前列腺癌相关成纤维细胞的分离、培养和表征

前列腺癌 （PCa） 是全球近三分之二国家男性最常被诊断出的癌症。2022 年，全球报告了约 150 万例新病例，导致 3,97,000 人死亡。这些数字使 PCa 成为男性癌症相关死亡的第二大常见癌症和第五大原因¹。

PCa 是一种多灶性和生物学复杂性疾病，其特征是显着的肿瘤间异质性 ^2,3,4、不同的分子亚型和可变的临床结果 ^5,6，^所有这些都显着影响预后和治疗反应⁷。

虽然肿瘤微环境 （TME） 在前列腺肿瘤发生和进展中的关键作用已得到充分证实 ^8,9，但肿瘤细胞与周围基质室之间的分子相互作用仍不完全清楚。虽然众所周知，前列腺肿瘤微环境 （TME） 在肿瘤的发生和进展中起着关键作用，但肿瘤细胞与周围基质之间的分子相互作用仍然没有充分明确。TME由多种基质细胞组成，包括间充质和免疫来源的基质细胞，这些基质细胞响应肿瘤衍生信号而被激活，随后获得肿瘤促进功能^10,11。其中，癌症相关成纤维细胞 （CAF） 通常是最丰富的基质群。CAF有助于细胞外基质（ECM）重塑，促进肿瘤生长，并促进癌细胞侵袭和迁移4,11,12,13。通过分泌因子和直接的细胞间相互作用，CAFs还影响增殖、侵袭和治疗耐药性。值得注意的是，CAF 是一个异质人群。虽然通常与促肿瘤功能相关，但某些亚型可能发挥肿瘤抑制作用^14,15。重要的是，CAF缺乏独特的标记，对其精确识别和功能剖析其不同作用提出了挑战^12,16。

研究CAF和肿瘤细胞之间功能串扰的稳健方法包括分离原代CAF和匹配的正常成纤维细胞（NF），然后评估它们各自对肿瘤细胞行为的影响，如增殖、迁移、集落形成和锚定非依赖性生长17,18,19.本文介绍了一种改进的、高度可重复的方案，用于从高危PCa患者的根治性前列腺切除术标本中分离CAF和NF。该协议的一个关键组成部分是由泌尿病理学专家准确识别和解剖肿瘤和无肿瘤区域，从而允许从同一患者那里获得 CAF 和 NF。这种配对样本方法有助于控制肿瘤间异质性和可能影响成纤维细胞表型的个体患者特异性变量 20,21,22。为确保有足够的肿瘤组织可用，我们重点关注格里森评分为 ≥7 的患者的标本。

分离成纤维细胞的可靠表型表征需要使用多种标记来将它们与其他细胞类型区分开来，特别是上皮细胞，它们可能共享重叠的标记表达¹⁶。由于原代PCa成纤维细胞通常在10-15次传代后发生衰老，使长期分析复杂化，因此我们还提出了一种通过稳定表达人端粒酶逆转录酶（hTERT）23进行细胞永生化的方案。

为了探索CAF和NF对肿瘤细胞的功能影响，我们测试并优化了几种实验策略。鉴于CAF通过分泌因子和直接细胞间接触²⁴发挥其影响，因此开发了两种互补的测定系统：（1）用成纤维细胞条件培养基（CM）处理癌细胞，以及（2）成纤维细胞和肿瘤细胞的直接共培养。这些测定评估关键的癌细胞特性，包括增殖、非锚定生长和迁移。为了标准化分泌因子的影响，根据总蛋白含量浓缩和定量 （conCM） 来自 CAF 和 NF 的条件培养基。

通过这些测定证明显着的功能效应可以支持识别 CAF 驱动的肿瘤发生的关键介质，为治疗干预提供潜在靶点。

这项研究完全符合意大利都灵 Città della Salute Molinette 医院生物伦理委员会批准的临床样本使用机构指南进行。所有样本均在参与患者签署知情同意书后获得。以下部分提供了用于分离癌症相关成纤维细胞 （CAF） 及其匹配的正常成纤维细胞 （NF） 对应物的详细分步方案。该方案包括肿瘤和邻近非肿瘤区域的解剖、组织处理、细胞培养以及分离细胞的表型和功能表征。所有程序都必须在经过认证的生物安全柜内的无菌条件下进行。除非另有说明，否则使用完整的Dulbecco's Modified Eagle 培养基（cDMEM）在含有5%CO₂ 的加湿气氛中培养细胞，并补充10%胎牛血清（FBS），100 U / mL青霉素和100μg / mL链霉素。所有离心步骤均在制动器接合的情况下进行。请参阅 材料表 ，了解整个协议中使用的试剂、材料和设备的完整列表。该方法已针对高危前列腺癌标本进行了优化，格里森评分为 4+3 或更高。

1.手术样本解剖

注意：该手术是对从对高级别前列腺癌 （PCa） 患者进行的根治性前列腺切除术²⁵ 中收集的手术标本进行的，并根据内部机构指南和既定的国际文献和最佳实践 26,27,28 按照标准化方案进行管理。

1. 将前列腺放在无菌窗帘上的生物安全罩下，并根据解剖标志确定方向。
   注意：此程序必须由经验丰富的泌尿病理学家执行。
2. 使用无菌刀片，从术前活检报告中确定为肿瘤或不含肿瘤细胞的区域切除组织切片。
3. 根据最新版本的WHO分类³⁰的前列腺腺癌诊断标准，通过制备2.5μm厚的组织切片并用苏木精和伊红（H&E）染色，对两个组织样本进行快速低温分析²⁹，以验证所选区域是否存在肿瘤细胞。
   注意：如果出现差异，请重复取样过程，直到获得肿瘤和非肿瘤区域的组织学确认。
4. 从肿瘤和非肿瘤区域切除约10 mm² 样品，将它们放入含有7 mL冰冷组织储存缓冲液的15 mL锥形管中，并将它们保存在冰上以备后续程序。
   注意：样品可以在4°C下在该缓冲液中储存长达48小时。

2. 成纤维细胞分离

注意：除非另有说明，否则所有以下处理程序必须在 4 °C 的冰上进行。有关方案，请参见图 1 A。

1. 第 1 天：称量组织样本。
   注意：平均获得 70-100 毫克。
2. 移动到 6 cm 培养皿并进行四次连续洗涤，两次在 4 mL 冰冷 PBS 中，两次在 4 mL 冰冷 cDMEM 中，均补充有 200 U/mL 青霉素、200 μg/mL 链霉素 （2x），使用无菌镊子将组织从一个培养皿转移到下一个培养皿。
3. 通过将其放入冰上的6cm板中，用1mL DMEM补充100U / mL青霉素-G和100μg/mL链霉素，机械破坏组织，然后将其切碎成小碎片（<1mm²）使用剪刀或刀片。
4. 转移到装有 5 mL 冰冷 cDMEM 的 15 mL 锥形管中。在4°C下以754× g 离心5分钟。
5. 使用 10 mL 移液器小心地除去上清液并将沉淀重悬于 5 mL 冰冷的 cDMEM 中。在4°C下再次以754× g 离心5分钟。
6. 如上所述除去上清液，并使用 1 mL/100 mg 组织将沉淀重悬于胶原酶 II（DMEM 中为 1mg/mL）中。移至 1.5 mL 微管。
   注意：由于胶原酶批次的可变性，请测试不同的批次并确保它们有足够的量来执行所有预测的分离。
7. 用石蜡膜覆盖试管，并在 37 °C 下连续摇动消解样品 O/N（8-12 小时）。
   注意：在第 2 天执行以下步骤。
8. 将样品转移到 15 mL 锥形管中，并向细胞悬液中加入 5 mL 冰冷的 cDMEM 以灭活胶原酶，然后在 4 °C 下以 754 x g 离心 5 分钟。
   注意：胶原酶通过将其吸入含有洗涤剂的容器中来处理。
9. 使用 10 mL 移液器吸出上清液，并将沉淀重悬于 1 mL 0.05% 胰蛋白酶/EDTA 中。在37°C下孵育5分钟，偶尔摇动。
10. 向样品中加入 1 mL DNase I 并充分混合。使用新鲜制备的 25 mg/mL PBS 溶液。
    注意：此阶段的DNase I处理有助于获得单细胞溶液。
11. 在4°C下以754× g 离心5分钟。
12. 使用 10 mL 移液器吸出上清液，并将沉淀重悬于 5 mL 冷 cDMEM 中。在754 x g 4°C下离心5分钟。
13. 将细胞重悬于 20% FBS cDMEM 中。在 37 °C、5% CO₂ 和 95% 湿度下铺板并孵育至少 3 天。注意不要移动/倾斜盘子。对于 70-100 mg 组织，将细胞悬液分布在 2 x 3.5 cm 培养皿中，在 2 mL 培养基中。如有必要，相应地缩小规模。
    注意：少于 50 mg 的组织将导致细胞衍生效率低下。分裂和冻结方案如 图1B所示。
14. 3天后，检查细胞的形态/活力，并更换2/3的培养基以维持细胞产生的生长因子。细胞大约需要 7-10 天才能达到汇合，每隔一天更换一次培养基。
15. 汇合后，将细胞传代到20%FBS cDMEM中的一个10cm培养皿中。
16. 每隔一天更换一次培养基，使用 15% FBS 培养基两次，然后一次，12.5%，然后 10%。对于FACS分析，RNA和蛋白质提取和冷冻储备液遵循 图1B中的方案。
17. 当大约 100% 汇合时（约 10 天）分裂细胞。用丰富的PBS洗涤2-3次，每次5分钟。加入 1% 胰蛋白酶/EDTA （2x） 并放入培养箱中，每隔几分钟检查一次细胞脱落。

3、培养条件

1. 仅在 100% 汇合时传代细胞，不超过 1：3。
2. 在0.5mL冰冷冷冻培养基（FBS中的10%DMSO）中冷冻相当于汇合10cm培养皿的50%等分试样。在一个 10 厘米的盘子中解冻每个等分试样。
   注意：平均倍增时间为 80-90 小时。

4. FACS分析

注意：该协议确保对成纤维细胞群进行可靠的表征，并识别来自上皮细胞、内皮细胞或免疫细胞的潜在污染。FACS分析在通道2中进行，如 图2A所示。

1. 收获细胞并将其重悬于 FACS 缓冲液（PBS 加 2% FBS）中，浓度为 10⁶ 个细胞/mL。
2. 标记流式细胞术管，并在每个管中加入 1 x 10⁵ 个 100 μL 体积的细胞。对于用 4 种抗体染色，准备 11 个试管以考虑染色和门控，如下所示（表 1）
   注意：1 个试管，无抗体（未染色对照），用于评估细胞自发荧光，1 个试管带有抗体同种型对照，用于评估非特异性结合，4 个试管，每个试管都有一个抗体，用于补偿;补偿珠可以替代细胞，4 个用于门控的荧光减一 （FMO） 管，每个管省略其中一种抗体，1 个管装有所有 4 种抗体（实际样品）。使用以下荧光标记的抗体（参见 材料表）：（1）抗EpCAM-PE（上皮细胞标志物），（2）抗CD31-VioBlue（内皮细胞标志物），（3）抗CD45-FITC（免疫细胞标志物），（4）抗CD90-APC（成纤维细胞细胞标志物）。根据可用的流式细胞仪过滤器，可以使用与其他荧光团偶联的抗体。在冰上执行所有步骤以保持细胞活力。
3. 将细胞与片段结晶受体 （FcR） 阻滞剂一起孵育，例如纯化的抗 CD16/CD32 抗体或封闭缓冲液 （PBS 1%-2% BSA）。每 100 μL 细胞悬液使用 1-5 μL FcR 封闭试剂，并在 4 °C 下孵育 10-15 分钟。
4. 直接进行染色，无需清洗。如 表 1 所示，向试管中添加适当的抗体稀释液或相应的同种型对照。
5. 轻轻混合并在4°C下在黑暗中孵育30分钟。
6. 用 2 mL FACS 缓冲液洗涤。
7. 在 4 °C 下以 300 x g 离心 5 分钟。
8. 弃去上清液并将细胞重悬于 1 mL 新鲜 FACS 缓冲液中。
9. 根据制造商的说明添加活力染料（碘化丙啶）（参见 材料表）。
10. 在流式细胞仪上采集样品。
11. 使用单染色补偿对照来设置补偿矩阵。对于数据分析，请在 FACS 密度图上应用以下门控策略：
12. 前向和侧向散射门控：绘制 FSC-A 与SSC-A 并在主要细胞群周围设计一个区域以排除细胞碎片。
13. 对于双峰排除：绘制 FSC-A 与FSC-W（或 FSC-H 与FSC-A）并设计一个区域以排除细胞团块，这将显示相对于该区域增加的宽度（或相对于高度增加的面积）。选择单个细胞并执行相同的程序，绘制 SSC-A 与SSC-W（或 SSC-H 与SSC-A）来增加单细胞群体的纯度。
14. 绘制活力染料（即碘化丙啶） 与SSC-A 并选择阴性活细胞。
15. 在活细胞上，绘制CD326（x轴） 与CD31（y 轴）;使用相应的FMO样本准确设置门。FMO 允许人们解释由其他荧光团引起的荧光扩散到特定通道。
    1. 查看 CD326 FMO 样品，绘制一个象限门，其中包括左象限中的所有细胞（即 CD326 阴性）。使用 CD31 FMO 样品重复相同的过程来调整门，以便使所有 FMO 细胞位于下象限（即 CD31 阴性）。使用此象限分析样品，并在左下象限（CD31-CD326^-）中选择细胞。
16. 重复相同的过程，绘制 CD326（x 轴）与CD45（y 轴），使用 CD326 FMO 和 CD45 FMO 设置象限门。使用此象限分析所有样品并选择左下象限（CD45-CD326^-）中的细胞。
17. 图 CD90 与SSC-A 并使用 CD90 FMO 设置一个排除阴性细胞且仅包含 CD90⁺ 的区域。使用此区域分析所有样品，测量 CD90⁺ 细胞的百分比。代表性结果如 图2A所示。

5. 成纤维细胞永生化

注意：CAF和NF群体的永生化是通过用表达hTERT的逆转录病毒载体稳定转导来实现的。以下是制备感染性假病毒颗粒和转导细胞的方案。

1. 逆转录病毒颗粒的产生
   1. 第 1 天，聚 L-赖氨酸包被和细胞铺板：在 10 cm 培养皿上涂有 6 mL 聚 L-赖氨酸溶液（H₂O 中 0.1 mg/mL），在 TC 罩下孵育 5 分钟，吸出，并让打开的培养皿在罩下干燥，然后接种 3 x 10⁶ HEK293T 细胞。
   2. 第 2 天：将 30 μL 阳离子脂质介导的转染试剂加入 0.75 mL 无抗生素脂质吸收优化培养基中。
   3. 同时，将 2 μg pCL-Ampho 逆转录病毒包装载体和 2 μg pBABE-puro-hTERT 质粒加入另外 0.75 mL 无抗生素脂肪吸收优化培养基中。
   4. 在室温下孵育5分钟。
   5. 将两种稀释液混合在 15 mL 锥形管中，并在室温下孵育 20 分钟。
   6. 同时，用补充有 10% FBS 的 6 mL 脂肪减胶优化培养基替换 HEK293T 培养基。
   7. 将DNA复合物轻轻分布在培养皿表面，并在加湿的CO 2培养箱中孵育6小时至O_/ N。
   8. 第 3 天：用 7 mL cDMEM 替换培养基并孵育 48 小时。
      注意：从此步骤开始，必须按照机构规则在生物安全 3 级 （BSL3） 组织培养设施中进行工作。
   9. 在第 5 天，收集含病毒培养基并通过 0.22 μm 注射器过滤器过滤。
   10. 等分并储存在-80°C。
2. 病毒转导
   1. 第 1 天：在 6 孔板的 2 个孔中以 60% 汇合度接种低传代成纤维细胞。
   2. 第 2 天：用 1 mL 先前生产的含有 8 μg/mL 聚苯的 pBABE-puro-hTERT 逆转录病毒制剂替换培养基，并孵育 12-16 小时。
   3. 第 3 天：用 2 mL cDMEM 替换含病毒培养基。
   4. 第 4 天：24 小时后，开始两轮 48 小时嘌呤霉素选择 （2 μg/mL）。
      注意：应根据经验确定每批抗生素和细胞类型的浓度，并应选择最低浓度以在选择后 4 天内杀死所有细胞。
   5. 第 8 天：检查未感染的对照细胞是否全部死亡。用 cDMEM 替换培养基，让感染细胞生长直至汇合，然后以 1：3 的比例传代。让细胞达到汇合并再次以 1：3 分裂。在此阶段，细胞可以退出 BLS3 设施。
      注意：尽快准备冷冻等分试样。为确保发生永生化，传代细胞5-6次，并对其形态和复制率进行评分，这些形态和复制率不应随着传代而改变。使用下述方法在功能上将永生化细胞与其主要对应物进行比较。

6. 成纤维细胞表征

1. 表型分析分离细胞的 CAF/NF 标志物表达，并在功能上表征它们对肿瘤细胞的潜在促癌活性。
   注意：表2和材料表分别报告了优化用于评估RNA和蛋白质水平的标记物表达水平的qPCR寡核苷酸和抗体。请注意，针对成纤维细胞激活蛋白 （FAP） 的抗体通常是非特异性的。确保包括适当的阳性和阴性对照^31,32。可以使用不同的方法来评估成纤维细胞和肿瘤细胞之间的串扰。在这里，描述了两种替代方法，包括用源自CAF或NF的条件培养基（CM）处理肿瘤细胞，或共培养成纤维细胞和肿瘤细胞。描述了这两种方法增强肿瘤细胞增殖的功效。

7、条件培养基的制备和浓缩

注意：条件培养基在收集后被浓缩并准确计量，以方便不同细胞之间的比较。

1. 将细胞以 70% 汇合度接种在 cDMEM 中的 15 cm 培养皿中。
2. 第二天，切换到 15 mL 饥饿培养基（不含 FBS 的 DMEM）并孵育 48 小时以产生 CM。
3. 收集CM，在室温下以300 x g 离心5分钟，然后通过0.22μm过滤器过滤以消除细胞碎片并灭菌。
4. 转移到浓缩管（MWCO 10,000 Da）中，并在2000 x g 和4°C下离心20分钟，或根据制造商的说明，获得约1mL的浓缩CM（conCM），即15 x浓度。
5. 将conCM等分并储存在-80°C。
6. 使用比色蛋白质测定法量化收集的conCM的蛋白质含量。
   注意：获得的平均浓度为0.5和2μg/μL。仍然可以使用较低的浓度。

8. 增殖测定

注意：在两种不同的设置下使用活细胞分析仪器评估细胞增殖（使用 DU145 或 LNCaP 人 PCa 细胞系），用 conCM 处理肿瘤细胞，或将它们与 CAF 或 NF 共培养。在这种情况下，必须使用荧光肿瘤细胞。代表性结果如 图 3 所示。

1. 用 conCM 治疗后的增殖测定
   注意：该协议针对DU145细胞进行了优化;不同的单元格可能需要调整。
   1. 将肿瘤细胞接种在 96 孔板（750 个细胞/孔）中的 cDMEM 中，考虑每种条件至少 3 次重复，并孵育 O/N。
   2. 用饥饿培养基代替cDMEM，无论是否补充，50μg/mL的conCM。
   3. 将板转移到培养箱内的活细胞分析仪器室。
   4. 在 37 °C 下加热 30 分钟，然后开始第一次扫描。
   5. 使用相差通道，选择合适的物镜和所需场/孔的数量（建议使用 10 倍物镜和 5 个场/孔）和标准扫描类型。每 6 小时扫描一次，持续 4-5 天（持续时间必须根据条件和细胞类型根据经验确定）。
   6. 根据制造商的说明进行分析（参见 材料表）。
   7. 计算每个孔（每种条件的技术重复）相对于其值在时间零时的倍数变化。生成相应的图表并使用适当的软件评估统计显着性。
2. 共培养后的增殖测定
   1. 在 96 孔板中的 cDMEM 中以 1：3 的比例共接种 750 个表达 RFP 的 DU145 细胞和 CAF 或 NF。
   2. 第二天，切换到 2% FBS DMEM。将板转移到培养箱中的活细胞分析仪器室中，并每 6 小时开始一次标准扫描，持续 4 天，同时使用相差和橙色通道。
   3. 根据制造商的说明进行增殖分析（参见 材料表）。
   4. 计算每个孔（每种条件的技术重复）相对于其值在时间零时的倍数变化。生成相应的图表并使用适当的软件评估统计显着性。

9. 伤口愈合迁移试验

注意：在这里，提出了经典划痕测定³³的自动化版本，以使用活细胞分析仪器测量细胞迁移。

1. 将肿瘤细胞接种在适用于活细胞分析仪器的 96 孔板中，以获得汇合的单层。
2. 第二天，用10 ug / mL丝裂霉素C处理细胞2小时。
   注意：此步骤对于避免测定过程中的细胞增殖至关重要，这会混淆结果。
3. 按照制造商的说明在孔上涂抹划痕（参见 材料表）。
4. 用 100 μL PBS 洗涤以去除分离的细胞。
5. 加入饥饿培养基，50 mg/mL 或不带（对照）。
6. 将板放入培养箱的活细胞分析室中。
7. 30 分钟后，根据细胞和条件，每 4 小时对推荐的伤口愈合扫描方案进行编程，持续 1 天或更长时间。
8. 根据制造商的说明分析结果（参见 材料表）。

10. 软琼脂测定的锚定非依赖性生长

1. 在 12 孔板中以 70% 汇合度将 CAF 或 NF 接种，留下三个空孔作为对照。
2. 第二天，在无菌条件下，在50mL锥形管中将0.45g低熔点琼脂加入12.5mL PBS中，制备4x软琼脂储备溶液（3.6%）。
3. 溶解在微波炉中。当心过度沸腾会导致溶液浓缩。
4. 在 37 °C 下冷却，然后用预热的 cDMEM 以 1：4 稀释制备 1x 工作溶液。
5. 从 12 孔板中吸出培养基，并向每个孔中加入 500 μL 1x 琼脂溶液。
6. 让它在4°C下凝固20分钟，同时将琼脂溶液的其余部分储存在37°C下。
7. 同时，对肿瘤细胞进行胰蛋白酶消化并制备2 x 10⁴ cell / mL的细胞悬液。
8. 通过多次移液混合等体积的细胞悬液和琼脂 1x 溶液，并在每个孔中的第一琼脂层顶部分配 500 μL（即 5000 个细胞）。确保准备至少 10% 过量的细胞悬液。
9. 通过在4°C孵育20分钟让琼脂凝固。
10. 向每个孔中加入 1 mL cDMEM，并通过从孔边缘轻轻吸出培养基并将新鲜培养基添加到中心，几乎滴落以避免移位软琼脂层，每隔一天更新一次。
11. 孵育直到出现容易看到的菌落。DU145 细胞通常需要大约 12 天，略有变化。
12. 通过加入200μL硝基蓝四唑氯化物溶液（PBS中的1mg / mL）丢弃培养基和染色菌落。在加湿的培养箱中在37°C下孵育过夜。
13. 菌落染色后，丢弃染料溶液并使用体视显微镜获取图像。将板放在显微镜载物台上，并将放大倍数设置为最低值（0.8 倍），以确保整个孔可见。使用粗焦旋钮使菌落清晰对焦，然后在捕捉图像之前调整照明和模式设置。
14. 按照补充文件1中提供的步骤，使用适当的软件³⁴量化菌落数量和占用面积。
15. 对菌落的数量和大小分布进行评分（见 图4）。

通过该方案成功分离了来自 7 名高级别 PCa 患者的 CAF 和 NF 对。患者手术年龄和格里森评分总结在表 3 中。为了评估衍生成纤维细胞群的纯度，将传代两个原代CAF和NF分离并用指定的荧光抗体或碘化丙啶染色以评估细胞灭亡。随后FACS分析的代表性结果如图2A所示，突出显示了门控策略和每个标记物呈阳性的细胞百分比。该分析包括上皮细胞 （EpCAM）、内皮细胞 （CD31）、免疫细胞 （CD45） 和活化成纤维细胞 （CD90） 的标志物。结果证实了纯成纤维细胞的成功分离，因为细胞大多对上皮、内皮或免疫细胞标志物呈阴性，并且对 CD90 显示出可变的阳性，CD90 被认为是 CAF 激活的标志物35,36。在许多情况下，特别是在早期传代时，与NF相比，CAF表现出更像纺锤体的形态，如图2B所示。然而，这些形态差异往往会随着随后的段落而减弱。

为了评估CAF和NF对DU145细胞增殖的影响，使用两种替代方法进行增殖测定：用来自CAF / NF对的conCM处理PCa细胞（图3A，B），或以1：3的比例共接种PCa细胞和成纤维细胞（图3C，D）。使用荧光 RFP-DU145 细胞，可以通过活细胞分析仪器橙色过滤器进行特异性检测，从而可以区分两种细胞类型。所示实验是使用来自同一患者的 CAF 和 NF 进行的。这两种方法都可以证明成纤维细胞的促增殖活性。然而，CAF和NF之间的差异主要在conCM方法中很明显，如图3B，D所示。来自不同CAF/NF对的conCM的可变效应如图3E所示。

非安克雷奇生长是一个通常被认为是转移能力代表的特征。在评估 CAF/NFs 对 PCa 细胞锚定非依赖性生长影响的几种方法中，通过在不直接接触的情况下共培养成纤维细胞和肿瘤细胞获得了最佳结果。将成纤维细胞接种在12孔板中，并在cDMEM中覆盖一层0.9%软琼脂，在其上分层0.45%软琼脂cDMEM中的肿瘤细胞。在 12 天内监测菌落形成。获得的DU145菌落的代表性图像如 图4A所示，以及分析不同大小菌落数的相应图表。值得注意的是，与没有成纤维细胞饲养层的对照细胞相比，CAF和NFs都能够类似地刺激DU145细胞的集落形成能力。菌落也往往会变大，这表明增殖增加。我们在这种测定中偶尔遇到的一个问题是成纤维细胞层的早期脱落，这可能是由于铺板时的软琼脂密度或温度不正确。在这些情况下，实验被停止（图4B）。

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作者声明没有利益冲突。