小鼠乳腺肿瘤来源的癌症相关成纤维细胞作为分子与计算研究的工具

摘要

本方案概述了培养、操作和分析小鼠CAFs的方法，包括 体外/体内 功能分析、转录组学和计算分析。此外，本文还描述了一个基于网络的平台，该平台旨在分析从一组人乳腺癌肿瘤中激光捕获显微切割分离的间质和上皮组分的公开转录组数据。

摘要

大量研究已证实肿瘤微环境（TME）在乳腺癌（BC）生长和侵袭性中的关键作用。癌症相关成纤维细胞（CAF）是TME中的主要细胞成分，通过与肿瘤细胞及其他基质细胞之间复杂的相互作用，在响应肿瘤来源的激活信号时显著影响TME的行为。小鼠模型被广泛用于研究CAF在乳腺癌进展中作用的潜在机制，因其可评估内源性TME以及通过同源异种移植研究来分析免疫系统的参与。本文介绍了一系列方法，用于培养来源于乳腺癌的CAF、调控基因表达，并通过体外（in vitro）和体内（in vivo）手段评估其促肿瘤功能。我们还描述了CAF基因表达谱和转录组分析的实验方案，以及一种利用公开的批量RNA测序（bulk RNA-seq）数据推断原发性肿瘤中转录特征的计算流程。此外，我们介绍了一种用户友好的基于网页的工具，用于分析激光捕获显微切割获得的乳腺癌肿瘤中基质和上皮组分的转录组。最终，这些方法可为驱动CAF-肿瘤相互作用的分子机制提供有价值的见解，并有望发现新的治疗靶点。

引言

乳腺癌（BC）是女性中最常见的恶性肿瘤，具有显著的分子异质性，不同的分子特征可指导诊断、治疗决策和预后评估。肿瘤微环境（TME）同样具有高度异质性，在肿瘤进展、免疫反应及治疗结局中发挥关键作用。

癌症相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤微环境（TME）中最丰富的细胞类型，也是肿瘤发展的关键调控因子。它们参与细胞外基质的沉积与重塑、血管生成、免疫逃逸以及耐药性^1,2,3,4,5,6。CAFs通过直接的细胞-细胞接触、释放细胞外囊泡⁷以及分泌多种可溶性因子^2,5，促进肿瘤生长、侵袭及治疗耐药^8,9,10。事实上，与间质相关的基因表达特征对乳腺癌（....

方案

本研究遵守所有关于小鼠操作和组织取样的机构指南。所有实验操作均遵循国家和国际法律法规及政策。小鼠饲养于温度22 °C、湿度50%、12小时光照/12小时黑暗循环的无特定病原体转基因动物房中，并可自由获取食物和饮水。ad libitum。手术操作必须遵循机构兽医指导，以确保在手术期间及术后阶段实施适当的麻醉和镇痛措施。材料表提供了本实验方案中所用材料、试剂和仪器的详细信息。

1. 细胞培养

1. 在 37 °C、5% CO₂、相对湿度 95% 的条件下培养细胞，培养基为 DMEM（HEK293T、CAFs 和永生化 CAFs (iCAFs)）或 RPMI 培养基（4T1），并添加 100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素（1% 青/链）。
   注意：完全培养基（cDMEM、cRPMI）成分为含 10% 热灭活胎牛血清（FBS）；饥饿培养基（sDMEM、sRPMI）成分不含 FBS。细胞平均倍增时间：HEK293T 和 iCAFs 为 24 小时；4T1 细胞为 12 小时。
2. 当细胞达到 80% 融合度时进行传代，传代比例不超过 1:5，解冻后传代次数不得超过 10 次，以避免表型漂移，具体操作如下：
   1. 吸除培养基，沿 100 mm 培养皿侧壁轻柔加入 7 mL PBS，随后吸除 PBS，加....

结果

体外 CAF活性评估
采用根据步骤3制备的永生化癌相关成纤维细胞（iCAFs），研究乳腺肿瘤来源的癌相关成纤维细胞（CAFs）对乳腺癌（BC）侵袭性特征的贡献。按照步骤6所述方法对iCAFs进行超激活处理，随后在sDMEM中饥饿培养以收集其条件培养基（CM），并将该CM用于处理4T1细胞48小时（见步骤7.1）。此处理之后进行 体外 功能实验 图1 结果显示，与对照组的无血清培养基（CTR）相比，经 s.a. iCAFs CM 处理后，4T1 细胞的增殖显著增强。这种增殖的增加通常在 24 小时内开始，并在随后的几天内持续上升。在这些实验中，至关重要的是在使用条件培养基（CM）处理前，优化接种细胞数量以及培养基中的血清百分比。s.a. iCAFs CM 还显著增强了 4T1 细胞的迁移和侵袭能力。经 CM 处理后，4T1 细胞的迁移能力提高了一倍，而在侵袭方面也观察到虽较温和但仍具有统计学意义的增加图1).......

讨论

本研究中，我们介绍了小鼠CAFs永生化的优化方案，以及对其促肿瘤活性的表征方法 体外 和 体内我们并未根据标志物表达选择性地分离特定的CAF亚型，而是选择保留整个细胞群体以维持其异质性。对细胞群体进行整体功能表征，并分析其基因表达谱以捕捉其多样性。由于原代CAF在衰老前可传代的次数有限，因此永生化CAF对该研究至关重要。通过该方法获得的永生化细胞为研究多种CAF介导的现象（包括化疗耐药性）提供了有价值的工具，因其能够用于探究CAF如何影响癌细胞对不同治疗方式的反应。永生化细胞易于进行遗传操作，使其在功能研究中尤为有用。然而，应当认识到永生化可能改变细胞的表型和活性，因此我们建议对永生化CAF与其原代对应细胞进行充分比较，并定期评估其生长速率及CAF标志物的表达水平。在基因沉默实验中，可考虑采用可诱导而非稳定的沉默策略，其中pLKO-tetON Puro载体较为适用。⁴³，而基于CRISPR的系统可用于基因敲除（pLenti-CRISPRv2）、基因干扰（CRISPRi，pLV-dCas9-KRAB）或基因激活（CRISPRa，pLV-dCas9-VP64.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1Kb plus DNA 标准分子量标记	ThermoFisher Scientific	10787018
24 孔板	Sarstedt	833922
96 孔板	Sarstedt	833924
乙酸	Sigma Aldrich	695092
AgeI-HF	New England Biolabs	R3552	储存于 -20 °C
聚维酮碘	Meda Pharma	23907076
Bürker 计数板	VWR	40443703
低温精细尖电灼器	Keeler	AX10339KL
离心机	Eppendorf	5810R
15 mL 锥形管	Sarstedt	62554502
50 mL 锥形管	Sarstedt	62547254
Cryopure 2 mL 微量离心管	Sarstedt	72380992
结晶紫	Sigma Aldrich	C0775	室温储存，在通风橱中使用
100 mm 直径培养皿	Sarstedt	833902
60 mm 直径培养皿	Sarstedt	833920
ddH2O	自制		室温储存，在生物安全柜中使用
数显卡尺	Preciva	02-301-2
数码显微镜	Leica	DM6B
二甲基亚砜	Sigma Aldrich	D8418	在生物安全柜中使用
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 (DMEM)	Gibco	11965092	4 °C 储存，在生物安全柜中使用
EcoRI-HF	New England Biolabs	R3101	储存于 -20 °C
乙二胺四乙酸 (EDTA)	Sigma Aldrich	E6758	室温储存，在生物安全柜中使用
胎牛血清 (FBS)	Gibco	16000044	4 °C 储存，在生物安全柜中使用
10 µL 滤芯吸头	Sarstedt	703010255
100 µL 滤芯吸头	Sarstedt	703030255
1000 µL 滤芯吸头	Sarstedt	703060255
20 µL 滤芯吸头	Sarstedt	703030265
200 µL 滤芯吸头	Sarstedt	703031255
Filtropur S Plus 0.20 µm	Sarstedt	831826102
Filtropur S Plus 0.45 µm	Sarstedt	831826
精细剪刀	2Biol	1406009
镊子	2Biol	1102412
遗传霉素	Gibco	10131035	4 °C 储存，在生物安全柜中使用
Lipofectamine 2000 转染试剂	ThermoFisher Scientific	11668019	4 °C 储存，在生物安全柜中使用
含 8 μm PET 膜的 Matrigel 侵袭小室	Corning	354480
酶标仪（600 nm 吸光度）	Promega	GM3500
1.5 mL 微量离心管	Sarstedt	7269001
Opti-MEM 培养基	Gibco	31985047	4 °C 储存，在生物安全柜中使用
多聚甲醛 (PFA)	Sigma Aldrich	158127	室温储存，在通风橱中使用
pBABE-neo largeTcDNA	Addgene	1780	储存于 -20 °C，在生物安全柜中使用
pCL-Ampho	Novus Biological	18746853	储存于 -20 °C，在生物安全柜中使用
pCMV-R8.74	Addgene	22036	储存于 -20 °C，在生物安全柜中使用
pCMV-VSVG	Addgene	8454	储存于 -20 °C，在生物安全柜中使用
青霉素-链霉素（Pen Strepto，10,000 μg/mL）	Gibco	15140122	4 °C 储存，在生物安全柜中使用
相差显微镜	Olympus	BX42
磷酸盐缓冲液 (PBS)	自制		室温储存，在生物安全柜中使用
pLKO.1-Puro	Addgene	10878	储存于 -20 °C，在生物安全柜中使用
聚-L-赖氨酸溶液	Sigma Aldrich	P8920	4 °C 储存，在生物安全柜中使用
来自 Streptomyces alboniger 的嘌呤霉素二盐酸盐	Sigma Aldrich	P8833
rCutSmart 缓冲液	New England Biolabs	B6004	储存于 -20 °C
啮齿类动物剃毛器	Aesculap	GT416
Roswell Park Memorial Institute 培养基 (RPMI)	Gibco	61870010	4 °C 储存，在生物安全柜中使用
圆头吸水棉签	Sigma Aldrich	Z744127
手术刀	Gima	27041
Secura 半微量电子天平	Sartorius	SECURA125-1S
10 mL 血清移液管	Sarstedt	861254001
2 mL 血清移液管	Sarstedt	861252001
25 mL 血清移液管	Sarstedt	861256001
5 mL 血清移液管	Sarstedt	861253001
5-0 缝合线	Ethicon	1866G
10 mL 注射器	Pentaferte	00202250E14
5 mL 注射器	Pentaferte	00202250E12
Omnican 胰岛素注射器 1 mL	Braun	9151125S
组织粘合剂	3M Vetbond	1469SB
Transwell 小室，8 µm 孔径	Falcon	353097
Transwell Matrigel 小室，8 µm 孔径	Corning	354480
胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红	Gibco	15400054
Vivaspin 20 离心浓缩管，截留分子量 10,000 Da	Sigma Aldrich	Z614602