettan34009 370 641 0 1用于溶液的配制

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