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前列腺癌相关成纤维细胞的分离、培养与表征

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DOI：

10.3791/68367

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2025年8月1日

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1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Department of Science and Technological Innovation, University of Piemonte Orientale, 3Division of Urology, Department of Surgical Sciences, University of Turin, 4Department of Surgical Sciences and Urology, Città della Salute e della Scienza di Torino, University of Turin, 5Department of Pathology, University of Turin, and AOU Città della Salute e della Scienza

本文内容

摘要

本方案提供了从根治性前列腺切除术标本中分离、扩增和永生化成纤维细胞的完整操作流程。此外，还介绍了利用条件培养基处理和共培养技术评估成纤维细胞与肿瘤细胞之间相互作用功能效应的实验方法。

摘要

肿瘤间质可被肿瘤细胞主动重塑，从而获得促肿瘤特性，因此成为癌症研究的关键焦点。在间质成分中，癌症相关成纤维细胞（CAFs）通常是肿瘤微环境（TME）中最丰富的细胞类型，通过与肿瘤细胞及其他间质成分的相互作用，在促进癌症进展中发挥关键作用。阐明这些相互作用背后的机制，需要可靠的分离方法 并进行表征 CAFs，这也有助于为开发靶向CAFs的新型癌症疗法奠定基础。本研究介绍了一种从前列腺癌（PCa）患者根治性前列腺切除术标本的肿瘤组织及其邻近正常区域中分离成纤维细胞的方法。该方法能够从同一供体中同步分离肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）及其对应的正常成纤维细胞（NFs），从而构建配对的实验体系。本文提供了详细的实验方案，用于原代CAFs和NFs的培养，以支持后续的体外分析，并介绍了其永生化方法，以便于长期研究。我们还描述了多种功能学检测方法，用于比较CAFs与NFs对癌细胞行为的影响，包括细胞增殖、迁移能力以及非贴壁依赖性生长。文中详述了两种互补的实验策略：一是使用成纤维细胞来源的条件培养基（CM）处理癌细胞，二是将成纤维细胞与肿瘤细胞进行直接共培养。上述方法共同构成了 一种用于研究癌相关成纤维细胞（CAFs）与肿瘤细胞之间动态相互作用的综合工具包，不仅适用于前列腺癌（PCa），还可能广泛适用于多种人类癌症。此外，对这些相互作用的分子表征可能揭示CAFs驱动肿瘤发生的關鍵介质，为治疗干预提供有前景的靶点。

引言

前列腺癌（PCa）是全球近三分之二国家中男性最常被诊断出的癌症。2022年，全球约报告了150万例新发病例，导致39.7万人死亡。这些数据使前列腺癌成为男性中第二常见的癌症，以及男性癌症相关死亡的第五大主要原因1。

前列腺癌是一种多灶性且生物学上复杂的疾病，其特征是显著的肿瘤间异质性2,3,4、多种分子亚型以及不同的临床结局5,6，这些因素均显著影响预后和治疗反应7。

尽管肿瘤微环境（TME）在前列腺肿瘤的发生和进展中的关键作用已得到充分证实8,9，肿瘤细胞与周围间质成分之间的分子相互作用仍尚未完全阐明。虽然已明确前列腺肿瘤微环境（TME）在肿瘤起始和进展中发挥关键作用，但肿瘤细胞与周围间质之间的分子相互作用仍缺乏充分定义。TME包含多种间质细胞，包括间充质来源和免疫来源的细胞，这些细胞在接收到肿瘤分泌的信号后....

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方案

本研究完全遵循意大利都灵市Città della Salute Molinette医院生物伦理委员会批准的临床样本使用机构指南。所有样本均在参与患者签署知情同意书后获取。以下部分提供了分离癌症相关成纤维细胞（CAFs）及其配对的正常成纤维细胞（NF）的详细分步操作方案。该方案包括肿瘤组织及相邻非肿瘤组织的解剖、组织处理、细胞培养，以及分离细胞的表型和功能表征。所有操作必须在经认证的生物安全柜内无菌条件下进行。细胞培养条件为37 °C、含5% CO2的湿润环境，使用完全杜氏改良伊格尔培养基（cDMEM），并添加10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素，除非另有说明。所有离心步骤均需启用刹车。有关本方案中使用的所有试剂、材料和设备的完整清单，请参见材料表。该方法已针对高危前列腺癌样本（Gleason评分4+3或更高）进行了优化。

1. 手术样本解剖

注意：本实验所用样本来自接受根治性前列腺切除术的高分级前列腺癌（PCa）患者的手术标本25 ，样本处理遵循机构内部指南以及国际公认文献和最佳实践所制定的标准操作流程26,27,<....

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结果

采用本方案成功分离了来自7名高级别前列腺癌（PCa）患者的CAF和NF配对样本。患者手术时的年龄和Gleason评分汇总于表3中。为评估所获得成纤维细胞群体的纯度，将第二代原代CAF和NF消化脱离，并使用指定的荧光标记抗体或碘化丙啶染色以评估细胞凋亡情况。后续FACS分析的代表性结果如图2A所示，展示了设门策略及各标志物阳性细胞所占百分比。分析中包含上皮细胞标志物（EpCAM）、内皮细胞标志物（CD31）、免疫细胞标志物（CD45）以及活化成纤维细胞标志物（CD90）。结果显示，所分离的细胞几乎不表达上皮、内皮或免疫细胞标志物，而对CD90呈不同程度的阳性表达，表明已成功获得高纯度的成纤维细胞；CD90被认为是CAF活化的标志物35,36。在多数情况下，尤其是在早期传代时，CAF相较于NF呈现更明显的梭形形态，如图2B所示。然而，随着传代次数增加，这种形态学差异趋于减弱.......

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讨论

从前列腺癌（PCa）组织中分离和分析细胞提供了一个相关的实验模型，特别是考虑到现有的动物模型无法完全复制人类前列腺的解剖结构和疾病进展过程37。黑猩猩的前列腺在解剖结构上与人类相似，但其疾病进展缓慢且具有随机性，同时还存在伦理限制。犬类在前列腺结构和病理生物学方面与人类差异显著，并仅发生零星的、与年龄相关的前列腺疾病。常用实验动物如大鼠和小鼠在前列腺解剖结构、上皮-间质比例以及干细胞标志物表达方面均存在差异。此外，小鼠难以诱导前列腺恶性肿瘤，而大鼠则需要激素类致癌物，因此这些模型在研究人类前列腺疾病时并不理想37。体内人源-小鼠异种移植模型是一个有价值的工具，尤其适用于临床前治疗试验。然而，其主要局限在于缺乏功能性的人类免疫细胞以及肿瘤微环境（TME）中的其他关键组分，如癌症相关成纤维细胞（CAFs），后者在肿瘤进展中发挥着关键作用（详见Sasaki等人的综述13）。

一种用于研究前列腺癌细胞与癌症相关成纤维细胞（CAFs.......

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本工作由意大利癌症研究协会（AIRC）、 IG16930 和 IG24851（资助对象：V.P.）；意大利大学与研究部（MIUR PRIN 2017 和 2022，资助对象：V.P.）；列支敦士登 Truus 和 Gerrit van Riemsdijk 基金会向 V.P. 提供的捐赠；皮埃蒙特大区（Deflect 项目）资助。A.S. 获得意大利癌症研究基金会（FIRC）博士后奖学金支持，L.A. 由 Umberto Veronesi 基金会资助。图 2 使用 BioRender.com 制作。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12 孔板Sarstedt833921
24 孔板Sarstedt833922
6 孔板Sarstedt833920
96 孔板Sarstedt833924
抗 GAPDH 小鼠单克隆抗体（6C5）Sigma AldrichCB1001来源：小鼠；WB 稀释比例：1:1000
aSMASigma AldrichA5228 来源：小鼠；WB 稀释比例：1:3000
CaveolinCell Signalling TechnologyCST3267来源：兔；WB 稀释比例：1:1000
CD31-VioBlueMilteny Biotec130-119-980流式细胞术抗体，内皮细胞标志物
CD326-PE（EpCAM）Milteny Biotec130113-826流式细胞术抗体，上皮细胞标志物
CD45-FITCMilteny Biotec130-110769流式细胞术抗体，泛白细胞标志物
CD90-APCMilteny Biotec130-114-903流式细胞术抗体，成纤维细胞标志物
胶原蛋白 VI（COL6A1）Abcamab182744来源：兔；WB 稀释比例：1:1000
15 mL 锥形管Sarstedt62554502
50 mL 锥形管Sarstedt62547254
2 mL Cryopure 微量离心管Sarstedt72380992
100 mm 直径培养皿 Corning353003
100 mm 直径培养皿 Corning353025
60 mm 直径培养皿 Corning353002
二甲基亚砜（DMSO）Sigma AldirchD8418在生物安全柜中使用
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基（DMEM）Gibco119650924 °C 保存，在生物安全柜中使用
FAPAbcamab53066来源：兔；WB 稀释比例：1:500
人源 FcR 封闭试剂Milteny Biotec130-059-901Fc 封闭剂
胎牛血清（FBS）Gibco160000444 °C 保存，在生物安全柜中使用
10 µL 滤芯吸头Sarstedt703010255
100 µL 滤芯吸头Sarstedt703030255
1000 µL 滤芯吸头Sarstedt703060255
20 µL 滤芯吸头Sarstedt703030265
200 µL 滤芯吸头Sarstedt703031255
Filtropur S Plus 0.20 µm Sarstedt831826102
镊子2Biol1102412
FSP1/S100A4Cell Signalling TechnologyD9F9D (13018)来源：兔；WB 稀释比例：1:2000
IL6Abclonal technologyA0286来源：兔；WB 稀释比例：1:1000
ImageJ美国国立卫生研究院version 1.53c图像分析软件
incucyte imagelock 96 孔板SartoriousBA-04857
Incucyte® SX5SartoriousSX5活细胞分析仪 
Lipofectamine 2000 转染试剂ThermoFisher Scientific11668019阳离子脂质介导的转染试剂
MACS® 组织保存液Milteny Biotec130-100-008
酶标仪（600 nm 吸光度）PromegaGM3500
1.5 mL 微量离心管 Sarstedt7269001
NcadAbcamab18203来源：兔；WB 稀释比例：1:1000
硝基蓝四氮唑 Sigma Aldirchn5514
Parafilm Sigma AldirchHS234526B
pBABE-puro-hTERTAddgene1771-20 °C 保存，在生物安全柜中使用
pCL-AmphoNovus Biological NBP2-29541-20 °C 保存，在生物安全柜中使用
PDGFRBSanta Cruzsc-432来源：兔；WB 稀释比例：1:1000
青霉素-链霉素（PS，10,000 μg/mL） Gibco151401224 °C 保存，在生物安全柜中使用
相差显微镜 Olympus BX42
磷酸盐缓冲液 （PBS）自制NaCl，137 mM；KCl，2.7 mM；Na2HPO4，10 mM；KH2PO4，1.8 mM。高压灭菌后室温保存
多聚-L-赖氨酸溶液Sigma AldirchP89204 °C 保存，在生物安全柜中使用
嘌呤霉素二盐酸盐Sigma AldirchP8833
Secura 半微量电子天平SartoriusSECURA125-1S
10 mL 血清移液管 Sarstedt861254001
2 mL 血清移液管 Sarstedt861252001
25 mL 血清移液管 Sarstedt861256001
5 mL 血清移液管 Sarstedt861253001
STAT3CST9139来源：小鼠；WB 稀释比例：1:1000
STAT3 Y705CST9131来源：兔；WB 稀释比例：1:1000
体视显微镜LeicaMZ125
10 mL 注射器Pentaferte00202260D12
TermoMixerEppendorph22331
胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红Gibco15400054
VimSanta Cruzsc-6260来源：小鼠；WB 稀释比例：1:2000
Vivaspin 20 离心浓缩器 Sigma AldirchZ614602截留分子量 10,000 Da 
瓦格纳剪刀2Biol14070-12

参考文献

  1. Bray, F. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (6), 229-263 (2024).
  2. Yadav, S. S., Stockert, J. A., Hackert, V., Yadav, K. K., Tewari, A. K. Intratumo....

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