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方法文章

来自小鼠乳腺肿瘤的癌症相关成纤维细胞作为分子和计算研究的工具

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DOI：

10.3791/68364

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2025年7月3日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Human Technopole, 3Department of Science and Technological Innovation, University of Piemonte Orientale

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

该协议概述了培养、作和分析小鼠 CAFs 的方法，包括 体外/体内 功能测定、转录组学和计算分析。此外，它还描述了一个基于 Web 的平台，该平台用于分析来自人类乳腺癌肿瘤集合的激光捕获显微解剖基质和上皮成分的公开可用转录组。

摘要

一项令人信服的研究证实了肿瘤微环境 （TME） 在乳腺癌 （BC） 的生长和侵袭性中的关键作用。癌症相关成纤维细胞 （CAF） 是 TME 的主要细胞成分，通过与癌症和其他基质细胞的复杂串扰响应肿瘤来源的激活信号，显着影响其行为。小鼠模型被广泛用于研究 CAF 在 BC 进展中作用的潜在机制，因为它们允许使用同基因异种移植研究评估内源性 TME 和评估免疫系统参与。在这里，我们提出了一组使用 体外 和 体内 方法培养 BC 衍生的 CAFs、纵基因表达和评估其促肿瘤功能的方法。我们还描述了 CAF 基因表达谱和转录组学分析的方案，以及使用公开可用的批量 RNA-seq 数据推断原发性肿瘤转录特征的计算程序。此外，我们介绍了一种用户友好的、基于 Web 的工具，用于分析激光捕获显微解剖 BC 肿瘤的基质和上皮成分的转录组。最终，这些方法可以为驱动 CAF-肿瘤相互作用的分子机制提供有价值的见解，并具有确定新治疗靶点的潜力。

引言

乳腺癌 （BC） 是影响女性的最常见恶性肿瘤，其特征是显著的分子异质性，具有不同的分子特征指导诊断、治疗决策和预后。肿瘤微环境 （TME） 也具有高度异质性，在肿瘤进展、免疫和治疗结果中起着关键作用。

癌症相关成纤维细胞 （CAF） 是 TME 中最丰富的细胞类型，也是肿瘤发展的关键调节因子。它们有助于细胞外基质沉积和重塑、血管生成、免疫逃逸和耐药性 1,2,3,4,5,6。CAF 通过直接细胞间接触、细胞外囊泡的释放7 和各种可溶性因子的分泌 2,5 影响肿瘤细胞，以促进肿瘤生长、侵袭和治疗耐药性 8,9,10。事实上，基质相关基因特征对 BC 进展和治疗反应具有预测价值，并且与化疗耐药性相关 11,12,13,14。然而，尽管大量证据表明 CAFs 是一个有吸引力的治疗靶点，但针对这些细胞的临床试验在很大程度上失败了15。一个主要挑战是对 CAF 调节肿瘤行为的分子机制的理解有限。单细胞和空间转录组学分析的最新进展为深入了解 BC 中 CAF 的复杂性16、17、18、19、20、21，能够识别具有特定功能程序的不同 CAF 亚型16,22 并进一步突出它们的复杂性和可塑性23。

基因工程小鼠模型 （GEMM） 中的癌基因或肿瘤抑制基因过表达或失活，是研究人类癌症的成熟模型 24,25,26,27。与涉及在野生型小鼠中移植肿瘤细胞的同基因模型23,28 相比，GEMM 更准确地模拟了 BC 的多步进展以及癌细胞与 TME 之间的相互作用。然而，由于 CAF 的异质性，在 GEMM 中纵 CAF 的活性一直具有挑战性，这使得很难靶向所有 CAF 亚型，而不会对其他基质或上皮成分产生脱靶效应5。将 GEMM 与互补方法（例如体外 CAF作）相结合，可以帮助生成用于体外和体内功能丧失实验的细胞模型。然而，由于衰老的快速开始，开发稳定的细胞模型以探索特定基因的功能作用仍然具有挑战性。

在这里，我们描述了一个强大的平台，用于在 CAFs 中进行稳定的功能丧失实验，然后进行工程细胞的功能 体外 和 体内 分析以及转录分析;这种方法为剖析乳腺癌中 CAF 表达基因的功能相关性提供了一种全面的策略，与现有方法相比，在特异性、可重复性和适应性方面具有优势。这种方法还得到了一种基于网络的新型工具的补充，用于探索人类乳腺肿瘤激光捕获显微解剖基质和上皮区室的转录组，从而实现跨物种比较并促进从人类数据中生成假设。

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方案

本研究符合有关小鼠处理和组织采样的所有机构指南。所有程序均根据国家和国际法律和政策执行。将小鼠饲养在无特异性病原体的转基因单元中，在 22 °C、50% 湿度下进行 12 小时的光照/黑暗循环，并 随意提供食物和水。外科手术必须遵循机构兽医的指示，以确保在手术期间和术后进行适当的麻醉和镇痛。 材料表 提供了有关本协议中使用的材料、试剂和仪器的详细信息。

1. 细胞培养

  1. 在 37 °C 下，在 5% CO2 气氛和 95% 相对湿度下，在 DMEM（HEK293T、CAF 和永生化 CAF （iCAF））或 RPMI 培养基 （4T1） 中培养细胞，补充有 100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素（1% Pen/Strepto）。
    注：完全培养基（cDMEM、cRPMI）成分：10% 热灭活 FBS，饥饿培养基（sDMEM、sRPMI）成分：无 FBS。细胞的平均倍增时间：HEK293T 和 iCAF 为 24 小时;4T1 细胞为 12 小时。
  2. 当达到 80% 汇合时，以不超过 1：5 的比例传代细胞，解冻后绝不超过 10 次，以避免表型漂移，如下所述。
    1. 吸出培养基，并在 100 mm 培养皿的侧面轻轻加入 7 mL PBS。吸出 PBS，加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA。在 37 °C 下孵育 2-3 分钟。
      注意：EDTA 被列为刺激眼睛的 2 类危险化合物。佩戴适当的 PPE 在生物/通风橱中处理。
    2. 用 5 mL cDMEM 灭活胰蛋白酶-EDTA，通过上下吹打分离细胞，并收集到 15 mL 锥形管中。以 290 x g 离心 5 分钟。
    3. 小心去除上清液，并将细胞沉淀重悬于 5 mL cDMEM 中。对于 1：5 分裂，将 1 mL 重悬细胞接种在含有 9 mL cDMEM 的 100 mm 培养皿中。
  3. 细胞计数：将步骤 1.2.3 中的 10 μL 细胞悬液加载到 Neubauer 计数室的侧面，在大方块中计数细胞，然后将获得的数字乘以 1 x 104 ，计算出 1 mL 细胞悬液中所含的细胞数。
  4. 冻存：将 50% 的 100 mm 培养皿（约 3 x 106 个细胞）冷冻在 0.5 mL 冰冷的冻存培养基（10% DMSO 在热灭活的 FBS 中），如下所述。
    1. 从 100 mm 培养皿中，按照步骤 1.2.1 和 1.2.2 中的说明对细胞进行胰蛋白酶消化，除了将细胞重悬于 1 mL 冰冷的冷冻培养基中。
    2. 在每个冻存管中分配 0.5 mL，并在 -80 °C 下置于容器中，确保冷却速率约为 1 °C/min。每个等分试样都可以在 100 mm 培养皿中解冻。
  5. 支原体污染试验：收集 1 mL 培养至少 3 天的融合细胞生长培养基。在 95 °C 下煮沸 20 分钟。在室温 （RT） 下以 16200 x g 离心 5 分钟。将 5 μL 上清液添加到 45 μL PCR 反应混合物（0.15 mM dNTP、1.5 mM MgCl2、1x 反应缓冲液、1 U Taq 聚合酶、0.5 μM 引物 A 和 B，见 表 1）中。进行 PCR，包括阳性和阴性对照，并在 1% 琼脂糖凝胶和 DNA 分子量标准上分离 PCR 产物。支原体污染的样品将显示 600 bp 的条带。

2. CAF 从乳腺肿瘤中分离

注意：此步骤针对直径为 5-10 mm 的晚期肿瘤进行了优化（参见参考文献29 ）。

  1. 通过颈椎脱位牺牲小鼠。分离至少 125 mm 的乳腺肿瘤3.小心切除肿瘤，去除周围皮肤、乳腺组织和可见的坏死区域。使用镊子，收集在置于冰上的 1.5 mL 微管中。
  2. 用精密天平称取肿瘤，用手术刀切除 0.1-0.3 g 的立方块，转移至装满冰冷 PBS 的新 1.5 mL 微管中，并保持在冰上。确保组织浸没以避免脱水。
  3. 转移到直径为 60 mm 的培养皿中，放在冰上。用手术刀在 1 mL 的 PBS 中细碎，直到获得大约 1-2 毫米的碎片。
  4. 转移到 15 mL 锥形管中，每 0.1 g 肿瘤中含有 5 mL 的 cDMEM 和 10 μg/mL 胶原酶。用 1 mL 相同培养基冲洗培养皿，使用带有切割尖端的 P1000 移液器，以避免细胞损伤。用密封膜固定盖子，以免泄漏。
  5. 在 37 °C 下在轨道振荡器上水平孵育 1 小时。将 70 μm 细胞过滤器放在 50 mL 锥形管的顶部，并使用 10 mL 血清移液管转移匀浆。使用 5 mL 注射器柱塞的背面研磨并将样品推入过滤器。
  6. 使用 cDMEM（最终体积不超过 30 mL）从过滤器中回收所有物质。在 4 °C 下以 129 x g 旋转细胞 10 分钟，弃去上清液。
  7. 加入 3 mL 氯化铵钾 （ACK） 裂解缓冲液以去除红细胞 （RBC）。盖紧试管并倒置混合。在 RT 下在轨道振荡器上孵育 5 分钟。
  8. 通过添加 PBS 至终体积为 30 mL 来终止 RBC 裂解。在 4 °C 下以 129 x g 旋转细胞 10 分钟，弃去上清液。
  9. 将细胞沉淀重悬于 1 mL cDMEM 中，并按照步骤 1.3 使用 10 μL 亚甲蓝对活细胞进行计数：活细胞将染料还原为无色产物并变得未染色，而死细胞则染成蓝色。
  10. 在 5 mL cDMEM 中接种 5 x 10个 5 个细胞/60 mm 培养皿，在 37 °C 和 5% CO2 气氛中孵育 20 分钟，收集非贴壁细胞，并重新接种过夜。
  11. 48 小时或 72 小时后，进行差异胰蛋白酶消化。由于成纤维细胞比上皮细胞和肌上皮细胞30 分离得更快，因此请按照步骤 1.2 中的说明进行。但在显微镜下密切监测细胞脱离。成纤维细胞形状的细胞会变成圆形并分离，而上皮细胞仍然附着。
  12. 添加 cDMEM 以灭活胰蛋白酶并收集分离的 CAF，将它们转移到装有 5 mL cDMEM 的新 60 mm 培养皿中。以 1：3 的比例传代初级 CAF（参见步骤 1.2）进行 3 次传代，然后按照步骤 1.4 中的说明准备早期传代冷冻等分试样。

3. 通过病毒转导永生化

注：以下一些步骤必须在适合处理逆转录病毒载体（例如 BSL2+）的环境中进行;检查您的机构规则。

  1. 重组病毒的制备
    1. HEK293T细胞培养并检查支原体污染（参见步骤 1）。
    2. 在 RT 下移液 6 mL 0.1 mg/mL 聚-L-赖氨酸在 ddH2O 溶液中 5 分钟，包被直径为 100 mm 的培养皿，吸出，并在通风橱下晾干（约 10 分钟）。
    3. 在步骤 3.1.2 中，将 3 x 106 个 HEK293T 细胞（低传代，支原体阴性）接种在聚-L-赖氨酸包被培养皿中的 10 mL cDMEM 中（参见步骤 1.3）。
    4. 第二天，准备两支含有 0.75 mL 无抗生素转染优化培养基的试管。向其中一个中加入 30 μL 阳离子脂质体介导的转染试剂 （T1）。向第二个中加入 2 μg pCL-Ampho（逆转录病毒包装载体）和 2 μg 逆转录病毒 pBABE-neo largeT cDNA 载体 （T2）。将 T2 添加到 T1 中，轻轻混匀，孵育 10 分钟。
    5. 用不含抗生素的转染优化培养基 + 10% 热灭活 FBS 替换培养基后，将培养基均匀分布在细胞上。将板移至生物安全 2+ 级 （BSL-2+） 组织培养设施。6-12 小时后用 cDMEM 替换培养基，并将细胞孵育 24-48 小时。
    6. 通过 0.45 μm 注射器过滤器过滤含有假病毒颗粒的培养基，并在 4 °C 下储存几天或在 -80 °C 下长期储存。
  2. CAF 的病毒转导
    1. 在 4 mL cDMEM 中的两个 60 mm 培养皿中分别接种 7.5 x 105 个 CAF（参见步骤 1.3），并按照步骤 1.1 进行培养。
    2. 第二天，用步骤 3.1.6（转导的 CAF）中的 2 mL 含假病毒的培养基替换一个培养皿的培养基，加入 2 mL cDMEM，孵育 24 小时。保持另一个盘子不动（未转导的 CAF）。
    3. 第二天，在转导的 CAF 上重复步骤 3.2.2。24 小时后，用 4 mL cDMEM 替换两个培养皿的培养基。
    4. 再过 24 小时后，通过用补充有 400 μg/mL G418 的 cDMEM 替换两个培养皿的培养基来开始选择。每 2-3 天更换一次含 G418 的培养基，直到未转导的 CAF 的对照培养皿中没有活细胞。
      注：未转导的细胞对 G418 敏感，会在 7-10 天内死亡，表明只有 G418 抗性转导的细胞才能在转导的 CAFs 条件下存活。必须确定每种细胞类型的最佳抗生素浓度，执行杀伤曲线（测试 50 至 1000 μg/mL G418 浓度的范围 7-10 天，并选择在 10 天内杀死所有细胞的剂量）。
    5. 在退出 BSL 设施之前，以 1：3 的比例将选定的转导细胞传代 2 次（参见步骤 1.2）。如步骤 1.4 所示，准备早期传代的冷冻保存等分试样。
    6. 验证细胞是否继续增殖，几次传代未显示衰老表型，并继续进行表型和功能表征（参见步骤 4 和 6-9）。

4. 表型特征

注：CAF 标志物，如 α 平滑肌肌动蛋白 （α-SMA）、小窝蛋白、成纤维细胞活化蛋白 （FAP）、N-钙粘蛋白、血小板衍生生长因子 β （PDGFR-β）、S100A4 和波形蛋白29 可以通过 RT-qPCR 和 Western Blot 进行评估。

  1. RT-qPCR：如参考文献15 所述，使用苯酚和异硫氰酸胍的单相溶液提取总 RNA。按照制造商的反应条件说明，在 20 μL 的体积中逆转录 2 μg 总 RNA。按照制造商的说明，以 1：20 的比例稀释 cDNA，并使用 3 μL 进行 RT-qPCR 反应（引物见表 1）。
    注：我们建议从 12 孔培养皿中制备 RNA。
  2. 蛋白质印迹
    1. 如步骤 1.2.1 所述用 PBS 洗涤 2 次，加入 0.2 mL 冰冷的裂解缓冲液，用刮刀分离细胞，然后按照29 中的说明将它们收集在 1.5 mL 微管中。在冰上放置 20 分钟。
    2. 将样品在 4 °C 下以 16,000 x g 旋转 10 分钟，然后收集上清液。根据制造商的说明通过比色测定法定量蛋白质。使用至少 20 μg 蛋白质进行 Western 印迹（抗体见 表 2 ）。
      注：我们建议在培养皿中制备不少于 6 个孔的蛋白质。
  3. 分泌蛋白分析
    1. 将 2 x 10个 6 个 iCAF（参见步骤 1.3）接种在 10 mm 直径的培养皿中，放入 10 mL 的 cDMEM 中，并按照步骤 1.1 中的说明进行培养。
    2. 24 小时后，去除培养基，用 10 mL PBS 洗涤 2 次，并与 10 mL sDMEM 孵育 48 小时（参见步骤 1.1）以生成条件培养基 （CM）。
    3. 再过 48 小时后，通过 0.2 μm 注射器过滤器将 CM 过滤到 15 mL 锥形管中。紧紧握住注射器和试管，并准备好应对一些阻力。CM 可在 -80 °C 下储存长达 6 个月。
    4. 根据制造商的说明，使用蛋白质浓缩器将 CM 浓缩约 10 倍，以生成浓缩的 CM （conCM）。定量 conCM，煮沸并进行 Western Blot（抗体见 表 2 ）。

5. 基因敲低分析

注：为了稳定干扰基因表达，我们用表达专门设计的 shRNA 的慢病毒颗粒转导 iCAFs。这些可以通过在合适的慢病毒载体（如 pLKO.1-Puro）中克隆靶向序列来获得，遵循 https://www.addgene.org/protocols/plko/#C 上可用的方案。可以使用公开可用的 shRNA 设计工具（即 Broad Institute 的 GPP-Genetic Perturbation Portal，https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/）选择特定的靶向序列。或者，市售的预制靶向载体集（https://en.vectorbuilder.com/products-services/service/shrna-knockdown-solutions.html、https://www.sigmaaldrich.com/IT/it/technical-documents/technical-article/genomics/gene-expression-and-silencing/mission-shrna-getting-started https://www.origene.com/products/rnai/shrna-lentiviral-particles）。我们建议针对每个基因设计 4-5 种不同的 shRNA，并选择最好的 2 种进行实验。还生成非靶向载体作为阴性对照。必须在适合处理 HIV 衍生病毒（例如 BSL2+）的环境中采取以下一些步骤。检查您的机构规则。

  1. 慢病毒颗粒的产生
    1. 按照步骤 3.1.1-3.1.3 接种 3 x 106 HEK293T 个细胞。第二天，按照步骤 3.1.4 中分别使用 9 μg 和 3 μg 包装载体 pCMV-R8.74 和 pCMV-VSVG 以及 7 μg 含 shRNA 的 pLKO.1 构建体在 0.75 mL 无抗生素转染优化培养基中制备阳离子脂质体介导的转染试剂-DNA 复合物，并按照步骤 3.1.5 和 3.1.6 中的说明进行。
  2. CAFs 转导
    1. 如步骤 3.2.1、3.2.2 和 3.2.4 中所述感染细胞。24 小时后，去除感染培养基并开始在 cDMEM 中使用 2 μg/mL 嘌呤霉素进行筛选。参见步骤 3.2.5 中的注释以确定最佳浓度。
    2. 48 小时后更换嘌呤霉素/cDMEM。选择通常在 3 天内完成。如步骤 3.2.6 所示扩展并冻结单元格。如步骤 4.1 所述，通过 RT-PCR 和 Western blot 评估敲低效率。和 4.2.

6. 来自肿瘤细胞的 CM 的 iCAFs 的超级激活

注：以下步骤说明了 iCAFs 促肿瘤活性的 体外 表征方法。如下所述，通过将 CAFs 与来自小鼠 BC 肿瘤细胞的 CM 孵育（超级激活，s.a.）可以增强 CAFs 的促肿瘤活性。

  1. 如步骤 1.3 所述计数 4T1 小鼠 BC 细胞，并在直径为 100 mm 的培养皿中接种 2 x 106 个细胞，溶于 10 mL cRPMI（参见步骤 1.1）。
  2. 24 小时后，去除培养基，用 10 mL PBS 洗涤 2 次，并与 10 mL sRPMI 孵育 48 小时（参见步骤 1.1）以生成 CM。
  3. 第二天，在 10 mm 直径的培养皿上接种 2 x 10个 6 个 iCAF，在 10 mL 的 cDMEM 中（参见步骤 1.3），并按照步骤 1.1 中的说明进行培养。如步骤 4.3.3 所示，通过 0.2 μm 注射器过滤器将 CM 过滤到 15 ml 锥形管中。
  4. 超级激活 （s.a.）：从 iCAFs 培养皿中取出培养基，用 10 mL PBS 洗涤 2 次，然后加入过滤后的 4T1 CM （8-10 mL）。孵育 48 小时以获得 s.a. iCAFs。

7. 肿瘤细胞增殖

  1. 用 iCAFs CM 预处理 4T1 细胞 48 小时，如步骤 4.3.1、4.3.2、4.3.3 制备。
  2. 用胰蛋白酶消化并计数，然后按照步骤 1.3 所述在 100 μL cRPMI 中接种 4 x 10个 96 孔板的 3 个细胞/孔，并按照步骤 1.1 进行培养。板技术一式三份。
    1. 每天准备一个 96 孔板的时间过程。此处建议的细胞数量针对 4 天方案进行了优化;按比例缩小可延长其时间。
  3. 4 小时后或细胞附着后立即去除培养基，轻轻加入 100 μL 用 PBS 洗涤，注意不要将尖端靠在孔边缘，使用多通道移液器并使用无菌储液器。去除 PBS，然后同样添加 100 μL sDMEM（对照）或 iCAF CM，均补充有 2% 热灭活的 FBS（参见步骤 4.3.1、4.3.2、4.3.3）。
  4. 4 小时后，如第 7.5 点所述停止第 0 天板。对于其他时间点，每隔一天更换一次培养基，直到实验结束。
  5. 为了评估细胞密度，从培养箱中取出 96 孔板，并用 100 μL PBS 洗涤孔 2 次，如步骤 7.3 所述。
  6. 在通风橱下，向每个孔中加入 100 μL 4% 多聚甲醛 （PFA），并在室温下固定细胞 10 分钟。
    注意：PFA 会导致严重的眼睛损伤和皮肤刺激;吞咽和吸入有害，怀疑会导致遗传缺陷和癌症。在通风橱中穿着适当的个人防护装备 （PPE） 进行作。
  7. 如步骤 7.3 所示，用 100 μL PBS 洗涤 3 次，然后在通风橱下干燥（约 10 分钟）。
  8. 在 RT 下与 50 μL 0.1% 结晶紫的 20% 甲醇溶液孵育 10 分钟。
    注意：结晶紫可造成严重的眼睛损伤，据报道，它是口服急性毒性的 4 类危险，是致癌物的 2 类危险。在通风橱中穿着适当的 PPE 处理它。
  9. 用 100 μL ddH2O 洗涤 3 次，清空孔，然后在吸收垫或纸巾上轻敲板以完全去除液体。
  10. 在 RT 下将结晶紫溶解在 100 μL 10% 乙酸中 15 分钟，并在酶标仪中测量 600 nm 波长下的光密度 （OD），使用 100 μL 10% 乙酸作为空白。根据每个条件，将当天的 O.D. 标准化为 0。

8. 迁移和入侵

  1. 将 700 μL 补充有 1% 热灭活 FBS、1% Pen/Strepto 的 DMEM 移液到 24 孔板的孔中。在每个孔中放置一个 8 μm 孔的 transwell 插入物，用生物活性基质包被（侵袭）或不涂覆（迁移）。将板留在培养箱中，在37°C下平衡，同时如步骤1.3所示收集和计数4T1细胞。
  2. 如步骤 4.3.1、4.3.2 和 4.3.3 所示，使用 1 mL 的 5 mM EDTA 代替胰蛋白酶-EDTA，从直径为 100 mm 的培养皿中分离用 iCAFs CM 预处理 48 小时的 4T1 细胞。
  3. 加入 5 mL cDMEM，在 15 mL 锥形管中收获细胞，然后按照步骤 1.2 离心沉淀。在 sDMEM 中重悬细胞，按照步骤 1.3 计数，并稀释至 1 x 105 个细胞/100 μL。
  4. 将 100 μL 细胞悬液添加到 transwell 的上腔室中。作为铺板对照，在 500 μL cDMEM 的 24 孔板中接种 100 μL 细胞。孵育 16 小时（迁移）或 24 小时（侵袭），然后如下所述停止实验。
    注意：如果使用不同的细胞，则必须根据经验确定孵育时间。
  5. 用细记号笔标记其上侧的插入物，然后将它们浸入装满 PBS 的 50 mL 锥形管中，以便使用镊子进行洗涤。用棉签仔细清洁 transwell 的内部。
  6. 在通风橱下，将样品在 700 μL 4% PFA 中在 RT 下孵育 10 分钟（参见步骤 7.6）。
  7. 用 700 μL PBS 洗涤 3 次，然后在引擎盖下晾干（约 10 分钟）。在 RT 下，将插入片段与 700 μL 0.1% 结晶紫的 20% 甲醇溶液孵育 10 分钟（参见步骤 6.10）。
  8. 清洗小室 3 次，使用镊子将它们浸入填充有 ddH2O 的 50 mL 锥形管中。用棉签仔细清洁 transwell 的内部。将样品储存在 RT 中，并在 3 天后拍照。
  9. 使用相差显微镜，用 10 倍物镜对大部分孔表面进行成像，然后用 20 倍物镜从 5 个独立区域采集照片。
  10. 将结晶紫溶解在 10% 乙酸中，如下所示：对于孔，加入 100 μL 乙酸，并在 RT 下在轨道振荡器上混合 10 分钟;对于 transwell，将它们放在长凳上，下表面朝上，在表面上沉积 50 μL 乙酸，并通过移液混合直到结晶紫完全溶解。
  11. 使用 50 μL 上述步骤中溶解的材料，在 96 孔板中读取 600 nm 处的吸光度。用 10% 乙酸作为空白。
  12. 从步骤 8.5 中归一化电镀控制的光密度 （OD），并表示相对于对照条件的迁移或侵袭。

9. 原发性肿瘤生长和肺转移形成

注意：以下步骤说明了 CAFs 促肿瘤活性的 体内 表征方法。此步骤经过优化，可通过在同基因小鼠模型中共注射来评估 CAFs 的体内 促肿瘤特征。由于 CAFs 和 4T1 细胞都来自 BALB/c 小鼠背景，因此使用 BALB/c 小鼠。

  1. 注射前 2 天，用金属 ID 耳标对 6 周龄雌性 BALB/c 小鼠进行编号，并用剃须刀剃除第 4 乳腺区域。
  2. 收集并计数 4T1 细胞和 s.a. iCAF，如步骤 6 中所述制备。在 15 mL 锥形管中，混合 1 x 10个 5 4T1 细胞和 3 x 10个 5 s.a. iCAF/小鼠，考虑至少 20% 的过量。仅使用 4T1 作为对照。
  3. 以 290 x g 离心 5 分钟，重悬于计算出的 PBS 体积中，以获得上述 50 μL 细胞/小鼠数量，转移到 1.5 mL 微管中，并保持在冰上。
    注：例如，要注射 10 只小鼠，将 1.2 x 106 4T1 细胞与 3.6 x 106 sa. iCAF 混合，沉淀细胞，并重悬于 600 μL PBS 中。每只小鼠注射 50 μL 细胞悬液。
  4. 通过清洁和消毒层流罩的表面来准备工作区域。用长凳保护板覆盖泡沫手术板。
  5. 根据机构程序，一次麻醉一只小鼠（我们使用腹膜内注射替利他明碱/唑拉西泮碱 + 甲苯噻嗪 70 mg / kg + 5 mg / kg）。在眼睛上涂抹兽用药膏以防止干燥。使用棉签，用聚维酮碘溶液对皮肤进行消毒。
  6. 使用脚趾捏试验以确保小鼠处于适当的麻醉状态。用皮下注射针头，将 50 μL 细胞悬液注射到第 4 个 乳腺脂肪垫中。以为参考，向同侧腿注射约 3 毫米。
  7. 注射后和接下来的几天内检查小鼠。4 天后肿瘤变得可触及。
  8. 用卡尺每 48 小时测量一次肿瘤大小，确定最大和最小直径。使用以下公式计算肿瘤体积：（长度 x 宽度2）/2。
  9. 注射 10 天后，如下所述手术切除原发性肿瘤。
    1. 按照步骤 9.5 准备手术区域。通过高压灭菌对工具进行消毒，并在工作时将其放置在无菌表面上。使用热珠灭菌器对动物之间的工具进行灭菌。
    2. 按照步骤 9.6 和 9.7 麻醉小鼠。使用手术刀刀片，在靠近肿瘤的地方做一个 5-8 毫米的切口，轻轻地将皮肤拉开，形成一个小口袋来进入肿瘤。用低温烧灼笔烧灼任何可见的血管，以避免解剖时出血。
    3. 使用手术刀切除肿瘤，尽量不要去除任何皮肤。将皮瓣放回原位，用 5-0 手术线和 17 毫米 1/2c 针将它们缝合在一起，并添加手术胶以完全密封伤口。
    4. 在小鼠恢复足够的意识以维持胸骨卧位之前，不要让它们无人看管。接受手术的动物在完全康复之前不会送回其他动物的陪伴处。
  10. 根据机构规程，在手术后和接下来的几天里，如有必要，进行镇痛治疗。我们使用卡洛芬皮下注射 （3-5 mg/kg）。
  11. 如步骤 2.2 所示，使用精密天平称量肿瘤。使用手术刀将肿瘤切成两半。将一半放入 1.5 mL 微管中，在液氮中快速冷冻，并储存在 -80 °C 用于分子分析。将另一半在 5 mL 4% PFA 中固定在 15 mL 锥形管中，在 4 °C 下 24 小时用于组织学分析。
  12. 在注射后第 21 天，通过 CO2 暴露处死小鼠，并在气管内输注 4% PFA 时收集肺，如下所述。在通风橱下工作。
    1. 使用手术剪刀打开胸腔。去除下颌下区域和唾液腺的皮肤，以清楚地暴露气管。
    2. 准备一个含有 4% PFA 溶液的 22G 针头注射器。将针头插入小鼠气管，将其指向肺部，同时将气管夹向头部。注射溶液直至肺部肿胀（约 2 mL）。
    3. 解剖肺部并将其放入含有 15% PFA 溶液的 4 mL 试管中。轻轻倒置试管几次，并使其在 4 °C 下固定 24 小时。
  13. 进行肺部的半连续切片，并用苏木精和伊红 （H&E） 染色，每 50/100 μm 一片，直到标本耗尽，如参考文献31 所述。
  14. 通过软件引导对 H&E 染色切片的显微照片分析对转移进行评分。

10. 基因表达特征

  1. 定义基因特征，如下所述。
    1. 根据实验环境和所研究的特定生物学问题，通过多种方式获得基因特征。最常见的是，评估两种情况（例如，CAFs 与正常对应物，或以多种方式治疗（例如，超级激活或沉默）与未治疗）之间的差异表达。
    2. 或者，在分析的样本中鉴定表达最可变或信息量最大的基因（例如，主成分分析的第一组分具有高方差或高负载的基因）。这里，我们将以 STAT3 监管的签名为例。该特征被定义为在 BC CAFs29 中沉默 STAT3 后下调的基因，如下所述。有关 RNA 测序的全面描述，请参见参考文献32,33。
  2. 如步骤 4.1.1 所示，从每个样品中一式三份提取总 RNA，并评估 RNA 质量以检查 RNA 完整性 （RIN ≥ 9）。
  3. 从 2 μg poly（A） 选择的 RNA 中制备文库并对其进行测序。我们使用了NextSeq 500平台。
  4. 使用 TopHat v2.0 将读取映射到 Mus musculus mm9 参考程序集。1034.
  5. 使用 HTSeq 软件包 （http://www.huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html） 中的 htseq-count 工具计算基因计数。
  6. 使用 R 和 DESeq2 软件包 （http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/DESeq2.html） 进行差异表达分析。过滤 FDR < 0.05 的下调基因以定义 STAT3 特征。

11. 特征在原发性肿瘤中的表达估计

注：以下步骤描述了在 BC 原发肿瘤的公开转录组学数据中计算估计 STAT3 调节特征29 的表达的程序，测试其与同一组样本中估计的基质比例的关系。

  1. 安装 R （https://cran.r-project.org/） 和 RStudio （https://posit.co/products/open-source/rstudio/）。启动它并安装所需的库：GSVA35、TCGAbiolinks36。
  2. 下载原代肿瘤基因表达数据，例如来自 https://portal.gdc.cancer.gov/ 的 TCGA 数据、来自 http://synapse.org/ （syn1757063） 的 METABRIC 数据，或来自基因表达综合 （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/） 的其他转录组数据作为预归一化表达矩阵。数据必须格式化为数值矩阵，其中行为基因，列为样本，并根据平台进行标准化，并使用偏移量 1 进行对数缩放。
    1. https://www.ensembl.org/biomart/martview/ 从 Biomart 下载小鼠-人类基因直系同源物列表，选择数据库：ensembl genes，选择人类基因数据集，然后单击左侧选项卡中的属性选择。
    2. 从预先选择的特征中，打开 EXTERNAL 选项卡并标记 HGNC 符号，在页面顶部的框中选择 Homologues ，然后标记 Mouse orthodugues / Mouse gene name。
    3. 点击 结果 左上角的按钮，选择 CSV 格式，然后单击 GO 按钮下载文件。
  3. 在 R 中加载基因表达特征（一组基因）。在这种情况下，我们使用小鼠 CAF 中 STAT3 沉默后下调的基因列表。
  4. 在 R 中加载小鼠-人类基因直系同源物列表，并通过 Biomart 表将 STAT3 特征映射到相应的人类直系同源物。
  5. 在 R 中加载原发性肿瘤基因表达数据，并使用参数调用 GSVA 函数作为 ssgseaParam 对象，包括原发性肿瘤数据和包含 STAT3 签名的列表。

12. 测试基因特征表达与临床特征之间的关系

  1. 确定感兴趣的变量。基质百分比表示测序肿瘤样本中属于肿瘤基质的细胞比例。使用以下通常与组学数据相关的临床特征：肿瘤大小、分期、患者诊断年龄、淋巴结状态、转移状态等。预先计算的基质百分比估计可用于 TCGA。
    注：具体来说，可用的基质估计值为：EDec 免疫/基质 = 基质/免疫百分比37 的表观基因组反卷积;免疫评分 = ssGSEA 基于 141 个免疫基因的基因表达谱38;LUMP = 纯度白细胞去甲基化，平均 44 个非甲基化免疫特异性 CpG 位点39;基质评分 = 基于 141 个基质基因的基因表达谱的 ssGSEA38;IHC = 通过对全国儿童医院生物样本核心资源40 生成的苏木精和伊红染色载玻片进行图像分析估计;ABSOLUTE = 基于体细胞拷贝数数据41.
  2. 从 TCGAbiolinks 下载 http://genboree.org/theCommons/documents/569 的 EDEc 数据、https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/disease.html 的基质和免疫评分 （RNASeqV2） 以及肿瘤纯度数据（LUMP、IHC、ABSOLUTE）。对于其他数据集，计算使用 GSVA 包的基质百分比，计算从 Yoshihara 等人那里获得的基质和免疫特征的 ssGSEA38。
  3. 计算估计基质比例的数字向量与原发肿瘤样本中 STAT3 特征表达的数字向量之间的相关性。这可以通过 R 中的 cor.test 函数来实现。
  4. 将与原发肿瘤的转录组数据集相关的临床数据下载为表格，样本为行，临床特征为列。
  5. 在 R 中加载临床数据，并检查转录组学矩阵和元数据表中的样本是否与匹配函数的顺序相同。
  6. 对于数字变量（例如，肿瘤大小），使用 cor.test 函数计算原发肿瘤样本中 STAT3 特征表达的数字向量与临床特征值向量之间的相关性。
  7. 对于分类变量（例如，转移状态），使用非参数 Wilcoxon 秩和检验（假设两组样本是独立的）测试两组样本（例如，转移性与非转移性肿瘤）之间 STAT3 特征表达的差异。这可以通过 R 中的 wilcox.test 函数来实现。

13. 测试特征在肿瘤基质中的调节

注意：通过批量 RNA 测序分析的原发性肿瘤中基质特征的表达具有依赖于具有详细临床注释的大型患者队列的优势。另一方面，与正常组织相比，只有分离基质和上皮才能定义肿瘤中两个细胞区室中任何一个的基因表达变化42。MetaLCM 是一款 ShinyApp，有助于分析激光捕获显微解剖乳腺肿瘤的转录组数据集。通过该工具，用户可以在激光捕获显微解剖乳腺肿瘤的转录组数据集中搜索两种情况之间稳健的差异表达基因，并测试肿瘤基质中先前定义的基因特征的调控。以下步骤介绍如何使用 MetaLCM。

  1. 通过链接 https://aurorasavino.shinyapps.io/metalcm/ 访问该应用程序。要开始分析，请选择比较条件的特征。
  2. 选择比较的方向。通过选择上调的基因，显示了在条件 1 中表达较高的基因。
  3. 选择差异表达式的 p 值阈值，然后按 Run 运行以运行分析，每次更改设置时都会更改。
  4. 要将分析限制为预定义的基因列表，请键入以逗号分隔的基因符号，或导入在一列中包含基因符号的 CSV 文件。
  5. 按 Submit gene list （提交基因列表 ） 导入基因符号。按 Reset 以恢复使用所有基因的分析。保存差异表达基因列表：当提供基因列表时，仅对这些基因进行多重检测校正。该表包括每个可用数据集中差异表达的平均 logFC、折叠 p 值以及单个 logFC 和 p 值。
  6. 绘制具有差异表达基因的倍数变化的热图。热图仅显示差异表达基因，以及数据集之间差异表达的完全一致的标志。

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结果

CAF 活性的体外评估
使用根据步骤 3 生成的永生化 CAF （iCAF） 研究乳腺肿瘤来源的癌症相关成纤维细胞 （CAF） 对乳腺癌 （BC） 侵袭性特征的贡献。如步骤 6 中所述，iCAFs 被超级激活，然后在 sDMEM 中饥饿以收集其 CM，用于处理 4T1 细胞 48 小时（参见步骤 7.1）。该处理之后进行 体外 功能测定。 图 1 显示，与对照饥饿培养基 （CTR） ?...

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讨论

在这项研究中，我们提出了小鼠 CAFs 永生化及其体外和体内促肿瘤活性表征的优化方案。我们没有根据标志物表达选择性地分离特定的 CAF 亚型，而是选择保留整个细胞群以保持异质性。将细胞作为一个整体进行功能表征，并分析其基因表达谱以捕获其多样性。由于原发性 CAFs 在衰老之前可以经历的传代次数有限，因此使 CAFs 永生化对于这项研究至关重要。?...

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披露

作者声明没有利益冲突。

致谢

这项工作得到了意大利癌症研究协会 （AIRC， IG16930 and IG24851 to VP） 的支持;意大利大学与研究部（MIUR PRIN 2017 和 2022 年获得 VP）;列支敦士登 Truus 和 Gerrit van Riemsdijk 基金会，向 VP 捐款;皮埃蒙特地区（偏转）。A.S. 得到了意大利癌症研究基金会 （FIRC） 博士后奖学金的支持，L.A. 得到了 Fondazione Umberto Veronesi 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1Kb 加 DNA 分子量标准品赛默飞世尔科技10787018
24孔板萨斯泰特833922
96孔板萨斯泰特833924
醋酸西格玛·奥尔迪奇695092
AgeI-HF型新英格兰生物实验室R3552储存在-20度;C
甜菜碱 Betadine美达制药23907076
Bürker 计数室 大众40443703
烧灼低温 FineTip Disp基勒AX10339KL
离心机埃彭多夫5810R型
锥形管 15 mL萨斯泰特62554502
锥形管 50 mL萨斯泰特62547254
Cryopure 2 mL 微管萨斯泰特72380992
水晶紫西格玛·奥尔迪奇C0775储存在 RT，在通风柜中使用 
培养板直径100mm 萨斯泰特833902
培养板直径60mm 萨斯泰特833920
ddH20自制在室温储存，在生物罩中使用
数显卡尺普雷西瓦02-301-2
数码显微镜徕卡DM6B型
二甲基亚砜西格玛·奥尔迪奇D8418在生物罩中使用
杜尔贝科's 改装鹰's 培养基 （DMEM）吉布科11965092储存在 4 度;C、在生物罩中使用
EcoRI-HF型新英格兰生物实验室R3101型储存在-20度;C
乙二胺四乙酸 （EDTA）西格玛·奥尔迪奇E6758在室温储存，在生物罩中使用
胎牛血清 （FBS）吉布科16000044储存在 4 度;C、在生物罩中使用
过滤吸头 10 和微;L萨斯泰特703010255
过滤吸头 100 & micro;L萨斯泰特703030255
过滤吸头 1000 和微;L萨斯泰特703060255
过滤吸头 20 & micro;L萨斯泰特703030265
过滤吸头 200 & micro;L萨斯泰特703031255
Filtropur S Plus 0,20 & 微;m 萨斯泰特831826102
Filtropur S Plus 0,45 & 微;m 萨斯泰特831826
细剪刀2生物1406009
镊子2生物1102412
遗传素吉布科10131035储存在 4 度;C、在生物罩中使用
Lipofectamine 2000 转染试剂赛默飞世尔科技11668019储存在 4 度;C、在生物罩中使用
基质胶入侵室，有 8 &m PET膜 康宁354480
酶标仪（吸光度 600 nm）普罗梅加通用3500型
微管 1.5 mL 萨斯泰特7269001
Optimem吉布科31985047储存在 4 度;C、在生物罩中使用
多聚甲醛 （PFA）西格玛·奥尔迪奇158127储存在 RT，在通风橱中使用
pBABE-neo 大TcDNA 阿德基因1780储存在-20度;C、在生物罩中使用
pCL-安福诺沃斯生物 18746853储存在-20度;C、在生物罩中使用
pCMV-R8.74 型阿德基因22036储存在-20度;C、在生物罩中使用
pCMV-VSVG 阿德基因8454储存在-20度;C、在生物罩中使用
青霉素-链霉素（Pen Strepto，10,000 &g/mL） 吉布科15140122储存在 4 度;C、在生物罩中使用
相差显微镜 奥林巴斯 BX42型
磷酸盐缓冲盐水 （公共广播公司）自制在室温储存，在生物罩中使用
pLKO.1-Puro 阿德基因10878储存在-20度;C、在生物罩中使用
聚-L-赖氨酸溶液西格玛·奥尔迪奇P8920储存在 4 度;C、在生物罩中使用
嘌呤霉素二盐酸盐来自 白骨链霉菌 Streptomyces alboniger西格玛·奥尔迪奇第 8833 号
rCutSmart 缓冲液 新英格兰生物实验室B6004型储存在-20度;C
啮齿动物剃须刀埃斯库拉普GT416型
罗斯威尔公园纪念研究所 （RPMI）吉布科61870010储存在 4 度;C、在生物罩中使用
圆头口渴拭子西格玛·奥尔迪奇Z744127
手术刀吉马27041
Secura 半微量天平缝纫机SECURA125-1S
血清移液器 10 mL 萨斯泰特861254001
血清移液器 2 mL 萨斯泰特861252001
血清移液器 25 mL 萨斯泰特861256001
血清移液器 5 mL 萨斯泰特861253001
缝合 5-0艾西康1866克
注射器 10 mL五费尔特00202250E14
注射器 5 mL五费尔特00202250E12
注射器 Omnican 胰岛素 1 mL布 劳 恩9151125S
组织 adesive3M 维特邦德1469SB的
Transwell 插入物 8 和微;m 孔 隼353097
Transwell 基质胶插入物 8 & micro;m 孔 康宁354480
胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红吉布科15400054
Vivaspin 20 离心浓缩机 MWCO 10,000 Da 西格玛·奥尔迪奇Z614602

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