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方法文章

小鼠乳腺肿瘤来源的癌症相关成纤维细胞作为分子与计算研究的工具

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DOI：

10.3791/68364

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2025年7月3日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Human Technopole, 3Department of Science and Technological Innovation, University of Piemonte Orientale

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案概述了培养、操作和分析小鼠CAFs的方法，包括 体外/体内 功能分析、转录组学和计算分析。此外，本文还描述了一个基于网络的平台，该平台旨在分析从一组人乳腺癌肿瘤中激光捕获显微切割分离的间质和上皮组分的公开转录组数据。

摘要

大量研究已证实肿瘤微环境（TME）在乳腺癌（BC）生长和侵袭性中的关键作用。癌症相关成纤维细胞（CAF）是TME中的主要细胞成分，通过与肿瘤细胞及其他基质细胞之间复杂的相互作用，在响应肿瘤来源的激活信号时显著影响TME的行为。小鼠模型被广泛用于研究CAF在乳腺癌进展中作用的潜在机制，因其可评估内源性TME以及通过同源异种移植研究来分析免疫系统的参与。本文介绍了一系列方法，用于培养来源于乳腺癌的CAF、调控基因表达，并通过体外（in vitro）和体内（in vivo）手段评估其促肿瘤功能。我们还描述了CAF基因表达谱和转录组分析的实验方案，以及一种利用公开的批量RNA测序（bulk RNA-seq）数据推断原发性肿瘤中转录特征的计算流程。此外，我们介绍了一种用户友好的基于网页的工具，用于分析激光捕获显微切割获得的乳腺癌肿瘤中基质和上皮组分的转录组。最终，这些方法可为驱动CAF-肿瘤相互作用的分子机制提供有价值的见解，并有望发现新的治疗靶点。

引言

乳腺癌（BC）是女性中最常见的恶性肿瘤，具有显著的分子异质性，不同的分子特征可指导诊断、治疗决策和预后评估。肿瘤微环境（TME）同样具有高度异质性，在肿瘤进展、免疫反应及治疗结局中发挥关键作用。

癌症相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤微环境（TME）中最丰富的细胞类型，也是肿瘤发展的关键调控因子。它们参与细胞外基质的沉积与重塑、血管生成、免疫逃逸以及耐药性1,2,3,4,5,6。CAFs通过直接的细胞-细胞接触、释放细胞外囊泡7以及分泌多种可溶性因子2,5，促进肿瘤生长、侵袭及治疗耐药8,9,10。事实上，与间质相关的基因表达特征对乳腺癌（BC）的进展和治疗反应具有预测价值，并与化疗耐药相关11,12,13,14。然而，尽管有大量证据表明CAFs是颇具潜力的治疗靶点，但针对这些细胞的临床试验大多未能成功15。其中一个主要挑战在于对CAFs调控肿瘤行为的分子机制仍了解有限。近年来，单细胞和空间转录组分析技术的进步加深了人们对乳腺癌中CAFs复杂性的认识16,17,18,19,20,21，使得研究人员能够鉴定出具有特定功能程序的不同CAF亚型16,22，进一步凸显了其异质性与可塑性23。

基因工程小鼠模型（GEMMs）是研究人类癌症的成熟模型，其中癌基因或肿瘤抑制基因被过表达或失活24,25,26,27与将肿瘤细胞移植到野生型小鼠体内的同系模型相比23,28，GEMMs 能更准确地模拟乳腺癌的多步骤进展过程以及癌细胞与肿瘤微环境之间的相互作用。然而，由于 CAFs 具有异质性，难以在不产生对其他间质或上皮成分脱靶效应的情况下靶向所有 CAF 亚型，因此在 GEMMs 中调控 CAFs 活性的操作颇具挑战性5结合GEMMs与互补性方法，例如 体外 CAF 操作可用于生成细胞模型，以开展功能缺失实验 体外 和 体内 然而，由于细胞衰老迅速发生，建立用于研究特定基因功能作用的稳定细胞模型仍然具有挑战性。

在此，我们介绍一种在CAFs中进行稳定基因功能缺失实验的可靠平台，随后进行功能分析 体外 和 体内 对工程化细胞进行分析和转录谱检测；该方法为解析癌相关成纤维细胞（CAF）表达基因在乳腺癌中的功能相关性提供了全面的策略，在特异性、可重复性和适应性方面优于现有方法。该方法还结合了一种新型的基于网络的工具，用于探索来自人类乳腺肿瘤的激光捕获显微切割间质和上皮组分的转录组，支持跨物种比较，并有助于从人类数据中生成科学假设。

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方案

本研究遵守所有关于小鼠操作和组织取样的机构指南。所有实验操作均遵循国家和国际法律法规及政策。小鼠饲养于温度22 °C、湿度50%、12小时光照/12小时黑暗循环的无特定病原体转基因动物房中，并可自由获取食物和饮水。ad libitum。手术操作必须遵循机构兽医指导，以确保在手术期间及术后阶段实施适当的麻醉和镇痛措施。材料表提供了本实验方案中所用材料、试剂和仪器的详细信息。

1. 细胞培养

  1. 在 37 °C、5% CO2、相对湿度 95% 的条件下培养细胞，培养基为 DMEM（HEK293T、CAFs 和永生化 CAFs (iCAFs)）或 RPMI 培养基（4T1），并添加 100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素（1% 青/链）。
    注意：完全培养基（cDMEM、cRPMI）成分为含 10% 热灭活胎牛血清（FBS）；饥饿培养基（sDMEM、sRPMI）成分不含 FBS。细胞平均倍增时间：HEK293T 和 iCAFs 为 24 小时；4T1 细胞为 12 小时。
  2. 当细胞达到 80% 融合度时进行传代，传代比例不超过 1:5，解冻后传代次数不得超过 10 次，以避免表型漂移，具体操作如下：
    1. 吸除培养基，沿 100 mm 培养皿侧壁轻柔加入 7 mL PBS，随后吸除 PBS，加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA。在 37 °C 下孵育 2–3 分钟。
      注意：EDTA 被列为对眼睛有刺激性的 2 类危险化合物。操作时应在生物安全柜或通风橱中，并佩戴适当的个人防护装备（PPE）。
    2. 用 5 mL 完全 DMEM（cDMEM）终止胰蛋白酶-EDTA 的作用，通过吹打使细胞脱落，并收集至 15 mL 圆底离心管中。以 290 × g 离心 5 分钟。
    3. 小心吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 5 mL cDMEM 中。按 1:5 比例分种时，取 1 mL 重悬细胞接种至含 9 mL cDMEM 的 100 mm 培养皿中。
  3. 细胞计数：取步骤 1.2.3 所得细胞悬液 10 µL，从侧面加入牛鲍计数板，计数大方格内的细胞数，将所得数值乘以 1 × 104，即可计算出 1 mL 细胞悬液中的细胞数量。
  4. 细胞冻存：将一个 100 mm 培养皿中约 50% 的细胞（约 3 × 106 个细胞）重悬于 0.5 mL 冰冷冻存液（含 10% DMSO 的热灭活 FBS）中进行冻存，操作如下：
    1. 从一个 100 mm 培养皿中按步骤 1.2.1 和 1.2.2 所述方法消化细胞，但将细胞重悬于 1 mL 冰冷冻存液中。
    2. 每支冻存管分装 0.5 mL，置于确保降温速率为约 1 °C/min 的容器中，于 -80 °C 保存。每份样品解冻后可用于一个 100 mm 培养皿的培养。
  5. 支原体污染检测：收集至少培养 3 天的融合状态细胞的 1 mL 培养上清液，95 °C 煮沸 20 分钟，室温下以 16200 × g 离心 5 分钟。取 5 µL 上清液加入含 45 µL PCR 反应混合液（0.15 mM dNTPs、1.5 mM MgCl2、1× 反应缓冲液、1 U Taq 聚合酶、0.5 µM 引物 A 和 B，参见 表 1）的 PCR 管中。进行 PCR 扩增，并设置阳性和阴性对照，将 PCR 产物与 DNA 分子量标记物一同在 1% 琼脂糖凝胶中电泳分离。受支原体污染的样本将出现 600 bp 的条带。

2. 从乳腺肿瘤中分离CAFs

注意：此步骤适用于直径为 5-10 mm 的晚期肿瘤（参见参考文献29）。

  1. 通过颈椎脱位处死小鼠。分离体积至少为 125 mm3 的乳腺肿瘤。小心切除肿瘤，去除周围皮肤、乳腺组织及可见的坏死区域。使用镊子将组织收集至置于冰上的 1.5 mL 微管中。
  2. 用精密天平称量肿瘤，用手术刀切取 0.1–0.3 g 的立方体组织块，转移至装有预冷 PBS 的新 1.5 mL 微管中，并置于冰上保存。确保组织完全浸没在液体中以防止脱水。
  3. 将组织转移至直径 60 mm 的培养皿中（置于冰上），用手术刀在 1 mL PBS 中精细切割，直至获得约 1–2 mm 大小的组织碎片。
  4. 将组织转移至含有 5 mL cDMEM（每 0.1 g 肿瘤组织）加 10 µg/mL 胶原酶的 15 mL 圆锥形离心管中。用移液枪（P1000）配合切去尖端的枪头吸取 1 mL 相同培养基冲洗培养皿，以避免细胞损伤。用封口膜密封管盖，防止泄漏。
  5. 在 37 °C 水平摇床上孵育 1 小时。将 70 µm 细胞滤网置于 50 mL 圆锥形离心管上，用 10 mL 血清移液管将消化液转移至滤网上。用 5 mL 注射器活塞背面研磨并推动样品通过滤网。
  6. 用 cDMEM（最终体积不超过 30 mL）冲洗滤网以回收全部细胞悬液。在 4 °C 下以 129 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。
  7. 加入 3 mL 氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液以去除红细胞（RBC）。 tightly 封闭离心管，通过倒置混匀。在室温下置于水平摇床上孵育 5 分钟。
  8. 加入 PBS 至终体积 30 mL 以终止红细胞裂解反应。在 4 °C 下以 129 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。
  9. 将细胞沉淀重悬于 1 mL cDMEM 中，并按照步骤 1.3 的方法使用 10 µL 台盼蓝染液计数活细胞：活细胞可将染料还原为无色产物而不着色，死细胞则呈蓝色染色。
  10. 将 5 × 105 个细胞接种至 60 mm 培养皿中，加入 5 mL cDMEM，于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 20 分钟，收集未贴壁细胞，并重新接种培养过夜。
  11. 48 小时或 72 小时后进行差异胰酶消化。由于成纤维细胞比上皮细胞和肌上皮细胞脱落更快30，操作步骤参照步骤 1.2，但在显微镜下密切观察细胞脱落情况。成纤维细胞形态的细胞会变圆并脱落，而上皮细胞仍保持贴壁状态。
  12. 加入 cDMEM 以中和胰酶活性，收集脱落的 CAFs，并将其转移至含 5 mL cDMEM 的新 60 mm 培养皿中。将原代 CAFs 按 1:3 比例传代（见步骤 1.2），连续传代三次后，按步骤 1.4 所述制备早期代次的冻存分装样本。

通过病毒转导实现永生化

注意：以下某些步骤必须在适合处理逆转录病毒载体的环境中进行（例如 BSL2+）；请查阅您所在机构的相关规定。

  1. 重组病毒的制备
    1. 培养 HEK293T 细胞，并检测支原体污染（见步骤 1）。
    2. 在室温下，用移液枪向直径 100 mm 的培养皿中加入 6 mL 浓度为 0.1 mg/mL 的聚-L-赖氨酸 ddH2O 溶液，孵育 5 分钟，吸除溶液后在通风橱中晾干（约 10 分钟）。
    3. 在步骤 3.1.2 中已包被聚-L-赖氨酸的培养皿中，接种 3 × 106 个 HEK293T 细胞（低代次、无支原体污染），加入 10 mL cDMEM 培养基（见步骤 1.3）。
    4. 次日，准备两个离心管，每管加入 0.75 mL 无抗生素的转染优化培养基。向其中一管加入 30 µL 阳离子脂质介导的转染试剂（T1）；向另一管加入 2 µg pCL-Ampho（逆转录病毒包装载体）和 2 µg 逆转录病毒 pBABE-neo largeT cDNA 载体（T2）。将 T2 加入 T1 中，轻轻混匀，室温孵育 10 分钟。
    5. 将细胞培养基更换为无抗生素的转染优化培养基 + 10% 热灭活 FBS，然后将转染混合物均匀滴加至细胞表面。将培养皿转移至生物安全二级以上（BSL-2+）细胞培养设施中。6–12 小时后更换为 cDMEM 培养基，继续培养 24–48 小时。
    6. 用 0.45 µm 注射器滤器过滤含有假病毒颗粒的培养上清，短期可保存于 4 °C 数天，长期保存则置于 -80 °C。
  2. 成纤维细胞的病毒转导
    1. 在两个 60 mm 培养皿中各接种 7.5 × 105 个 CAFs，每皿加入 4 mL cDMEM 培养基（见步骤 1.3），培养条件同步骤 1.1。
    2. 次日，将其中一个培养皿中的培养基更换为 2 mL 来自步骤 3.1.6 的含假病毒的培养上清（转导组 CAFs），再加入 2 mL cDMEM，继续培养 24 小时；另一个培养皿不做处理（未转导组 CAFs）。
    3. 再过一天后，对转导组 CAFs 重复步骤 3.2.2。24 小时后，将两个培养皿的培养基均更换为 4 mL cDMEM。
    4. 再过 24 小时后，开始筛选：将两个培养皿的培养基更换为含 400 µg/mL G418 的 cDMEM。每 2–3 天更换一次含 G418 的培养基，直至未转导 CAFs 的对照皿中无活细胞残留。
      注：未转导的细胞对 G418 敏感，通常在 7–10 天内死亡，表明只有转导后获得 G418 抗性的细胞能在转导组中存活。每种细胞类型的最适抗生素浓度需通过杀灭曲线实验确定（测试 50 至 1000 µg/mL 范围内的 G418 浓度，持续 7–10 天，选择可在 10 天内完全杀死所有细胞的浓度）。
    5. 在离开 BSL 设施前，将筛选出的转导细胞以 1:3 比例传代两次（见步骤 1.2）。按照步骤 1.4 的方法制备早期代次的冻存样本。
    6. 确认细胞在多次传代后仍能持续增殖且未表现出衰老表型，随后进行表型与功能鉴定（见步骤 4 和步骤 6–9）。

4. 表型鉴定

注意：成纤维细胞活化蛋白（CAF）标志物，如α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、小窝蛋白（caveolin）、成纤维细胞激活蛋白（FAP）、N-钙黏蛋白、血小板源性生长因子受体β (PDGFR-β)、S100A4 和波形蛋白29，可通过RT-qPCR和蛋白质印迹法（Western Blot）进行检测。

  1. RT-qPCR：按照参考文献15所述方法，使用苯酚与异硫氰酸胍的单相溶液提取总RNA。取2 µg总RNA，在20 µL反应体系中进行逆转录，具体反应条件遵循试剂盒说明书。将cDNA稀释1:20后，取3 µL用于进行RT-qPCR反应，操作步骤遵循试剂盒说明书（引物信息见表1）。
    注意：建议从12孔板中制备RNA。
  2. Western blot
    1. 按照步骤1.2.1所述方法用PBS洗涤2次，加入0.2 mL预冷的裂解缓冲液，用细胞刮刀刮下细胞，并按文献29所述收集至1.5 mL微量离心管中。冰上孵育20分钟。
    2. 在4 °C、16,000 x g 条件下离心10分钟，收集上清液。根据试剂盒说明书采用比色法测定蛋白浓度。每份Western blot样品至少使用20 µg蛋白（抗体信息见表2）。
      注意：建议从不少于6个孔的培养板中收集蛋白样品。
  3. 分泌蛋白分析
    1. 在10 mL cDMEM培养基中，将2 × 106个iCAFs（见步骤1.3）接种于直径100 mm的培养皿中，并按照步骤1.1所述条件进行培养。
    2. 24小时后，弃去培养基，用10 mL PBS洗涤2次，随后加入10 mL sDMEM（见步骤1.1）继续培养48小时，以收集条件培养基（CM）。
    3. 再经过48小时后，将CM通过0.2 µm注射器滤器过滤至15 mL锥形管中。操作时需握紧注射器和离心管，注意可能遇到一定阻力。CM可在-80 °C保存最多6个月。
    4. 根据试剂盒说明书，使用蛋白浓缩装置将CM浓缩约10倍，获得浓缩条件培养基（conCM）。对conCM进行蛋白定量，煮沸后进行Western blot检测（抗体信息见表2）。

5. 基因敲低分析

注意：为了稳定干扰基因表达，我们使用表达特异性设计的shRNA的慢病毒颗粒转导iCAF。这些慢病毒颗粒可通过将靶向序列克隆到合适的慢病毒载体（如pLKO.1-Puro）中获得，具体操作可参考Addgene网站提供的方案： https://www.addgene.org/protocols/plko/#C。特异性靶向序列可利用公开的shRNA设计工具进行选择（例如Broad研究所的GPP遗传干扰门户，https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/）。此外，也可商业购买预制的靶向载体套装（https://en.vectorbuilder.com/products-services/service/shrna-knockdown-solutions.html，https://www.sigmaaldrich.com/IT/it/technical-documents/technical-article/genomics/gene-expression-and-silencing/mission-shrna-getting-started，https://www.origene.com/products/rnai/shrna-lentiviral-particles）。我们建议针对每个基因设计4-5种不同的shRNA，并从中筛选出效果最佳的2种用于实验。同时应构建非靶向载体作为阴性对照。以下部分操作必须在适合处理HIV衍生病毒的环境中进行（例如BSL2+级别实验室）。请遵循所在机构的相关规定。

  1. 慢病毒颗粒的制备
    1. 按照步骤 3.1.1–3.1.3 的方法接种 3 × 106 个 HEK293T 细胞。次日，按照步骤 3.1.4 的方法制备阳离子脂质介导的转染试剂-DNA 复合物，其中分别使用 9 µg 和 3 µg 的包装质粒 pCMV-R8.74 与 pCMV-VSVG，以及 7 µg 含 shRNA 的 pLKO.1 载体，溶于 0.75 mL 无抗生素的优化转染培养基中，随后按步骤 3.1.5 和 3.1.6 所述进行操作。
  2. CAFs 的转导
    1. 按照步骤 3.2.1、3.2.2 和 3.2.4 所述方法感染细胞。感染 24 小时后，移除感染培养基，并在 cDMEM 中加入 2 µg/mL 嘌呤霉素开始筛选。最佳浓度的确定方法见步骤 3.2.5 的注释。
    2. 48 小时后更换含嘌呤霉素的 cDMEM。通常在 3 天内完成筛选。随后按照步骤 3.2.6 扩增并冻存细胞。通过 RT-PCR 和 Western blot 检测敲低效率，方法见步骤 4.1 和 4.2。

6. 使用肿瘤细胞条件培养基超激活iCAF

注意：以下步骤说明了相关方法的 体外 iCAFs促肿瘤活性的表征。CAFs的促肿瘤活性可通过与小鼠乳腺癌肿瘤细胞的条件培养基（CM）共孵育而增强（即超级激活，s.a.），如下所述。

  1. 按照步骤1.3所述计数4T1小鼠乳腺癌细胞，并将2 × 106个细胞接种至直径100 mm的培养皿中，加入10 mL cRPMI（见步骤1.1）。
  2. 24小时后，吸除培养基，用10 mL PBS洗涤两次，然后加入10 mL sRPMI（见步骤1.1）继续培养48小时，以制备条件培养基（CM）。
  3. 次日，将2 × 106个iCAFs细胞接种至直径100 mm的培养皿中，加入10 mL cDMEM（见步骤1.3），并按照步骤1.1所述条件进行培养。随后，参照步骤4.3.3，将CM通过0.2 µm注射器滤器过滤至15 mL锥形管中。
  4. 超级激活（s.a.）：吸除iCAFs培养皿中的培养基，用10 mL PBS洗涤两次，加入过滤后的4T1条件培养基（8–10 mL），继续孵育48小时，获得超级激活的iCAFs（s.a. iCAFs）。

7. 肿瘤细胞增殖

  1. 用步骤 4.3.1、4.3.2、4.3.3 中制备的 iCAF 条件培养基（CM）对 4T1 细胞进行 48 小时的预处理。
  2. 用胰酶消化并计数，然后按照步骤 1.3 的描述，在 96 孔板中每孔接种 4 × 103 个细胞，每孔体积为 100 µL cRPMI，并按步骤 1.1 进行培养。每个技术重复设三个复孔。
    1. 为时间进程中的每一天准备一块 96 孔板。此处建议的细胞数量适用于 4 天的实验方案；若实验时间更长，则应相应减少接种量。
  3. 4 小时后，或细胞一旦贴壁，立即移除培养基，用 PBS 轻轻洗涤，使用多通道移液器和无菌储液槽，沿孔边缘小心加入 100 µL PBS，避免移液枪头接触细胞导致其脱落。吸除 PBS 后，同样加入 100 µL sDMEM（对照）或 iCAF 条件培养基（CM），两种培养基均补充 2% 热灭活 FBS（见步骤 4.3.1、4.3.2、4.3.3）。
  4. 4 小时后，按照步骤 7.5 的描述终止第 0 天的培养板。对于其他时间点，在整个实验期间每隔一天更换一次培养基。
  5. 为评估细胞密度，将 96 孔板从培养箱中取出，按照步骤 7.3 的描述，用 100 µL PBS 洗涤各孔 2 次。
  6. 在通风橱中，向每孔加入 100 µL 4% 多聚甲醛（PFA），在室温下固定细胞 10 分钟。
    注意：PFA 可引起严重的眼损伤和皮肤刺激；吞咽或吸入有害，且可能引起遗传缺陷和致癌。操作时必须在通风橱中进行，并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。
  7. 按照步骤 7.3 用 100 µL PBS 洗涤 3 次，并在通风橱中静置晾干（约 10 分钟）。
  8. 在室温下，加入 50 µL 含 0.1% 结晶紫的 20% 甲醇溶液，孵育 10 分钟。
    注意：结晶紫可引起严重的眼损伤，被列为口服急性毒性第 4 类危害物，以及致癌性第 2 类危害物。操作时必须在通风橱中进行，并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。
  9. 用 100 µL ddH2O 洗涤 3 次，吸除孔内液体后，将板轻轻拍打在吸水纸或纸巾上，彻底去除残留液体。
  10. 加入 100 µL 10% 乙酸溶解结晶紫，在室温下孵育 15 分钟，然后使用酶标仪在 600 nm 波长下测定吸光度（O.D.），以 100 µL 10% 乙酸作为空白对照。将当天各条件下的 O.D. 值归一化至 0。

8. 迁移与侵袭

  1. 用移液器将700 µL添加了1%热灭活FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM加入24孔板的孔中。将8 µm孔径的Transwell小室（用于侵袭实验的需包被生物活性基质，迁移实验则无需包被）放入各孔中。将24孔板置于37 °C培养箱中平衡，同时按照步骤1.3收集并计数4T1细胞。
  2. 使用1 mL 5 mM EDTA（而非胰蛋白酶-EDTA）按照步骤4.3.1、4.3.2和4.3.3的方法，从直径100 mm的培养皿中解离经iCAFs条件培养基预处理48 h的4T1细胞。
  3. 加入5 mL完全DMEM（cDMEM），将细胞收集至15 mL锥形管中，并按照步骤1.2的条件离心成团。用无血清DMEM（sDMEM）重悬细胞，按步骤1.3进行计数，并稀释至1 × 105 个细胞/100 µL。
  4. 将100 µL细胞悬液加入Transwell上室。作为铺板对照，将100 µL细胞悬液接种于24孔板中，每孔加入500 µL cDMEM。孵育16 h（迁移实验）或24 h（侵袭实验），然后按以下方法终止实验。
    注意：若使用其他细胞系，孵育时间需根据经验确定。
  5. 用细头记号笔在Transwell小室上表面标记，然后用镊子将其浸入盛有PBS的50 mL锥形管中清洗。用棉签小心擦去Transwell内侧的细胞。
  6. 在通风橱内，将样品在700 µL 4%多聚甲醛（PFA）中室温孵育10 min（参见步骤7.6）。
  7. 用700 µL PBS洗涤3次，通风橱内晾干（约10 min）。将小室置于700 µL 含0.1%结晶紫的20%甲醇溶液中，室温染色10 min（参见步骤6.10）。
  8. 用镊子将小室浸入盛有ddH2O的50 mL锥形管中，洗涤3次。用棉签小心擦去Transwell内侧残留染料。样品可在室温下保存，并在最多3天内拍照记录。
  9. 使用相差显微镜，先用10倍物镜拍摄一张覆盖大部分小室表面的图像，然后用20倍物镜在5个独立区域拍摄图像。
  10. 按以下方法溶解结晶紫：对于24孔板，每孔加入100 µL乙酸，在摇床上室温震荡混合10 min；对于Transwell小室，将其下表面朝上放置于实验台，滴加50 µL乙酸于膜表面，通过移液吹打混合，直至结晶紫完全溶解。
  11. 取上述溶解液50 µL加入96孔板，于600 nm波长处测定吸光度。以10%乙酸作为空白对照。
  12. 以步骤8.5中的铺板对照吸光度（O.D.）进行归一化处理，将迁移或侵袭能力以相对于对照组的相对值表示。

9. 原发性肿瘤生长及肺转移形成

注意：以下步骤说明了对癌相关成纤维细胞（CAF）促肿瘤活性进行体内表征的方法。该步骤通过在同源小鼠模型中共同注射来优化，以评估CAF的体内促肿瘤特性。由于CAF和4T1细胞均来源于BALB/c小鼠背景，因此使用BALB/c小鼠。

  1. 注射前2天，使用金属ID耳标对6周龄雌性BALB/c小鼠进行编号，并剃除4th 使用剃须刀剃除乳腺区域的毛发。
  2. 收集并计数按步骤6所述制备的4T1细胞和s.a. iCAFs。在15 mL锥形管中，混合1 × 10⁶5 4T1 细胞和 3 × 105 s.a. iCAFs/小鼠，需考虑至少20%的过量。仅将4T1用作对照。
  3. 以 290 x g 离心 g 5分钟，重悬于适量PBS中，使每50 µL含有上述数量的细胞/小鼠，转移至1.5 mL离心管中，冰上保存。
    注意：例如，若要注射10只小鼠，则混合1.2 x 106 4T1 细胞，3.6 x 106 s.a. iCAFs、沉淀细胞，并用600 µL PBS重悬。每只小鼠注射50 µL细胞悬液。
  4. 通过清洁和消毒超净工作台表面来准备操作区域。在泡沫手术板上覆盖实验台保护膜。
  5. 依次对小鼠进行麻醉，具体操作遵循机构规程（我们采用腹腔注射替来他明碱/唑拉西泮碱 + 赛拉嗪，剂量为 70 mg/kg + 5 mg/kg）。在小鼠眼部涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。使用棉签蘸取聚维酮碘溶液对皮肤进行消毒。
  6. 使用足趾夹捏试验确保小鼠已处于适当的麻醉状态。用皮下注射针将50 µL细胞悬液注入4th 乳腺脂肪垫。以乳头为参照，向同侧腿部方向注射约3毫米。
  7. 注射后数小时内及随后几天内观察小鼠状况。肿瘤在4天后可触及。
  8. 每48小时使用游标卡尺测量一次肿瘤大小，测定其最大直径和最小直径。采用以下公式计算肿瘤体积：（长度 × 宽度）2)/2.
  9. 注射10天后，按照下述方法手术切除原发肿瘤。
    1. 按照步骤9.5准备手术区域。通过高压灭菌法对工具进行灭菌，并在操作过程中将其放置于无菌表面。在不同动物之间使用高温珠灭菌器对工具进行灭菌。
    2. 按照步骤9.6和9.7麻醉小鼠。使用手术刀片在靠近肿瘤处做一5–8 mm的切口，轻轻牵拉皮肤使其分离，形成一个小袋以暴露肿瘤。使用低温电灼笔灼烧任何可见的血管，以防止解剖过程中发生出血。
    3. 使用手术刀切除肿瘤，尽量避免切除任何皮肤组织。将皮瓣复位至原始位置，使用5-0外科缝线配合17 mm 1/2c针头进行缝合，并涂抹外科胶水以完全封闭伤口。
    4. 在小鼠恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得使其无人看管。接受手术的动物在完全恢复之前不得放回与其他动物同笼饲养。
  10. 术后及随后几天内密切观察动物状况，根据机构规程在必要时给予镇痛治疗。我们采用皮下注射卡洛芬（Carprofen，3-5 mg/kg）。
  11. 使用精密天平称量肿瘤，步骤同2.2。用手术刀将肿瘤切成两半。取其中一半置于1.5 mL微量离心管中，液氮速冻后于-80 °C保存，用于分子分析。另一半置于含5 mL 4% PFA的15 mL锥形管中，4 °C固定24 h，用于组织学分析。
  12. 注射后第21天，通过CO2 暴露后，按照下述方法通过气管内灌注4% PFA收集肺组织。操作需在通风橱中进行。
    1. 使用手术剪打开胸腔。去除下颌区域的皮肤和唾液腺，以充分暴露气管。
    2. 准备一支含有4% PFA溶液的22G针头注射器。将针头插入小鼠气管，朝向肺部方向，并将气管向头部方向夹闭。注入溶液直至肺组织膨胀（约2 mL）。
    3. 解剖肺组织并将其放入含有4% PFA溶液的15 mL离心管中。轻轻颠倒混匀数次，于4 °C固定24 h。
  13. 对肺组织进行半连续切片，并用苏木精和伊红（Hematoxylin and Eosin，H&E）染色&E)，每隔50/100 µm取一片，直至样本用尽，具体操作如参考文献所述31.
  14. 根据显微照片的软件引导分析结果对转移灶进行评分&E染色切片。

10. 基因表达特征

  1. 按以下所述定义基因表达特征。
    1. 根据实验设置和所研究的具体生物学问题，可通过多种方式获得基因表达特征。最常见的是评估两种条件之间的差异表达（例如，CAFs 与正常对应细胞，或以多种方式处理的细胞（如超级激活或沉默）与未处理细胞之间的比较）。
    2. 或者，可鉴定在所有分析样本中表达变异最大或信息量最丰富的基因（例如，具有高方差的基因，或在主成分分析的第一主成分上具有高载荷的基因）。本文中，我们将以 STAT3 调控的基因特征为例。该特征定义为在乳腺癌 CAFs 中 STAT3 沉默后下调的基因29，如下所述。有关 RNA 测序的详细描述，请参见参考文献32,33。
  2. 从每个样本中以技术重复三次的方式提取总 RNA（同步骤 4.1.1），并评估 RNA 质量以确认 RNA 完整性（RIN ≥ 9）。
  3. 使用 2 µg 的 poly(A) 选择 RNA 制备文库并进行测序。我们使用了 NextSeq 500 平台。
  4. 使用 TopHat v2.0.10 将测序读段比对至 Mus musculus mm9 参考基因组组装版本34。
  5. 使用 HTSeq 软件包中的 htseq-count 工具计算基因计数（http://www.huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html）。 
  6. 使用 R 及 DESeq2 软件包进行差异表达分析（http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/DESeq2.html）。筛选 FDR < 0.05 的下调基因，以确定 STAT3 基因特征。

11. 原发性肿瘤中特征基因表达水平的评估

注意：以下步骤描述了一种计算方法，用于在公开可用的乳腺癌原发肿瘤转录组数据中估算STAT3调控特征的表达水平29，并检验该特征表达水平与同一样本集中估算的间质成分比例之间的关系。

  1. 安装 R（https://cran.r-project.org/）和 RStudio（https://posit.co/products/open-source/rstudio/）。启动后安装所需的库：GSVA35，TCGAbiolinks36.
  2. 下载原发性肿瘤基因表达数据，例如来自 TCGA 的数据 https://portal.gdc.cancer.gov/、http://synapse.org/（syn1757063）的METABRIC数据，或其他来自基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）的转录组数据，作为预标准化的表达矩阵。数据必须格式化为数值矩阵，其中行为基因，列为样本，并根据平台进行标准化，使用1作为偏移量进行对数缩放。
    1. 从 Biomart 下载小鼠-人类基因直系同源物列表 https://www.ensembl.org/biomart/martview/，选择数据库：ensembl genes，选取人类基因数据集，然后点击左侧标签中的属性选择。
    2. 从预选的特征中，打开“EXTERNAL”选项卡并标记HGNC符号，然后选择 同源基因 在页面顶部的框中，标记小鼠同源基因 / 小鼠基因名称。
    3. 点击 结果 左上角的按钮，选择 CSV 格式，然后单击 GO 单击按钮以下载文件。
  3. 在R中加载基因表达特征（一组基因）。本案例中，我们使用小鼠CAFs中STAT3沉默后下调的基因列表。
  4. 在 R 中加载小鼠-人类基因直系同源物列表，并通过 Biomart 表格将 STAT3 特征映射到相应的人类直系同源物。
  5. 在 R 中载入原发性肿瘤基因表达数据，并使用参数为 ssgseaParam 对象的 GSVA 函数，该对象包含原发性肿瘤数据以及由 STAT3 特征基因列表组成的列表。

12. 检验基因特征表达与临床特征之间的关系

  1. 确定感兴趣的变量。间质百分比表示测序肿瘤样本中属于肿瘤间质的细胞比例。使用以下常与组学数据相关的临床特征：肿瘤大小、分期、患者诊断时年龄、淋巴结状态、转移状态等。TCGA 的预计算间质百分比估计值可公开获取。
    注意：具体可用的间质估计值包括：EDec 间质/免疫 = 基于表观基因组去卷积法估算的间质/免疫细胞百分比37；免疫评分 = 基于141个免疫相关基因表达谱的ssGSEA评分38；LUMP = 基于44个非甲基化免疫特异性CpG位点平均值计算的白细胞去甲基化纯度评分39；间质评分 = 基于141个间质相关基因表达谱的ssGSEA评分38；IHC = 由全美儿童医院生物样本核心资源中心提供的苏木精-伊红染色切片经图像分析估算得出40；ABSOLUTE = 基于体细胞拷贝数变异数据的纯度估算方法41。
  2. 从 http://genboree.org/theCommons/documents/569 下载 EDec 数据，从 https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/disease.html (RNASeqV2) 下载间质评分和免疫评分数据，从 TCGAbiolinks 下载肿瘤纯度数据（LUMP、IHC、ABSOLUTE）。对于其他数据集，可利用 GSVA 软件包计算间质百分比，采用 Yoshihara 等人38提供的间质和免疫特征基因集进行 ssGSEA 分析。
  3. 在原发性肿瘤样本中，计算估计的间质比例数值向量与 STAT3 特征表达数值向量之间的相关性。可通过 R 语言中的 cor.test 函数实现。
  4. 将与原发性肿瘤转录组数据集相关的临床数据以表格形式下载，其中行代表样本，列代表临床特征。
  5. 在 R 中加载临床数据，并使用 match 函数检查转录组矩阵中的样本顺序是否与元数据表中的样本顺序一致。
  6. 对于数值型变量（例如肿瘤大小），使用 R 中的 cor.test 函数计算原发性肿瘤样本中 STAT3 特征表达的数值向量与临床特征值向量之间的相关性。
  7. 对于分类变量（例如转移状态），使用非参数 Wilcoxon 秩和检验（假设两组样本相互独立）检测两组样本间（例如转移性肿瘤与非转移性肿瘤）STAT3 特征表达的差异。该分析可通过 R 中的 wilcox.test 函数实现。

13. 检测肿瘤间质中特征基因表达谱的调控

注意：通过批量RNA测序分析原发性肿瘤中基质特征的表达，其优势在于可依赖具有详细临床注释的大规模患者队列。另一方面，只有将基质与上皮成分分离，才能在与正常组织比较时，明确肿瘤中这两个细胞区室各自基因表达的变化42。MetaLCM 是一个 ShinyApp，可促进对激光捕获显微切割的乳腺肿瘤转录组数据集进行分析。通过该工具，用户可在多个激光捕获显微切割的乳腺肿瘤转录组数据集中，搜索两种条件下稳健的差异表达基因，并检验先前定义的基因特征在肿瘤基质中的调控情况。以下步骤描述了如何使用 MetaLCM。

  1. 通过链接 https://aurorasavino.shinyapps.io/metalcm/ 访问应用程序。要开始分析，请选择待比较条件的特征。
  2. 选择比较方向。若选择上调基因，则显示在条件1中表达水平更高的基因。
  3. 选择差异表达的 p 值阈值，然后点击 Run 按钮执行分析，每次更改设置后均需点击以重新运行。
  4. 若需将分析限制在预定义的基因列表内，可手动输入以逗号分隔的基因符号，或导入一个仅包含一列基因符号的 CSV 文件。
  5. 点击 Submit gene list 提交基因列表。点击 Reset 可恢复使用全部基因进行分析。保存差异表达基因列表：当提供基因列表时，仅对这些基因进行多重检验校正。结果表格包含各可用数据集中差异表达基因的平均 logFC、合并后的 p 值，以及各个数据集中的单独 logFC 和 p 值。
  6. 绘制差异表达基因的倍数变化热图。该热图仅显示在所有数据集中差异表达方向完全一致的基因。

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结果

体外 CAF活性评估
采用根据步骤3制备的永生化癌相关成纤维细胞（iCAFs），研究乳腺肿瘤来源的癌相关成纤维细胞（CAFs）对乳腺癌（BC）侵袭性特征的贡献。按照步骤6所述方法对iCAFs进行超激活处理，随后在sDMEM中饥饿培养以收集其条件培养基（CM），并将该CM用于处理4T1细胞48小时（见步骤7.1）。此处理之后进行 体外 功能实验 图1 结果显示，与对照组的无血清培养基（CTR）相比，经 s.a. iCAFs CM 处理后，4T1 细胞的增殖显著增强。这种增殖的增加通常在 24 小时内开始，并在随后的几天内持续上升。在这些实验中，至关重要的是在使用条件培养基（CM）处理前，优化接种细胞数量以及培养基中的血清百分比。s.a. iCAFs CM 还显著增强了 4T1 细胞的迁移和侵袭能力。经 CM 处理后，4T1 细胞的迁移能力提高了一倍，而在侵袭方面也观察到虽较温和但仍具有统计学意义的增加图1)...

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讨论

本研究中，我们介绍了小鼠CAFs永生化的优化方案，以及对其促肿瘤活性的表征方法 体外 和 体内我们并未根据标志物表达选择性地分离特定的CAF亚型，而是选择保留整个细胞群体以维持其异质性。对细胞群体进行整体功能表征，并分析其基因表达谱以捕捉其多样性。由于原代CAF在衰老前可传代的次数有限，因此永生化CAF对该研究至关重要。通过该方法获得的永生化细胞为研究多种CAF介导的现象（包括化疗耐药性）提供了有价值的工具，因其能够用于探究CAF如何影响癌细胞对不同治疗方式的反应。永生化细胞易于进行遗传操作，使其在功能研究中尤为有用。然而，应当认识到永生化可能改变细胞的表型和活性，因此我们建议对永生化CAF与其原代对应细胞进行充分比较，并定期评估其生长速率及CAF标志物的表达水平。在基因沉默实验中，可考虑采用可诱导而非稳定的沉默策略，其中pLKO-tetON Puro载体较为适用。43，而基于CRISPR的系统可用于基因敲除（pLenti-CRISPRv2）、基因干扰（CRISPRi，pLV-dCas9-KRAB）或基因激活（CRISPRa，pLV-dCas9-VP64...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本工作由意大利癌症研究协会（AIRC，项目编号IG16930和IG24851，授予V.P.）；意大利大学与研究部（MIUR PRIN 2017和2022，授予V.P.）；列支敦士登Truus和Gerrit van Riemsdijk基金会向V.P.的捐赠；皮埃蒙特大区（Deflect项目）资助。A.S. 获得意大利癌症研究基金会（FIRC）博士后奖学金资助，L.A. 获得Umberto Veronesi基金会资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1Kb plus DNA 标准分子量标记ThermoFisher Scientific10787018
24 孔板Sarstedt833922
96 孔板Sarstedt833924
乙酸Sigma Aldrich695092
AgeI-HFNew England BiolabsR3552储存于 -20 °C
聚维酮碘Meda Pharma23907076
Bürker 计数板 VWR40443703
低温精细尖电灼器KeelerAX10339KL
离心机Eppendorf5810R
15 mL 锥形管Sarstedt62554502
50 mL 锥形管Sarstedt62547254
Cryopure 2 mL 微量离心管Sarstedt72380992
结晶紫Sigma AldrichC0775室温储存，在通风橱中使用 
100 mm 直径培养皿 Sarstedt833902
60 mm 直径培养皿 Sarstedt833920
ddH2O自制室温储存，在生物安全柜中使用
数显卡尺Preciva02-301-2
数码显微镜LeicaDM6B
二甲基亚砜Sigma AldrichD8418在生物安全柜中使用
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 (DMEM)Gibco119650924 °C 储存，在生物安全柜中使用
EcoRI-HFNew England BiolabsR3101储存于 -20 °C
乙二胺四乙酸 (EDTA)Sigma AldrichE6758室温储存，在生物安全柜中使用
胎牛血清 (FBS)Gibco160000444 °C 储存，在生物安全柜中使用
10 µL 滤芯吸头Sarstedt703010255
100 µL 滤芯吸头Sarstedt703030255
1000 µL 滤芯吸头Sarstedt703060255
20 µL 滤芯吸头Sarstedt703030265
200 µL 滤芯吸头Sarstedt703031255
Filtropur S Plus 0.20 µm Sarstedt831826102
Filtropur S Plus 0.45 µm Sarstedt831826
精细剪刀2Biol1406009
镊子2Biol1102412
遗传霉素Gibco101310354 °C 储存，在生物安全柜中使用
Lipofectamine 2000 转染试剂ThermoFisher Scientific116680194 °C 储存，在生物安全柜中使用
含 8 μm PET 膜的 Matrigel 侵袭小室 Corning354480
酶标仪（600 nm 吸光度）PromegaGM3500
1.5 mL 微量离心管 Sarstedt7269001
Opti-MEM 培养基Gibco319850474 °C 储存，在生物安全柜中使用
多聚甲醛 (PFA)Sigma Aldrich158127室温储存，在通风橱中使用
pBABE-neo largeTcDNA Addgene1780储存于 -20 °C，在生物安全柜中使用
pCL-AmphoNovus Biological 18746853储存于 -20 °C，在生物安全柜中使用
pCMV-R8.74Addgene22036储存于 -20 °C，在生物安全柜中使用
pCMV-VSVG Addgene8454储存于 -20 °C，在生物安全柜中使用
青霉素-链霉素（Pen Strepto，10,000 μg/mL） Gibco151401224 °C 储存，在生物安全柜中使用
相差显微镜 Olympus BX42
磷酸盐缓冲液 (PBS)自制室温储存，在生物安全柜中使用
pLKO.1-Puro Addgene10878储存于 -20 °C，在生物安全柜中使用
聚-L-赖氨酸溶液Sigma AldrichP89204 °C 储存，在生物安全柜中使用
来自 Streptomyces alboniger 的嘌呤霉素二盐酸盐Sigma AldrichP8833
rCutSmart 缓冲液 New England BiolabsB6004储存于 -20 °C
啮齿类动物剃毛器AesculapGT416
Roswell Park Memorial Institute 培养基 (RPMI)Gibco618700104 °C 储存，在生物安全柜中使用
圆头吸水棉签Sigma AldrichZ744127
手术刀Gima27041
Secura 半微量电子天平SartoriusSECURA125-1S
10 mL 血清移液管 Sarstedt861254001
2 mL 血清移液管 Sarstedt861252001
25 mL 血清移液管 Sarstedt861256001
5 mL 血清移液管 Sarstedt861253001
5-0 缝合线Ethicon1866G
10 mL 注射器Pentaferte00202250E14
5 mL 注射器Pentaferte00202250E12
Omnican 胰岛素注射器 1 mLBraun9151125S
组织粘合剂3M Vetbond1469SB
Transwell 小室，8 µm 孔径 Falcon353097
Transwell Matrigel 小室，8 µm 孔径 Corning354480
胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红Gibco15400054
Vivaspin 20 离心浓缩管，截留分子量 10,000 Da Sigma AldrichZ614602

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