本研究描述了使用GAIA V2合成仪自动化制备用于成纤维细胞激活蛋白PET显像的[68Ga]Ga-3BP-3940的过程，并展示了对三个测试批次进行质量控制检测的结果。
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摘要
摘要
在GAIA合成模块上已开发出一种快速高效的自动化镓-68放射性标记方法，用于标记分子成像探针3BP-3940，该探针靶向成纤维细胞活化蛋白，可用于肿瘤微环境的正电子发射断层扫描成像。反应条件包括乙酸盐缓冲液（终浓度：0.1 M）、甲硫氨酸作为抗辐射分解剂（终浓度：5.4 mg/mL）以及30 µg的3BP-3940，在98 °C下加热8分钟。最终需经C18小柱纯化，以获得高纯度的放射性标记产物。相比之下，发生器产生的68Ga直接使用，无需经阳离子交换小柱进行浓缩。三批验证批次的制备结果证实了该方法的可靠性，可在22.3 ± 0.6 min内完成[68Ga]Ga-3BP-3940的合成，并具有高放射化学纯度（RCP），经放射性高效液相色谱法（radio-HPLC）测定为99.1% ± 0.1%，放射性薄层色谱法（radio-TLC）测定为99.2% ± 0.1%。基于radio-HPLC测定的RCP值，平均放射化学产率为74.4% ± 3.3%。放射性标记产物在配制后4小时内保持稳定。本方案为[68Ga]Ga-3BP-3940的制备提供了一种可靠、快速且高效的方法，可轻松转移至临床应用环境。
引言
近年来，以肿瘤微环境（TME）为靶点在诊断和治疗应用中引起了广泛关注1。TME中存在多种细胞类型、信号分子以及细胞外基质（ECM）大分子，提供了大量潜在的分子靶点2。在定植于TME的宿主细胞及浸润性宿主细胞中，癌症相关成纤维细胞（CAFs）是TME内一个独特的成纤维细胞亚群，其表型不同于正常成纤维细胞。CAFs通过其特有的细胞与分子特征，在肿瘤进展、转移、免疫逃逸和治疗耐药中发挥关键作用3。这些间充质细胞表现出活化的表型，其特征是表达成纤维细胞活化蛋白（FAP）。在分子层面，CAFs分泌多种复杂的细胞因子、趋化因子、生长因子（如TGF-β、IL-6和CXCL12）以及ECM蛋白（如胶原蛋白、纤连蛋白），从而重塑细胞外基质并促进促肿瘤微环境的形成4。
作为一种在癌相关成纤维细胞（CAF）膜的胞外表面高表达且定位于该位置的高度特异性蛋白，FAP 具备可靠分子靶点的所有特征，尤其适用于核医学和放射性药物应用5。在此背景下，基于喹啉结构的 FAP 小分子抑制剂（FAPI）被开发出来，并通过引入 DOTA 基团实现功能化，迅速进入临床应用6,7<....
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方案
注意：本方案涉及放射性同位素操作。任何执行此操作的人员必须接受过非密封放射性物质操作的适当培训，并获得所在机构辐射安全负责人批准。自动合成仪应置于指定的屏蔽热室中。任何涉及放射性物质的手动操作也必须在屏蔽热室中或适当的辐射屏蔽后进行。
1. 试剂的准备
注意：自动化合成 [68Ga]Ga-3BP-3940 所需的试剂（见材料表）需在放射性药物制备单元（GMP C级洁净室）中准备。试剂可在合成前任意顺序准备，且最迟不超过2小时。
- 缓冲液溶液（0.8 M 乙酸钠）的制备
- 获取以下原料：三水合乙酸钠 EMPROVE API Ph Eur, BP, JP, USP, FCC, E262。
- 在已正确标识的无菌容器（例如，5 mL 微量离心管）中，使用精密天平准确称取约 544.32 mg 的三水合乙酸钠。
- 使用经校准的微量移液器和无菌吸头，将乙酸钠溶解于接近 5 mL 的注射用水（WFI）中，WFI 体积按以下公式计算：
WFI 体积 = (称取的缓冲剂质量 × 5) / 544.32 - 涡旋混匀溶液，并将其置于超声波水浴（40 kHz，约 1 分钟）中处理，以促进溶解。
- 使用配备 21G 针头的....
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结果
在GAIA模块上开发的合成工艺可在21-22分钟内快速完成68Ga对3BP-3940的放射性标记。本方案设计用于与药物级68Ge/68Ga发生器GALLIAD配合使用，该发生器可产生1.1 mL浓度为0.1 M HCl的68Ga淋洗液。根据该酸量精确优化了反应缓冲液的体积和摩尔浓度，以获得3.5至4之间的反应pH值，这是实现最佳放射性标记所必需的条件45。因此，采用终浓度为0.1 M的醋酸钠。在反应体系中加入10 mg/mL的甲硫氨酸作为抗辐射分解剂，以限制加热步骤中载体分子的降解。初步测试在未进行末端纯化的条件下，将该抗氧化剂与16 mg/mL的龙胆酸和12 mg/mL的抗坏血酸进行比较，结果显示，使用甲硫氨酸所得的最终放射化学纯度（RCP）优于另两种化合物中的任意一种（图5）。
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讨论
本研究介绍了一种符合药品生产质量管理规范（GMP）的自动化制备方案，用于在GAIA模块和GALLIAD发生器上合成[68Ga]Ga-3BP-3940。该方法基于本中心用于临床PET成像中镓-68放射性标记配体（如PSMA配体44及其他FAP抑制剂43,46）的已有方案，并进行了轻微修改。
该生产过程设计得简单直接，可分为三个主要阶段：（i）将所有试剂转移至反应小瓶，（ii）使用68Ga对3BP-3940进行放射性标记，以及（iii）产物的纯化与制剂。重要的是，该自动化方法的一大优势在于其耗时短，三批测试的制备时间为22.3 ± 0.6分钟（未包括滤膜完整性测试时间）。相比之下，Hörmann等人报道了在GRP-3V模块上自动化合成[68Ga]Ga-FAP-2286的方法，其合成时间为35分钟38。
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披露
作者没有可能因本工作的商业合作关系或资金来源而产生实际或可感知的利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Yasmine Soualy、Stéphane Renaud 和 Élodie Gaven 在准备本文所述放射性标记反应过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2 µ 滤膜 | VWR | 514-0515 | 用于缓冲液、抗氧化剂溶液及最终放射性标记产物的过滤 |
| 用于高效液相色谱的乙腈 | Sigma Aldrich | 34851-2.5L | 用于放射化学纯度的高效液相色谱检测 |
| 乙酸铵 | Sigma Aldrich | 238074 | 用于制备薄层色谱检测的一种流动相 |
| 高效液相色谱用C18色谱柱 | VWR | EQV-3C18-1503 | 用于放射化学纯度的高效液相色谱检测 |
| 校准过的剂量校准仪（CRC25） | Capintec | - | 用于测量终产物及合成后模块各组分的放射性活度 |
| 柠檬酸盐缓冲液，pH 4 | Thermofisher | 258585000 | 薄层色谱检测的流动相 |
| 5 mL Eppendorf Biopur 离心管 | Sigma Aldrich | EP0030119479 | 用于缓冲液和抗氧化剂溶液的配制 |
| 延长管（30 cm） | Vygon | 1159.03 | 用于将发生器连接至管路组件 |
| 镓-68发生器 | IRE Elit | - | 用于原位生成[68Ga]氯化镓 |
| γ计数器（Hidex AMG） | Hidex | - | 用于半衰期和放射化学纯度的测定 |
| 高效液相色谱系统 | Shimadzu | - | 用于放射化学纯度的高效液相色谱检测 |
| iTLC-SG 薄层色谱板 | Agilent | SGI0001 | 用于放射化学纯度的薄层色谱检测 |
| L-蛋氨酸 | AppliChem | A1340 | 用于抗氧化剂溶液的配制 |
| 公对公接头 | Vygon | 893.00 | 用于将发生器连接至管路组件 |
| 甲醇 | Sigma Aldrich | 320390-1L | 用于制备薄层色谱检测的一种流动相 |
| 针头（21G，Sterican） | B Braun | 4657543B | 用于放射性标记前的溶液转移 |
| pH试纸 | VWR | 85409.600 | 用于检测放射性标记产物的pH值 |
| 1000 µL移液器（Gilson PIPETMAN） | Fisher Scientific | 12346132-1000 | 用于精确的液体量取和转移 |
| 200 µL移液器（Gilson PIPETMAN） | Fisher Scientific | 12326132-200 | 用于精确的液体量取和转移 |
| 移液器吸头，100–1000 μL | Charles River | D1000IW | 用于精确的液体量取和转移 |
| 移液器吸头，2–200 μL | Charles River | D200IW | 用于精确的液体量取和转移 |
| 放射性色谱仪 | Elysia-Raytest | - | 用于放射化学纯度的薄层色谱检测 |
| 高效液相色谱用放射性检测器 | Elysia-Raytest | - | 用于放射化学纯度的高效液相色谱检测 |
| 试剂盒 | ABX | RT-101 | 提供60%乙醇、0.9%氯化钠、注射用水袋、C18小柱、0.2 µ终端滤膜、通气针头、终端针头和废液瓶 |
| 屏蔽容器 | LemerPax | 用于放射性标记产物的辐射衰减 | |
| 一次性塑料刮勺 | Corning | 3005 | 用于试剂的配制 |
| 三水合乙酸钠 EMPROVE | Sigma Aldrich | 1.28204 | 用于反应缓冲液的配制 |
| 无菌密封小瓶（1型玻璃） | Curium | TC-ELU-5 | 用于缓冲液、抗氧化剂及放射性标记溶液的最终分装 |
| 无菌管路组件 | ABX | RT-01-H | 用于[68Ga]Ga-3BP-3940的自动化合成 |
| 无菌冲洗用水 | B Braun | 0082479E | 用于制备薄层色谱检测的一种流动相 |
| 合成模块（GAIA） | Elysia-Raytest | - | 用于[68Ga]Ga-3BP-3940的自动化合成 |
| 注射器（1 mL，低死体积） | B Braun | 9166017V | 用于肽在缓冲液中的配制以及向0.9%氯化钠溶液中添加蛋氨酸 |
| 注射器（10 mL） | Becton Dickinson | 309649 | 用于0.9%氯化钠中蛋氨酸的配制和分装 |
| 注射器（3 mL） | Becton Dickinson | 309658 | 用于蛋氨酸和60%乙醇的配制和分装 |
| 薄层色谱展开槽 | Fisher Scientific | 50-212-281 | 用于放射化学纯度的薄层色谱检测 |
| 三氟乙酸（适用于高效液相色谱） | Sigma Aldrich | 302031-100ML | 用于放射化学纯度的高效液相色谱检测 |
| γ计数器用试管 | - | - | 用于半衰期和放射化学纯度测定的样品制备 |
| 超声波清洗仪 | Selecta | 3000683 | 用于已配制溶液的超声处理 |
| 载体分子（3BP-3940） | MedChemExpress | HY-P10131 | 待进行放射性标记的载体分子 |
| 带玻璃插件的高效液相色谱用小瓶 | Sigma Aldrich | 29385-U 和 SU860066 | 用于放射化学纯度的高效液相色谱检测 |
| 涡旋混合器 | VWR | 444-5900P | 用于搅拌已配制的溶液 |
| 用于高效液相色谱的水 | Sigma Aldrich | 34877-2.5L-M | 用于放射化学纯度的高效液相色谱检测 |
| 注射用水，10 mL 瓶装 | Aguettan | 34009 370 641 0 1 | 用于溶液的配制 |
参考文献
- Xiao, Y., Yu, D. Tumor microenvironment as a therapeutic target in cancer. Pharmacol Ther. 221, 107753(2021).
- Zhang, L., et al. Targets of tumor microenvironment for potential drug development. MedComm Oncol. 3 (1), e68(2024).
- Fouillet, J., Torch....
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