本方案已针对18个耐药相关区域的靶向深度测序进行了优化 结核分枝杆菌 使用长读长测序平台进行测序，随后利用专为长读长数据设计的结核病特异性生物信息学分析流程进行分析。
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摘要
摘要
世界卫生组织（WHO）持续强调迫切需要一种快速、经济高效且操作简便的结核病（TB）及耐药结核病（DR-TB）诊断方法。由世界卫生组织推荐的下一代测序（NGS）技术已显著提升了耐药结核病的检出能力。其中，靶向NGS（tNGS）可特异性检测与耐药相关的基因突变，从而避免了传统基于培养的诊断方法。一种广泛应用的tNGS检测方法可实现快速且全面的药物敏感性测试，但其主要针对高准确度测序平台进行了优化。然而，这些测序系统的高昂成本限制了其在中低收入国家（尤其是在非洲地区）的可及性。便携式测序技术提供了一种颇具前景的替代方案，具有更高的灵活性并降低了基础设施要求。在本研究中，从利福平耐药结核病（RR-TB）分离株中提取DNA，通过tNGS检测进行扩增，并在便携式测序平台上进行测序。相同的扩增产物也在高准确度的短读长测序平台上进行测序，作为参考标准。便携式测序仪产生的数据采用专为长读长测序设计的生物信息学分析流程进行处理，而短读长测序数据则使用成熟的基于网络的应用程序进行分析。分析结果显示，长读长测序方法成功识别出短读长测序所检出的高频耐药相关变异，但在检测低频变异方面存在局限性。
引言
结核病（TB）仍然是全球范围内导致死亡的主要原因之一，尤其在中低收入国家持续构成重大的公共卫生挑战1，2。尽管已开展多项旨在加强结核病防控措施的行动，但进展仍然缓慢，部分原因在于难以实现快速、准确、经济且全面的诊断技术3，4，5。虽然分子诊断方法（如线探针检测法（LPAs）和自动核酸扩增检测（NAATs））已加快了结核病及耐药结核病（DR-TB）的检出速度，但其突变检测范围有限，从而限制了全面的药物敏感性测试（DST）。这一局限性在结核病高负担国家尤为突出6，7，8，9。
为解决这些局限性，世界卫生组织（WHO）建议采用下一代测序（NGS）技术，该技术已成为结核病监测和耐药检测的有力工具10,11。全基因组....
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方案
本研究作为TS ELiOT项目的一部分，于2021年10月20日获得斯泰伦博斯大学人类研究伦理委员会（HREC）的伦理批准（编号：N21/09/093）。此外，研究还获得了西开普省健康研究部门的授权，允许使用政府设施。样本由国家健康实验室服务局绿点实验室（NHLS Green Point）与斯泰伦博斯大学合作采集，斯泰伦博斯大学人类研究伦理委员会批准编号为N09/11/296。所用试剂和设备详见材料表。
1. 样品制备
- 热灭活
- 在BSL-3条件下，将MGIT培养物于80 °C孵育1小时，以实现完全热灭活。
- 采用InstaGene法进行DNA提取29。
- DNA提取
- 将5 mL热灭活的MGIT培养物转移至15 mL离心管中。
- 在室温（RT）下以4000 × g离心30分钟。
- 用移液器小心吸除上清液，保留沉淀。
- 向沉淀中加入200 µL基于螯合的DNA提取试剂，并在56 °C孵育15分钟。
- 将溶液转移至2 mL螺口管中，每管加入三颗直径为2 mm的玻璃珠。
- 涡旋振荡10秒以分散细胞，随后将管子置于干浴孵....
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结果
所选的DNA提取方法因其效率高且得率优于其他快速技术而被采用。该方法能够稳定地提取出高质量的基因组DNA（gDNA），并通过整合基于磁珠的纯化步骤，在降低单样本成本的同时缩短了处理时间。这得益于省略了额外的质量控制评估步骤（如分光光度法检测），仅使用荧光定量法作为DNA定量工具。PCR扩增后的DNA浓度均适用于短读长和长读长测序平台表2扩增子完整性通过片段分析进一步确认 通过 琼脂糖凝胶电泳（图2然而，由于扩增子浓度过低，菌株89和136未进行长读长测序，这一点在两者中均有体现 表2 和 图2.
从DNA提取到在长读长测序平台上生成结果的完整工作流程在36小时内完成（不含间歇时间），且证明符合短读长测序所需的周转时间（表3）。短读长测序数据采用针对该平台优化的基于网页的分析流程进行分析，而长读长测序数据则按照方案.......
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讨论
本研究中，长读长测序平台展现出显著优势，尤其体现在能够快速完成测序并实现持续高覆盖广度。在所有成功测序的分离株中，覆盖广度达到99.9%，表明耐药相关基因组区域几乎被完全覆盖。所有靶向基因的平均覆盖深度为4462X，其中eis基因的深度最高，达22,242.08X，而rrs基因最低，为99.46X。这些数值反映了该平台生成足量数据以支持可靠耐药性预测的能力4。
从DNA提取到生成结果的整个工作流程在36小时内完成（不含间歇时间），且与短读长测序的周转时间相兼容。4,23这一简化流程，结合单次定量步骤的使用 通过 Qubit检测和最低限度的质量控制检查，有助于减少操作时间以及每个样本的潜在成本23然而，该工作流程的效率依赖于一些关键步骤，例如高质量的DNA提取和精确的文库制备。30
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致谢
我们衷心感谢斯泰伦博斯大学南非医学研究理事会结核病中心提供本研究所必需的资源和设施。同时，我们深切感谢TS ELiOT研究团队提供了对本研究至关重要的样本。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 mL &和 1.5 mL 或 2 mL 低吸附管 | Eppendorf | EP0030108051-250EA | |
| 1kb DNA梯尺 | 赛默飞世尔科技 | SM0311 | |
| 2 mL 螺口管 | 科学专业公司 | P2TUB056C-0001.5ST | |
| 2 mm 无菌玻璃珠 | Sigma-Aldrich | Z273627-1EA | |
| AMPure XP 磁珠 | 贝克曼库尔特 | A63881 | |
| Deeplex Myc-TB | GenoScreen | 20090205 | |
| 电泳槽 | 赛默飞世尔科技 | A25977 | |
| 乙醇，纯品 | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| FastPrep 匀浆器 | MP Biomedicals | 116005500 | |
| 滤芯吸头（10 µL | Bio-Smart Scientific | FT-10-R | |
| 滤芯吸头（1000 µL | Bio-Smart Scientific | FT-1000-R | |
| 滤器吸头（20 µL | Bio-Smart Scientific | FT-20-R | |
| 滤芯吸头（200 µL | Bio-Smart Scientific | FT-200-R | |
| 流动池 | Oxford Nanopore Technologies | FLO-MIN114 | |
| 加热块 | Eppendorf | 5382000031 | |
| InstaGene基质 | Bio-Rad | BBRD7326030 | |
| 磁力架 | 赛默飞世尔科技 | 12321D | |
| 微型离心机 | Eppendorf | 5406000046 | |
| MinION | Oxford Nanopore Technologies | MK1B | |
| V14 原始条形码试剂盒 | Oxford Nanopore Technologies | SQK-NBD114.24 | |
| NEB 平末端/TA 连接酶预混液 | NEB | M0367 | |
| NEBNext 快速连接模块 | NEB | E6056 | |
| NEBNext Ultra II 末端修复/dA加尾模块 | NEB | E7546 | |
| 无核酸酶水（NFW） | 赛默飞世尔科技 | AM9937 | |
| 移液器（P10、P20、P200 和 P1000） | Eppendorf | EP3123000918-1EA | |
| Qubit 检测管 | 赛默飞世尔科技 | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS 检测试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | Q33231 | |
| Qubit 荧光仪 | 赛默飞世尔科技 | Q33226 | |
| SYBR Safe DNA凝胶染料 | 赛默飞世尔科技 | S33102 | |
| UltraPure 琼脂糖 | 赛默飞世尔科技 | 17852 | |
| Universal Hood III 凝胶成像系统（Molecular Imager Gel Doc XR System） | 伯乐（Bio-Rad） | 170-8170 | |
| 涡旋混合器 | Lasec | WMBB0L0E0216 |
参考文献
- Tuberculosis report. Baltimore Health News. , WHO. (2022).
- WHO Malaria Department report. Report 20-23. , WHO. (2023).
- The End Strategy TB. 53 (1), WHO. 1689-1699 (2015).
- Cabibbe, A. M., et al.
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