方法文章

前列腺癌相关成纤维细胞的分离、培养与表征

1.4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/68367

⸱

2025年8月1日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Department of Science and Technological Innovation, University of Piemonte Orientale, 3Division of Urology, Department of Surgical Sciences, University of Turin, 4Department of Surgical Sciences and Urology, Città della Salute e della Scienza di Torino, University of Turin, 5Department of Pathology, University of Turin, and AOU Città della Salute e della Scienza

本文内容

摘要

本方案提供了从根治性前列腺切除术标本中分离、扩增和永生化成纤维细胞的完整操作流程。此外，还介绍了利用条件培养基处理和共培养技术评估成纤维细胞与肿瘤细胞之间相互作用功能效应的实验方法。

摘要

肿瘤间质可被肿瘤细胞主动重塑，从而获得促肿瘤特性，因此成为癌症研究的关键焦点。在间质成分中，癌症相关成纤维细胞（CAFs）通常是肿瘤微环境（TME）中最丰富的细胞类型，通过与肿瘤细胞及其他间质成分的相互作用，在促进癌症进展中发挥关键作用。阐明这些相互作用背后的机制，需要可靠的分离方法 并进行表征 CAFs，这也有助于为开发靶向CAFs的新型癌症疗法奠定基础。本研究介绍了一种从前列腺癌（PCa）患者根治性前列腺切除术标本的肿瘤组织及其邻近正常区域中分离成纤维细胞的方法。该方法能够从同一供体中同步分离肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）及其对应的正常成纤维细胞（NFs），从而构建配对的实验体系。本文提供了详细的实验方案，用于原代CAFs和NFs的培养，以支持后续的体外分析，并介绍了其永生化方法，以便于长期研究。我们还描述了多种功能学检测方法，用于比较CAFs与NFs对癌细胞行为的影响，包括细胞增殖、迁移能力以及非贴壁依赖性生长。文中详述了两种互补的实验策略：一是使用成纤维细胞来源的条件培养基（CM）处理癌细胞，二是将成纤维细胞与肿瘤细胞进行直接共培养。上述方法共同构成了 一种用于研究癌相关成纤维细胞（CAFs）与肿瘤细胞之间动态相互作用的综合工具包，不仅适用于前列腺癌（PCa），还可能广泛适用于多种人类癌症。此外，对这些相互作用的分子表征可能揭示CAFs驱动肿瘤发生的關鍵介质，为治疗干预提供有前景的靶点。

引言

前列腺癌（PCa）是全球近三分之二国家中男性最常被诊断出的癌症。2022年，全球约报告了150万例新发病例，导致39.7万人死亡。这些数据使前列腺癌成为男性中第二常见的癌症，以及男性癌症相关死亡的第五大主要原因1。

前列腺癌是一种多灶性且生物学上复杂的疾病，其特征是显著的肿瘤间异质性2,3,4、多种分子亚型以及不同的临床结局5,6，这些因素均显著影响预后和治疗反应7。

尽管肿瘤微环境（TME）在前列腺肿瘤的发生和进展中的关键作用已得到充分证实8,9，肿瘤细胞与周围间质成分之间的分子相互作用仍尚未完全阐明。虽然已明确前列腺肿瘤微环境（TME）在肿瘤起始和进展中发挥关键作用，但肿瘤细胞与周围间质之间的分子相互作用仍缺乏充分定义。TME包含多种间质细胞，包括间充质来源和免疫来源的细胞，这些细胞在接收到肿瘤分泌的信号后被激活，并继而获得促进肿瘤的功能10,11。其中，癌症相关成纤维细胞（CAFs）通常是间质中最丰富的细胞群体。CAFs参与细胞外基质（ECM）的重塑，促进肿瘤生长，并推动癌细胞的侵袭和迁移4,11,12,13。通过分泌因子和直接的细胞间相互作用，CAFs还影响癌细胞的增殖、侵袭以及对治疗的耐药性。值得注意的是，CAFs是一类异质性细胞群体。尽管通常被认为具有促肿瘤功能，但某些亚型可能发挥抑制肿瘤的作用14,15。重要的是，目前缺乏CAFs特异性的标志物，这为其精确识别及其多种功能的解析带来了挑战12,16。

研究癌症相关成纤维细胞（CAFs）与肿瘤细胞之间功能相互作用的一种可靠方法是分离原代CAFs及其配对的正常成纤维细胞（NFs），并评估它们各自对肿瘤细胞行为的影响，例如增殖、迁移、克隆形成以及非贴壁依赖性生长17,18,19。本文介绍了一种优化的、高度可重复的从高危前列腺癌（PCa）患者根治性前列腺切除标本中分离CAFs和NFs的实验方案。该方案的关键步骤是由经验丰富的泌尿病理学家准确识别并分离肿瘤组织及无肿瘤区域，从而能够从同一患者来源获取CAFs和NFs。这种配对样本策略有助于控制肿瘤间异质性以及可能影响成纤维细胞表型的个体特异性变量20,21,22。为确保有足够的肿瘤组织可用，我们聚焦于Gleason评分≥7患者的标本。

对分离的成纤维细胞进行可靠的表型表征需要使用多种标志物，以将其与其他细胞类型（尤其是上皮细胞）区分开来，因为这些细胞可能存在标志物表达的重叠16由于原发性前列腺癌成纤维细胞通常在传代10–15次后进入衰老状态，从而影响长期分析，我们还提供了一种细胞永生化方案。 通过 人端粒酶逆转录酶（hTERT）的稳定表达23.

为了探究癌症相关成纤维细胞（CAFs）和正常成纤维细胞（NFs）对肿瘤细胞的功能影响，我们测试并优化了多种实验策略。鉴于CAFs通过分泌因子和直接的细胞间接触发挥作用24，我们建立了两种互补的检测体系：（1）用成纤维细胞条件培养基（CM）处理癌细胞；（2）将成纤维细胞与肿瘤细胞直接共培养。这些检测方法用于评估癌细胞的关键特性，包括增殖能力、非贴壁依赖性生长能力和迁移能力。为了标准化分泌因子的影响，我们根据总蛋白含量对来自CAFs和NFs的条件培养基进行浓缩和定量（conCM）。

通过这些检测方法证明显著的功能性效应，可支持鉴定CAF驱动的肿瘤发生中的关键介质，从而为治疗干预提供潜在靶点。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本研究完全遵循意大利都灵市Città della Salute Molinette医院生物伦理委员会批准的临床样本使用机构指南。所有样本均在参与患者签署知情同意书后获取。以下部分提供了分离癌症相关成纤维细胞（CAFs）及其配对的正常成纤维细胞（NF）的详细分步操作方案。该方案包括肿瘤组织及相邻非肿瘤组织的解剖、组织处理、细胞培养，以及分离细胞的表型和功能表征。所有操作必须在经认证的生物安全柜内无菌条件下进行。细胞培养条件为37 °C、含5% CO2的湿润环境，使用完全杜氏改良伊格尔培养基（cDMEM），并添加10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素，除非另有说明。所有离心步骤均需启用刹车。有关本方案中使用的所有试剂、材料和设备的完整清单，请参见材料表。该方法已针对高危前列腺癌样本（Gleason评分4+3或更高）进行了优化。

1. 手术样本解剖

注意：本实验所用样本来自接受根治性前列腺切除术的高分级前列腺癌（PCa）患者的手术标本25 ，样本处理遵循机构内部指南以及国际公认文献和最佳实践所制定的标准操作流程26,27,28。

  1. 将前列腺置于生物安全罩内的无菌巾上，并根据解剖学标志进行定位。
    注意：此操作必须由经验丰富的泌尿病理学家执行。
  2. 使用无菌刀片，从术前活检报告中标识为肿瘤性或无肿瘤细胞的区域切取组织切片。
  3. 对两种组织样本进行快速冷冻切片分析29 ，制备厚度为2.5 µm的组织切片，用苏木精和伊红（H&E）染色，以确认所选区域是否存在肿瘤细胞，诊断标准依据最新版WHO分类中前列腺腺癌的诊断标准30（见图1A）。
    注意：若出现不一致情况，需重复取样过程，直至获得肿瘤性和非肿瘤性区域的组织学确认。
  4. 从肿瘤性和非肿瘤性区域分别切取约10 mm2的组织样本，放入含有7 mL冰上预冷的组织保存液的15 mL锥形管中，并置于冰上以备后续操作。
    注意：样本在此缓冲液中可在4 °C下保存最多48小时。

2. 成纤维细胞的分离

注意：除非另有说明，所有后续处理步骤均需在冰上 4 °C 条件下进行。方案见图 1 A。

  1. 第1天：称量组织样本。
    注意：平均可获得70-100 mg。
  2. 将组织转移至6 cm培养皿中，依次进行四次洗涤，分别用4 mL冰浴PBS洗涤两次，再用4 mL冰浴cDMEM洗涤两次，两种溶液均添加200 U/mL青霉素和200 µg/mL链霉素（2倍浓度），使用无菌镊子将组织从一个培养皿转移至下一个。
  3. 将组织置于含1 mL DMEM（添加100 U/mL青霉素G和100 µg/mL链霉素）的6 cm培养皿中，冰上操作，用剪刀或刀片将组织剪碎成小片段（<1 mm2）。
  4. 将组织转移至含有5 mL冰浴cDMEM的15 mL锥形管中，在4 °C条件下以754 × g离心5分钟。
  5. 使用10 mL移液器小心吸除上清液，并将沉淀重悬于5 mL冰浴cDMEM中。再次在4 °C条件下以754 × g离心5分钟。
  6. 同上法吸除上清液，将沉淀重悬于胶原酶II（1 mg/mL溶于DMEM）中，每100 mg组织使用1 mL酶液。转移至1.5 mL微量离心管中。
    注意：由于不同批次胶原酶活性存在差异，需测试不同批次并确保有足够的量完成所有预期的分离实验。
  7. 用石蜡膜封口，于37 °C持续摇动条件下过夜消化（8-12小时）。
    注意：以下步骤在第2天进行。
  8. 将样品转移至15 mL锥形管中，加入5 mL冰浴cDMEM以终止胶原酶反应，然后在4 °C条件下以754 × g离心 5分钟。
    注意：胶原酶应吸入含去污剂的容器中进行处理。
  9. 使用10 mL移液器吸除上清液，将沉淀重悬于1 mL 0.05%胰蛋白酶/EDTA中。在37 °C孵育5分钟，期间偶尔振荡。
  10. 向样品中加入1 mL DNase I并充分混匀。使用新配制的25 mg/mL PBS溶液。
    注意：此步骤中DNase I处理有助于获得单细胞悬液。
  11. 在4 °C条件下以754 × g离心5分钟。
  12. 使用10 mL移液器吸除上清液，将沉淀重悬于5 mL冷cDMEM中，在4 °C条件下以754 × g离心5分钟。
  13. 将细胞重悬于含20% FBS的cDMEM中。接种后置于37 °C、5% CO2、95%湿度条件下培养至少3天。注意避免移动或倾斜培养皿。对于70-100 mg组织，将细胞悬液分装至2个3.5 cm培养皿中，每皿2 mL培养基。若组织量较少，应相应减少培养基体积。
    注意：组织量少于50 mg将导致细胞分离效率低下。传代与冻存方案见图1B。
  14. 培养3天后，检查细胞形态和存活率，并更换2/3培养基以保留细胞自分泌的生长因子。细胞通常需要7-10天达到汇合状态，每隔一天更换一次培养基。
  15. 待细胞完全汇合后，将其传代至一个10 cm培养皿中，使用含20% FBS的cDMEM培养基。
  16. 每隔一天更换培养基，前两次使用含15% FBS的培养基，随后一次使用12.5%，再之后使用10%。用于FACS分析、RNA和蛋白提取以及冻存的方案见图1B。
  17. 当细胞接近100%汇合时（约10天）进行传代。用大量PBS洗涤2-3次，每次5分钟。加入1%胰蛋白酶/EDTA（2倍浓度），放入培养箱中孵育，每隔几分钟检查细胞脱落情况。

3. 培养条件

  1. 仅当细胞达到100%融合时进行传代，传代比例不超过1:3。
  2. 将相当于一个融合度为100%的10 cm培养皿中50%细胞量的细胞悬液，加入0.5 mL预冷冻保存液（含10% DMSO的FBS）中分装冻存。每次复苏时将每份冻存细胞悬液接种至一个10 cm培养皿中。
    注意：细胞平均倍增时间为80–90 h。

4. FACS 分析

注意：本方案可确保对成纤维细胞群体进行可靠表征，并识别可能来自上皮细胞、内皮细胞或免疫细胞的污染。流式细胞术分析在第2代细胞中进行，如图2A所示。

  1. 收集细胞，并将其重悬于FACS缓冲液（PBS加2% FBS）中，细胞浓度为106个细胞/mL。
  2. 标记流式细胞术管，并在每管中加入 1 × 105个细胞（体积为100 µL）。若使用4种抗体进行染色，请准备11个管，用于染色和设门，具体如下（表1）
    注意：1管不加抗体（未染色对照），用于评估细胞自发荧光；1管加入同型对照抗体，用于评估非特异性结合；4管每管分别加入一种单个抗体，用于补偿调节（也可使用补偿微珠替代细胞）；4管荧光减一（FMO）对照管，用于设门，每管分别缺失其中一种抗体；1管加入全部4种抗体（实际样本）。所用荧光标记抗体如下（见材料表）：（1）抗EpCAM-PE（上皮细胞标志物），（2）抗CD31-VioBlue（内皮细胞标志物），（3）抗CD45-FITC（免疫细胞标志物），（4）抗CD90-APC（成纤维细胞标志物）。可根据流式细胞仪的滤光片配置选择其他荧光素标记的抗体。所有操作步骤均需在冰上进行，以保持细胞活性。
  3. 无需洗涤，直接进行封闭。加入片段可结晶受体（FcR）阻断剂，如纯化的抗CD16/CD32抗体或封闭缓冲液（PBS含1%-2% BSA）。每100 µL细胞悬液中加入1–5 µL FcR阻断试剂，在4 °C孵育10–15分钟。
  4. 直接进行染色，无需洗涤。根据表1的说明，向各管中加入适当稀释的抗体或相应的同型对照。
  5. 轻轻混匀，在4 °C避光孵育30分钟。
  6. 用2 mL FACS缓冲液洗涤细胞。
  7. 在4 °C下，以300 × g离心5分钟。
  8. 弃去上清液，将细胞重悬于1 mL新鲜FACS缓冲液中。
  9. 根据制造商说明书加入活死染料（如碘化丙啶）（见材料表）。
  10. 在流式细胞仪上获取样本数据。
  11. 使用单染对照样本设置补偿矩阵。数据分析时，在FACS密度图上应用以下设门策略：
  12. 前向散射与侧向散射设门：绘制FSC-A vs. SSC-A图，围绕主要细胞群设定区域，以排除细胞碎片。
  13. 排除双联体：绘制FSC-A vs. FSC-W（或FSC-H vs. FSC-A）图，设定区域以排除细胞团块（其宽度相对于面积增加，或面积相对于高度增加）。选择单细胞后，重复该步骤，绘制SSC-A vs. SSC-W（或SSC-H vs. SSC-A）图，以进一步提高单细胞群体的纯度。
  14. 绘制活死染料（如碘化丙啶）vs. SSC-A图，选择染料阴性的活细胞。
  15. 在活细胞中，绘制CD326（x轴）vs. CD31（y轴）图；使用相应的FMO样本准确设定门控。FMO可帮助识别其他荧光素对目标通道的荧光溢出干扰。
    1. 观察CD326 FMO样本，绘制象限门，使所有细胞位于左侧象限（即CD326阴性）。同样，使用CD31 FMO样本调整门控，使所有FMO细胞位于下方象限（即CD31阴性）。使用此象限分析样本，并选择左下象限中的细胞（CD31- CD326-）。
  16. 重复上述步骤，绘制CD326（x轴）vs. CD45（y轴）图，使用CD326 FMO和CD45 FMO样本设定象限门。使用该象限分析所有样本，并选择左下象限中的细胞（CD45- CD326-）。
  17. 绘制CD90 vs. SSC-A图，使用CD90 FMO样本设定区域，排除阴性细胞，仅包含CD90+细胞。使用该区域分析所有样本，测定CD90+细胞的百分比。代表性结果见图2A。

5. 成纤维细胞永生化

注意：CAF 和 NF 细胞群体的永生化是通过稳定转导表达 hTERT 的逆转录病毒载体实现的。以下是制备感染性假病毒颗粒并转导细胞的实验方案。

  1. 逆转录病毒颗粒的制备
    1. 第1天，多聚赖氨酸包被与细胞接种：用6 mL聚-L-赖氨酸溶液（0.1 mg/mL，溶于H2O）包被一个10 cm培养皿，在组织培养超净台中孵育5分钟，吸除溶液，敞口置于超净台中晾干，随后接种3 × 106个HEK293T细胞。
    2. 第2天：将30 µL阳离子脂质转染试剂加入0.75 mL无抗生素的脂质体转染优化培养基中。
    3. 同时，将2 µg pCL-Ampho逆转录病毒包装载体质粒和2 µg pBABE-puro-hTERT质粒加入另一份0.75 mL无抗生素的脂质体转染优化培养基中。
    4. 室温孵育5分钟。
    5. 将上述两种稀释液混合至15 mL锥形管中，室温孵育20分钟。
    6. 与此同时，将HEK293T细胞的培养基更换为6 mL含10%胎牛血清（FBS）的脂质体转染优化培养基。
    7. 将DNA复合物轻柔地分布于培养皿表面，置于加湿的CO2 培养箱中孵育6小时至过夜。
    8. 第3天：更换为7 mL cDMEM培养基，继续孵育48小时。
      注意：从本步骤开始，所有操作必须在生物安全三级（BSL3）细胞培养设施中进行，并遵守机构相关规定。
    9. 第5天：收集含病毒的培养基，经0.22 µm注射器滤器过滤。
    10. 分装后于-80 °C保存。
  2. 病毒转导
    1. 第1天：将低代次成纤维细胞以60%汇合度接种于6孔板中的2个孔内。
    2. 第2天：将培养基更换为1 mL先前制备的pBABE-puro-hTERT逆转录病毒液，其中含8 µg/mL聚凝胺（polybrene），孵育12–16小时。
    3. 第3天：将含病毒的培养基更换为2 mL cDMEM。
    4. 第4天：24小时后，开始进行两轮48小时的嘌呤霉素筛选（2 µg/mL）。
      注意：抗生素浓度应根据每批抗生素和细胞类型通过实验确定，选择能够使所有细胞在4天内完全死亡的最低有效浓度。
    5. 第8天：确认未感染的对照组细胞已全部死亡。更换为cDMEM培养基，让感染细胞继续生长至汇合，然后以1:3比例传代。待细胞再次达到汇合后，再次以1:3比例传代。此时，细胞可移出BLS3设施。
      注意：应尽快制备冻存样本。为确认细胞已成功永生化，需将细胞连续传代5–6次，并观察其形态和倍增速率，这些特征在传代过程中应保持稳定。应使用下文所述方法，将永生化细胞与其原代对应细胞进行功能性比较。

6. 成纤维细胞的表征

  1. 对分离的细胞进行表型分析，检测其是否表达CAF/NF标志物，并在功能上表征其对肿瘤细胞的潜在促癌活性。
    注意：用于在RNA和蛋白质水平评估标志物表达水平的qPCR寡核苷酸和抗体分别见表2和材料表。需注意，针对成纤维细胞活化蛋白（FAP）的抗体常存在非特异性问题。务必设置适当的阳性和阴性对照31,32。可采用多种方法评估成纤维细胞与肿瘤细胞之间的相互作用。本文描述了两种替代性方法：一种是用来源于CAF或NF的条件培养基（CM）处理肿瘤细胞，另一种是将成纤维细胞与肿瘤细胞共培养。文中阐述了这两种方法在促进肿瘤细胞增殖方面的有效性。

7. 条件培养基的制备与浓缩

注意：条件培养基在收集后需进行浓缩并准确给药，以方便不同细胞之间的比较。

  1. 在15 cm培养皿中，用完全DMEM培养基（cDMEM）以70%汇合度接种细胞。
  2. 次日，更换为15 mL无胎牛血清（FBS）的DMEM饥饿培养基，孵育48 h以制备条件培养基（CM）。
  3. 收集条件培养基，于室温下以300 × g离心5 min，再经0.22 µm滤膜过滤，以去除细胞碎片并实现灭菌。
  4. 转移至超滤管（截留分子量10,000 Da），于4 °C以2000 × g离心20 min，或根据制造商说明操作，浓缩至约1 mL浓缩条件培养基（conCM），即约15倍浓缩。
  5. 将浓缩条件培养基分装后于-80 °C保存。
  6. 使用比色法蛋白质检测试剂盒定量所收集的浓缩条件培养基中的蛋白含量。
    注：通常获得的蛋白浓度范围为0.5–2 µg/µL；较低浓度仍可使用。

8. 增殖实验

注意：使用活细胞分析仪，在两种不同条件下评估细胞增殖（采用 DU145 或 LNCaP 人前列腺癌细胞系），即用条件培养基（conCM）处理肿瘤细胞，或与癌相关成纤维细胞（CAFs）或正常成纤维细胞（NFs）共培养。在此情况下，必须使用荧光标记的肿瘤细胞。代表性结果见图3。

  1. 经 conCM 处理后的增殖实验
    注意：本实验方案已针对DU145细胞优化；其他细胞可能需要进行相应调整。
    1. 在96孔板中，用cDMEM接种肿瘤细胞（每孔750个细胞），每个条件至少设置3个复孔，过夜培养。
    2. 将cDMEM更换为加或不加50 µg/mL conCM的饥饿培养基。
    3. 将培养板转移至培养箱内的活细胞分析仪器腔室中。
    4. 在37 °C下孵育30分钟，然后开始第一次扫描。
    5. 使用相差通道，选择一个 合适的物镜和每孔所需的视野数（推荐使用10倍物镜和每孔5个视野），以及标准扫描模式。每6小时扫描一次，持续4-5天（具体时长需根据实验条件和细胞类型通过实验确定）。
    6. 按照制造商说明书进行分析（参见 材料表).
    7. 针对每个孔（每种条件的技术重复），计算其相对于零时点数值的倍数变化。使用适当的软件生成相应的图表并评估统计学显著性。
  2. 共培养条件下的增殖检测
    1. 在96孔板中，以1:3的比例将750个表达RFP的DU145细胞与CAFs或NFs共同接种于cDMEM培养基中。
    2. 次日，更换为含2% FBS的DMEM培养基。将培养板转移至培养箱内的活细胞分析仪器腔室中，启动标准扫描程序，每6小时扫描一次，持续4天，同时使用相差通道和橙色通道进行成像。
    3. 根据制造商说明书进行增殖分析（参见 材料表).
    4. 针对每个孔（每种条件的技术重复），计算其相对于零时点数值的倍数变化。使用适当的软件生成相应的图表并评估统计学显著性。

9. 伤口愈合迁移实验

注意：此处介绍了一种经典的划痕实验的自动化版本33 ，用于通过活细胞分析仪器测量细胞迁移。

  1. 将肿瘤细胞接种于适用于活细胞分析仪的96孔板中，培养至形成融合的单层细胞。
  2. 次日，加入10 µg/mL丝裂霉素C处理细胞2小时。
    注意：此步骤至关重要，可避免检测过程中细胞增殖，从而防止干扰实验结果。
  3. 按照制造商说明书在孔板中制造划痕（参见材料表）。
  4. 用100 µL PBS洗涤，去除脱落的细胞。
  5. 加入饥饿培养基，含50 mg/mL待测物或不加（对照组）。
  6. 将孔板放入培养箱中的活细胞分析腔室内。
  7. 30分钟后，设置推荐的伤口愈合扫描程序，每4小时扫描一次，持续1天或更长时间，具体时长根据细胞类型和实验条件而定。
  8. 根据制造商说明书分析结果（参见材料表）。

10. 软琼脂实验检测非贴壁依赖性生长

  1. 将CAF或NF细胞以70%融合度接种于12孔板中，留出三个空孔作为对照。
  2. 次日，在无菌条件下，将0.45 g低熔点琼脂加入12.5 mL PBS中，置于50 mL锥形管内，配制4×软琼脂储备液（3.6%）。
  3. 使用微波炉溶解，注意避免剧烈沸腾导致溶液浓缩。
  4. 将溶液冷却至37 °C，再用预热的完全DMEM培养基按1:4比例稀释，制备1×工作液。
  5. 吸除12孔板中的培养基，每孔加入500 µL 1×琼脂溶液。
  6. 在4 °C下静置20分钟使其凝固，同时将剩余琼脂溶液保存在37 °C环境中。
  7. 在此期间，用胰酶消化肿瘤细胞，并制备浓度为2 × 104 个细胞/mL的单细胞悬液。
  8. 将细胞悬液与1×琼脂溶液等体积混合，反复吹打混匀，每孔上层加入500 µL（即含5000个细胞）。注意细胞悬液应至少多准备10%以补偿操作损耗。
  9. 将培养板置于4 °C孵育20分钟，使琼脂充分凝固。
  10. 每孔加入1 mL完全DMEM培养基，并每隔一天更换一次培养基：从孔边缘轻柔吸除旧液，将新鲜培养基几乎逐滴加至孔中央，避免扰动软琼脂层。
  11. 继续培养至可见明显克隆形成。DU145细胞通常需约12天，具体时间可能略有差异。
  12. 弃去培养基，每孔加入200 µL氯化硝基四氮唑蓝溶液（1 mg/mL PBS溶液），在37 °C湿润培养箱中避光孵育过夜。
  13. 待克隆染色后，吸除染色液，使用体视显微镜采集图像。将培养板置于显微镜载物台上，将放大倍数调至最低（0.8×），确保整个孔均在视野范围内；先用粗调焦旋钮使克隆重影清晰，再调整光照强度与成像模式，最后进行图像采集。
  14. 根据补充文件1中提供的步骤，使用适当的软件34对克隆数量及所占面积进行定量分析。
  15. 统计克隆的数量与大小分布（参见图4）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

采用本方案成功分离了来自7名高级别前列腺癌（PCa）患者的CAF和NF配对样本。患者手术时的年龄和Gleason评分汇总于表3中。为评估所获得成纤维细胞群体的纯度，将第二代原代CAF和NF消化脱离，并使用指定的荧光标记抗体或碘化丙啶染色以评估细胞凋亡情况。后续FACS分析的代表性结果如图2A所示，展示了设门策略及各标志物阳性细胞所占百分比。分析中包含上皮细胞标志物（EpCAM）、内皮细胞标志物（CD31）、免疫细胞标志物（CD45）以及活化成纤维细胞标志物（CD90）。结果显示，所分离的细胞几乎不表达上皮、内皮或免疫细胞标志物，而对CD90呈不同程度的阳性表达，表明已成功获得高纯度的成纤维细胞；CD90被认为是CAF活化的标志物35,36。在多数情况下，尤其是在早期传代时，CAF相较于NF呈现更明显的梭形形态，如图2B所示。然而，随着传代次数增加，这种形态学差异趋于减弱...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

从前列腺癌（PCa）组织中分离和分析细胞提供了一个相关的实验模型，特别是考虑到现有的动物模型无法完全复制人类前列腺的解剖结构和疾病进展过程37。黑猩猩的前列腺在解剖结构上与人类相似，但其疾病进展缓慢且具有随机性，同时还存在伦理限制。犬类在前列腺结构和病理生物学方面与人类差异显著，并仅发生零星的、与年龄相关的前列腺疾病。常用实验动物如大鼠和小鼠在前列腺解剖结构、上皮-间质比例以及干细胞标志物表达方面均存在差异。此外，小鼠难以诱导前列腺恶性肿瘤，而大鼠则需要激素类致癌物，因此这些模型在研究人类前列腺疾病时并不理想37。体内人源-小鼠异种移植模型是一个有价值的工具，尤其适用于临床前治疗试验。然而，其主要局限在于缺乏功能性的人类免疫细胞以及肿瘤微环境（TME）中的其他关键组分，如癌症相关成纤维细胞（CAFs），后者在肿瘤进展中发挥着关键作用（详见Sasaki等人的综述13）。

一种用于研究前列腺癌细胞与癌症相关成纤维细胞（CAFs...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本工作由意大利癌症研究协会（AIRC）、 IG16930 和 IG24851（资助对象：V.P.）；意大利大学与研究部（MIUR PRIN 2017 和 2022，资助对象：V.P.）；列支敦士登 Truus 和 Gerrit van Riemsdijk 基金会向 V.P. 提供的捐赠；皮埃蒙特大区（Deflect 项目）资助。A.S. 获得意大利癌症研究基金会（FIRC）博士后奖学金支持，L.A. 由 Umberto Veronesi 基金会资助。图 2 使用 BioRender.com 制作。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12 孔板Sarstedt833921
24 孔板Sarstedt833922
6 孔板Sarstedt833920
96 孔板Sarstedt833924
抗 GAPDH 小鼠单克隆抗体（6C5）Sigma AldrichCB1001来源：小鼠；WB 稀释比例：1:1000
aSMASigma AldrichA5228 来源：小鼠；WB 稀释比例：1:3000
CaveolinCell Signalling TechnologyCST3267来源：兔；WB 稀释比例：1:1000
CD31-VioBlueMilteny Biotec130-119-980流式细胞术抗体，内皮细胞标志物
CD326-PE（EpCAM）Milteny Biotec130113-826流式细胞术抗体，上皮细胞标志物
CD45-FITCMilteny Biotec130-110769流式细胞术抗体，泛白细胞标志物
CD90-APCMilteny Biotec130-114-903流式细胞术抗体，成纤维细胞标志物
胶原蛋白 VI（COL6A1）Abcamab182744来源：兔；WB 稀释比例：1:1000
15 mL 锥形管Sarstedt62554502
50 mL 锥形管Sarstedt62547254
2 mL Cryopure 微量离心管Sarstedt72380992
100 mm 直径培养皿 Corning353003
100 mm 直径培养皿 Corning353025
60 mm 直径培养皿 Corning353002
二甲基亚砜（DMSO）Sigma AldirchD8418在生物安全柜中使用
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基（DMEM）Gibco119650924 °C 保存，在生物安全柜中使用
FAPAbcamab53066来源：兔；WB 稀释比例：1:500
人源 FcR 封闭试剂Milteny Biotec130-059-901Fc 封闭剂
胎牛血清（FBS）Gibco160000444 °C 保存，在生物安全柜中使用
10 µL 滤芯吸头Sarstedt703010255
100 µL 滤芯吸头Sarstedt703030255
1000 µL 滤芯吸头Sarstedt703060255
20 µL 滤芯吸头Sarstedt703030265
200 µL 滤芯吸头Sarstedt703031255
Filtropur S Plus 0.20 µm Sarstedt831826102
镊子2Biol1102412
FSP1/S100A4Cell Signalling TechnologyD9F9D (13018)来源：兔；WB 稀释比例：1:2000
IL6Abclonal technologyA0286来源：兔；WB 稀释比例：1:1000
ImageJ美国国立卫生研究院version 1.53c图像分析软件
incucyte imagelock 96 孔板SartoriousBA-04857
Incucyte® SX5SartoriousSX5活细胞分析仪 
Lipofectamine 2000 转染试剂ThermoFisher Scientific11668019阳离子脂质介导的转染试剂
MACS® 组织保存液Milteny Biotec130-100-008
酶标仪（600 nm 吸光度）PromegaGM3500
1.5 mL 微量离心管 Sarstedt7269001
NcadAbcamab18203来源：兔；WB 稀释比例：1:1000
硝基蓝四氮唑 Sigma Aldirchn5514
Parafilm Sigma AldirchHS234526B
pBABE-puro-hTERTAddgene1771-20 °C 保存，在生物安全柜中使用
pCL-AmphoNovus Biological NBP2-29541-20 °C 保存，在生物安全柜中使用
PDGFRBSanta Cruzsc-432来源：兔；WB 稀释比例：1:1000
青霉素-链霉素（PS，10,000 μg/mL） Gibco151401224 °C 保存，在生物安全柜中使用
相差显微镜 Olympus BX42
磷酸盐缓冲液 （PBS）自制NaCl，137 mM；KCl，2.7 mM；Na2HPO4，10 mM；KH2PO4，1.8 mM。高压灭菌后室温保存
多聚-L-赖氨酸溶液Sigma AldirchP89204 °C 保存，在生物安全柜中使用
嘌呤霉素二盐酸盐Sigma AldirchP8833
Secura 半微量电子天平SartoriusSECURA125-1S
10 mL 血清移液管 Sarstedt861254001
2 mL 血清移液管 Sarstedt861252001
25 mL 血清移液管 Sarstedt861256001
5 mL 血清移液管 Sarstedt861253001
STAT3CST9139来源：小鼠；WB 稀释比例：1:1000
STAT3 Y705CST9131来源：兔；WB 稀释比例：1:1000
体视显微镜LeicaMZ125
10 mL 注射器Pentaferte00202260D12
TermoMixerEppendorph22331
胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红Gibco15400054
VimSanta Cruzsc-6260来源：小鼠；WB 稀释比例：1:2000
Vivaspin 20 离心浓缩器 Sigma AldirchZ614602截留分子量 10,000 Da 
瓦格纳剪刀2Biol14070-12

参考文献

  1. Bray, F. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (6), 229-263 (2024).
  2. Yadav, S. S., Stockert, J. A., Hackert, V., Yadav, K. K., Tewari, A. K. Intratumor heterogeneity in prostate cancer. Urol Oncol. 36 (8), 349-360 (2018).
  3. Owen, J. S., Clayton, A., Pearson, H. B. Cancer-associated fibroblast heterogeneity, activation and function: Implications for prostate cancer. Biomolecules. 13 (1), 67(2023).
  4. Ge, R., Wang, Z., Cheng, L. Tumor microenvironment heterogeneity an important mediator of prostate cancer progression and therapeutic resistance. NPJ Precis Oncol. 6, 1-8 (2022).
  5. Pejčić, T., Todorović, Z., Đurašević, S., Popović, L. Mechanisms of prostate cancer cells survival and their therapeutic targeting. Int J Mol Sci. 24 (3), 2939(2023).
  6. Shoag, J., Barbieri, C. Clinical variability and molecular heterogeneity in prostate cancer. Asian J Androl. 18 (4), 543-548 (2016).
  7. Segura-Moreno, Y. Y., Sanabria-Salas, M. C., Varela, R., Mesa, J. A., Serrano, M. L. Decoding the heterogeneous landscape in the development of prostate cancer. Oncol Lett. 21 (5), 376(2021).
  8. Hägglöf, C., Bergh, A. The stroma-a key regulator in prostate function and malignancy. Cancers (Basel. 4 (2), 531-548 (2012).
  9. Teng, L. K. H., et al. Mast cell-derived SAMD14 is a novel regulator of the human prostate tumor microenvironment. Cancers (Basel). 13 (6), 1-25 (2021).
  10. Galbo, P. M., Zang, X., Zheng, D. Molecular features of cancer-associated fibroblast subtypes and their implication on cancer pathogenesis, prognosis, and immunotherapy resistance. Clin Cancer Res. 27 (9), 2636-2647 (2021).
  11. Mao, X., et al. Crosstalk between cancer-associated fibroblasts and immune cells in the tumor microenvironment: New findings and future perspectives. Mol Cancer. 20 (1), 1-30 (2021).
  12. Pederzoli, F., et al. Stromal cells in prostate cancer pathobiology: Friends or foes. Br J Cancer. 128 (6), 930-939 (2022).
  13. Sasaki, T., Franco, O. E., Hayward, S. W. Interaction of prostate carcinoma-associated fibroblasts with human epithelial cell lines in vivo. Differentiation. 96, 40-48 (2017).
  14. Cirri, P., Chiarugi, P. Cancer-associated fibroblasts, and tumor cells: A diabolic liaison driving cancer progression. Cancer Metastasis Rev. 31 (1-2), 195-208 (2012).
  15. Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: A dynamic niche in cancer progression. J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).
  16. Kahounová, Z. The fibroblast surface markers FAP, anti-fibroblast, and FSP are expressed by cells of epithelial origin and may be altered during epithelial-to-mesenchymal transition. Cytometry A. 93 (9), 941-951 (2018).
  17. Giannoni, E., et al. Reciprocal activation of prostate cancer cells and cancer-associated fibroblasts stimulates epithelial-mesenchymal transition and cancer stemness. Cancer Res. 70 (17), 6945-6956 (2010).
  18. Paland, N., et al. Differential influence of normal and cancer-associated fibroblasts on the growth of human epithelial cells in an in vitro cocultivation model of prostate cancer. Mol Cancer Res. 7 (8), 1212-1235 (2009).
  19. Jaeschke, A., et al. Cancer-associated fibroblasts of the prostate promote a compliant and more invasive phenotype in benign prostate epithelial cells. Mater Today Bio. 8, 100073(2020).
  20. Ellem, S. J., et al. A pro-tumourigenic loop at the human prostate tumor interface orchestrated by oestrogen, CXCL12 and mast cell recruitment. J Pathol. 234 (1), 86-98 (2014).
  21. Lawrence, M. G., et al. Alterations in the methylome of the stromal tumor microenvironment signal the presence and severity of prostate cancer. Clin Epigenetics. 12 (1), 48(2020).
  22. Nguyen, E. V. Proteomic profiling of human prostate cancer-associated fibroblasts (CAF) reveals LOXL2-dependent regulation of the tumor microenvironment. Mol Cell Proteomics. 18 (7), 1410-1427 (2019).
  23. Smith, M. C., Goddard, E. T., Perusina Lanfranca, M., Davido, D. J. hTERT extends the life of human fibroblasts without compromising type I interferon signaling. PLoS One. 8 (3), e58233(2013).
  24. Kay, E. J., et al. Cancer-associated fibroblasts require proline synthesis by PYCR1 for the deposition of pro-tumorigenic extracellular matrix. Nat Metab. 4 (6), 693-710 (2022).
  25. Huynh, L. M., Ahlering, T. E. Robot-assisted radical prostatectomy: A step-by-step guide. J Endourol. 32, S28-S32 (2018).
  26. Srigley, J. R., et al. Protocol for the examination of specimens from patients with carcinoma of the prostate gland with guidance from the CAP Cancer and CAP Pathology Electronic Reporting Committees. , https://documents.cap.org/protocols/cp-prostate-2017-v4020.pdf (2017).
  27. Goldblum, J. R., Lamps, L. W., McKenney, J. K. Rosai and Ackerman's Surgical Pathology E-Book. , https://books.google.it/books/about/Rosai_and_Ackerman_s_Surgical_Pathology.html?id=7ZEDwAAQBAJ (2024).
  28. Montironi, R., Beltran, A. L., Mazzucchelli, R., Cheng, L., Scarpelli, M. Handling of radical prostatectomy specimens: Total embedding with large-format histology. Int J Breast. 2012, (2012).
  29. Arcega, R. S., Woo, J. S., Xu, H. Performing and cutting frozen sections. Methods Mol Biol. 1897, 279-288 (2019).
  30. IARC. WHO Classification of Tumors, 5th edition, volume 8: Urinary and male genital tumors. , https://www.iarc.who.int/news-events/who-classification-of-tumours-5th-edition-volume-8-urinary-and-male-genital-tumours/ (2025).
  31. Sfanos, K. S., et al. If this is true, what does it imply? How end-user antibody validation facilitates insights into biology and disease. Asian J Urol. 6 (1), 10-25 (2019).
  32. Brennen, W. N., et al. Overcoming stromal barriers to immuno-oncological responses via fibroblast activation protein-targeted therapy. Immunotherapy. 13 (2), 155-175 (2021).
  33. Pinto, B. I., Cruz, N. D., Lujan, O. R., Propper, C. R., Kellar, R. S. In vitro scratch assay to demonstrate effects of arsenic on skin cell migration. J Vis Exp. (133), e58838(2019).
  34. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  35. Sauzay, C., Voutetakis, K., Chatziioannou, A. A., Chevet, E., Avril, T. CD90/Thy-1, a cancer-associated cell surface signaling molecule. Front Cell Dev Biol. 7, 444743(2019).
  36. True, L. D., et al. CD90/THY1 is over-expressed in prostate cancer-associated fibroblasts and could serve as a cancer biomarker. Mod Pathol. 23 (10), 1346(2010).
  37. Strand, D. W., Aaron, L. T., Henry, G., Franco, O. E., Hayward, S. W. Isolation and analysis of discreet human prostate cellular populations. Differentiation. 91 (4-5), 139(2015).
  38. Krönig, M., et al. Cell type-specific gene expression analysis of prostate needle biopsies resolves tumor tissue heterogeneity. Oncotarget. 6 (2), 1302-1314 (2014).
  39. Goldstein, A. S., et al. Purification and direct transformation of epithelial progenitor cells from primary human prostate. Nat Protoc. 6 (5), 656-667 (2011).
  40. Kassen, A., et al. Stromal cells of the human prostate: Initial isolation and characterization. Prostate. 28 (2), 89-97 (1996).
  41. Linxweiler, J., et al. Cancer-associated fibroblasts stimulate primary tumor growth and metastatic spread in an orthotopic prostate cancer xenograft model. Sci Rep. 10 (1), 12575(2020).
  42. Liu, A. Y., et al. Cell-cell interaction in prostate gene regulation and cytodifferentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10705-10710 (1997).
  43. Olumi, A., et al. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium. Cancer Res. 59 (19), 5002(1999).
  44. Luthold, C., Hallal, T., Labbé, D. P., Bordeleau, F. The extracellular matrix stiffening: A trigger of prostate cancer progression and castration resistance. Cancers (Basel). 14 (12), 2887(2022).
  45. Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).
  46. Yun, Y. R., et al. Fibroblast growth factors: Biology, function, and application for tissue regeneration. J Tissue Eng. 1 (1), 1-18 (2010).
  47. Baranyi, U., et al. Primary human fibroblasts in culture switch to a myofibroblast-like phenotype independently of TGF beta. Cells. 8 (7), 721(2019).
  48. Ortiz-Otero, N., et al. Cancer-associated fibroblasts confer shear resistance to circulating tumor cells during prostate cancer metastatic progression. Oncotarget. 11 (12), 1037-1050 (2020).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

相关文章