使用长读长测序技术进行扩增子测序

摘要

该协议针对使用长读长测序平台对 结核分枝 杆菌中 18 个耐药区域进行靶向深度测序进行了优化，然后使用专为长读长数据设计的结核病特异性生物信息学管道进行分析。

摘要

世界卫生组织 （WHO） 继续强调迫切需要一种快速、具有成本效益且用户友好的结核病 （TB） 和耐药结核病 （DR-TB） 诊断方法。世界卫生组织认可的下一代测序 （NGS） 技术显着改善了耐药结核病的检测。其中，靶向NGS（tNGS）能够集中检测与耐药性相关的基因突变，无需传统的基于培养的诊断。一种广泛使用的 tNGS 检测可提供快速、全面的药敏性测试，但主要针对高精度测序平台进行了优化。然而，这些测序系统的高成本限制了低收入和中等收入国家，特别是整个非洲的可及性。便携式测序技术提供了一种有前途的替代方案，提供了灵活性并降低了基础设施要求。在这项研究中，从利福平耐药结核病 （RR-TB） 分离株中提取 DNA，使用 tNGS 测定进行扩增，并在便携式测序平台上进行测序。相同的扩增产物也在高精度短读长测序平台上进行测序，作为参考。来自便携式测序仪的数据使用专为长读长测序设计的生物信息学管道进行处理，而短读长测序数据则使用已建立的基于网络的应用程序进行分析。分析表明，长读长测序方法成功识别了短读长测序检测到的高频抗性相关变异，但在检测低频变异方面存在局限性。

引言

结核病仍然是全球死亡的主要原因，并带来了持续的公共卫生挑战，特别是在低收入和中等收入国家 ^1,2。尽管采取了旨在加强结核病控制措施的举措，但进展缓慢，部分原因是难以实现快速、准确、具有成本效益和全面的诊断技术 ^3,4,5。虽然线探针检测 （LPA） 和自动核酸扩增检测 （NAAT） 等分子诊断方法加快了结核病和耐药结核病 （DR-TB） 的鉴定速度，但其有限的突变检测限制了彻底的药敏试验 （DST）。这种限制在结核病高负担国家尤为明显 6,7,8,9。

为了解决这些局限性，世界卫生组织 （WHO） 建议使用下一代测序 （NGS） 技术，该技术已成为结核病监测和耐药性检测的有力工具^10,11。全基因组测序 （WGS） 和靶向 NGS （tNGS） 方法都提供了更广泛的突变覆盖范围，能够识别多种药物中的耐药性相关变异 8,12,13,14,15。虽然全基因组测序（WGS）提供了全面的DST报告，但其对培养的依赖使其不适合快速诊断，因为培养可能需要长达六周的时间15,16,17。靶向NGS提供了更好的替代方案，因为它不依赖于培养;可以直接从临床标本¹⁸进行测序。因此，WHO 建议对 DST 使用三种 tNGS 测定： Deeplex Myc-TB 测定：该测定可检测对利福平、异烟肼、氟喹诺酮类、氨基糖苷类（阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素）、乙胺丁醇、吡嗪酰胺和乙硫异烟胺的耐药性 19,20,21。前哨结核病测定：该测定针对对利福平、异烟肼、氟喹诺酮类药物和二线注射药物的耐药性^18,20。AQ-TB 测定：可识别对利福平、异烟肼、氟喹诺酮类药物和二线注射药物的耐药性。由于其高精度，这些检测已针对短读长平台的使用进行了优化²⁰.另一方面，ONT MinION 长读长平台提供实时数据、可移植性和具有成本效益的实施潜力^22,23。然而，NGS的广泛使用受到基础设施和成本需求的限制，特别是对于短读长系统¹⁰。

Deeplex 检测是三种推荐检测中最全面的。该检测最初设计用于对 18 个与 13 种抗结核药物耐药相关的区域进行多重 PCR。然而，WHO推荐用于10种抗结核药物，表明具有足够的敏感性和特异性。本研究对其进行了优化，以与长读长测序平台 ONT MK1B MinION 一起使用。该平台的便携式和可重复使用的流通池系统降低了^{每个样品的}基础设施和潜在的测序成本^4,22,23。虽然已经开发出其他长读长兼容的检测方法，但它们的 DST 范围往往有限，通常仅针对狭窄范围的耐药基因。相比之下，该检测提供了广泛的靶标覆盖范围，使其成为去中心化 DST^24,25 更全面的诊断工具。表1提供了通过测定扩增的基因组靶标及其相应药物关联的详细列表，突出了测定的诊断能力²⁵。

在提取DNA之前，必须在生物安全3级（BSL-3）条件下对样品进行净化和灭活，遵循必要的安全预防措施25,26,27。每次运行中都应纳入内部扩增和外部对照，并通过阴性对照和常规实验室评估跟踪污染²⁵。测序后应评估重要的质量指标，包括读取深度、覆盖广度和扩增成功率。对于靶向测序，WHO建议每个扩增子的最小读取深度为100倍，并充分覆盖所有靶向耐药区域，以便检测存在于≥5%²⁸的次要变异。世界卫生组织认可这些用于识别一线和二线药物耐药性的靶向测序方法，前提是质量保证体系已经建立，并且所有目标区域都得到充分覆盖²⁸.

方案

这项研究是作为 TS ELiOT 项目的一部分进行的，该项目于 2021 年 10 月 20 日获得了斯泰伦博斯大学人类研究伦理委员会 （HREC） 的伦理批准 （N21/09/093）。此外，它还获得了西开普省健康研究中心使用政府设施的授权。样本是通过与 NHLS 绿点和斯泰伦博斯大学的合作收集的，SU HREC 批准号为 N09/11/296。所使用的试剂和设备列在 材料表中。

1. 样品制备

1. 热灭活
   1. 将MGIT培养物在80°C下孵育1小时，以在BSL-3条件下实现完全热灭活。
   2. 使用 InstaGene 方法²⁹ 继续提取 DNA。
2. DNA提取
   1. 将 5 mL 热灭活的 MGIT 培养物放入 15 mL 管中。
   2. 在室温 （RT） 下以 4000 x g 离心 30 分钟。
   3. 通过移液小心地去除上清液，留下沉淀物。
   4. 向沉淀物中加入 200 μL 基于螯合的 DNA 提取试剂，并在 56 °C 下孵育 15 分钟。
   5. 将溶液转移到 2 mL 螺旋盖管中，并在每个管中加入三个直径为 2 mm 的玻璃珠。
   6. 涡旋 10 秒以扩散细胞，并将试管放入 100°C 的干浴培养箱中 8 分钟。
   7. 使用具有以下设置的打珠均质器对样品进行均质化：以 4.0 m/s 的速度进行 3 个循环，每次 20 秒。
   8. 在室温下以 12,000 x g 离心 15 分钟，小心地将 130 μL 上清液（含 DNA 的液体）转移到 1.5 mL 管中，避免沉淀物和碎屑。
   9. 通过轻弹或涡旋重悬珠子，并将 156 μL 珠子加入含有提取 DNA 的 1.5 mL 管中。
   10. 缓慢上下移液10次以混合并在室温下孵育5分钟。
   11. 将试管放在磁架上 5 分钟以分离 DNA 结合的珠子。
       注意：透明的上清液应出现在面向磁铁的管侧的致密深色磁珠颗粒上方，表明已准备好去除上清液。
   12. 移液去除上清液，不要干扰珠子。
   13. 在架子上将 100 μL 新鲜制备的 80% 乙醇加入珠子沉淀中，静置 30 秒，然后除去乙醇。重复洗涤步骤。
   14. 在室温下风干珠子颗粒 5 分钟。在继续下一步之前，确保珠子颗粒呈哑光状态并且没有可见液体残留。
   15. 从磁架上取下管子。
   16. 将 25 μL 无核酸酶水 （NFW） 直接添加到干燥的珠子中，并通过轻轻上下移液 10 次重悬。
   17. 在室温下孵育5分钟。
   18. 将试管放回磁架上再放置 5 分钟。
   19. 小心地将洗脱的 DNA（上清液）转移到新的 1.5 mL 管中。
   20. 使用基于荧光的高灵敏度 dsDNA 定量试剂测量 DNA 浓度。
       注意：DNA可以储存在-20°C冰箱中或进行PCR。
3. 扩增 （PCR）
   1. 按照制造商的说明进行多重 PCR 和 PCR 后纯化²⁵.
   2. 使用基于荧光的高灵敏度 dsDNA 定量试剂测量 DNA 浓度。
4. 电泳
   1. 通过微波加热将琼脂糖粉末溶解在 1x TAE 缓冲液中直至完全熔化，制备 2% 琼脂糖凝胶。
   2. 将 5 μL 无毒荧光 DNA 凝胶染色剂加入熔化的琼脂糖中并充分混合。
   3. 将凝胶混合物倒入装有梳子的凝胶浇注托盘中以形成孔。
   4. 让凝胶在室温下凝固。
   5. 凝固后，取下梳子并将凝胶托盘放入装有 1x TAE 缓冲液的电泳槽中。
   6. 将 5 μL kb DNA 分子量标准品与 5 μL 上样缓冲液混合到第一个孔中。
   7. 对于每个 PCR 产物，将 5 μL 产物与 5 μL 上样缓冲液混合，然后加载到单独的孔中。
   8. 将凝胶在100 V下运行1小时。
   9. 使用带有透照的凝胶记录系统可视化 DNA 条带。

2. ONT文库制备

1. 末端制备
   1. 根据浓度计算每个扩增子样品的 100 ng，并将所需体积转移到干净的 PCR 管中。
   2. 要计算给定样品中扩增子的总质量（以 ng 为单位），请将样品的浓度 （ng/μL） 乘以质量控制 （QC） 后的剩余体积 （μL）。
      注意：例如，如果样品的浓度为 2 ng/μL，QC 后剩余体积为 1 μL，则扩增子总质量为：
      总质量 = 2 ng/μL × 1 μL = 45 ng
      要制备 10 ng 扩增子进行测序，请使用稀释公式：
      C₁V₁ = C₂V₂
      其中：C₁ = 45 ng，V₁ = 未知，C₂ = 10 ng，V₂ = 1 μL，V₁ = （C₂ × V₂） / C₁ = （10 ng × 1 μL） / 45 ng = μL
      因此，应使用μL初始扩增子样品获得10ngDNA进行测序。
   3. 使用NFW将每个样品的总体积调整为12.5μL。
   4. 通过上下移液 10 次轻轻混合样品并短暂旋转。
   5. 向每个样品中加入 1.75 μL 末端修复和 A 尾反应缓冲液以及 0.75 μL 末端修复和 A 尾酶混合物。
   6. 上下移液10次彻底混合，然后短暂向下旋转。
   7. 将试管在热循环仪中在 25°C 下孵育 30 分钟，然后在 65°C 下孵育 30 分钟。
      注意：在此阶段，如果用户决定停止该过程，建议使用磁珠纯化末端制备的DNA。然后纯化的 DNA 可以在 4 °C 下储存最长 7 天。
2. 原生条码连接
   1. 根据制造商的说明解冻并制备用于DNA纯化和尺寸选择的磁珠、顺磁性DNA净化珠、EDTA和天然条形码（NB01-96），然后将它们放在冰上。
   2. 在新的 PCR 管中，按顺序添加以下物质：2.75 μL 无核酸酶水、1 μL 末端制备的 DNA、1.25 μL 天然条形码 （NB01-96） 和 5 μL DNA 连接酶混合物。
   3. 通过轻轻移液10次混合每个反应，使用微量离心机短暂旋转，并在室温下孵育20分钟。
   4. 向每个孔中加入 1 μL EDTA，通过移液充分混合，然后短暂旋转。
   5. 将带条形码的样品放入 1.5 mL 微量离心管中。
   6. 通过涡旋重悬 DNA 纯化珠并添加总混合样品体积的 0.7 倍（例如，对于总体积为 253 μL 的 23 个样品，添加 177.1 μL 珠子）。
   7. 通过移液混合溶液，并在室温下在 HulaMixer 上孵育 10 分钟。
   8. 通过将 1600 μL 纯乙醇与 400 μL NFW 混合，制备 2 mL 80% 乙醇。
   9. 将试管放在磁架上 5 分钟，直到洗脱液清澈无色。
   10. 取出并丢弃上清液，不要干扰沉淀。
   11. 用 700 μL 新鲜制备的 80% 乙醇洗涤珠子，不要干扰沉淀，然后取出并丢弃乙醇。
   12. 重复乙醇洗涤步骤。
   13. 短暂离心试管，返回磁架，除去残留的乙醇。
   14. 让珠子风干 30 秒。
   15. 从磁架上取出试管，轻弹将珠子重悬于 35 μL 无核酸酶水中，并在 37 °C 下孵育 10 分钟。
   16. 将试管放回磁架中，直到洗脱液清澈无色。
   17. 将 35 μL 洗脱液转移到干净的 1.5 mL 微量离心管中进行后续步骤。
       注意：在此阶段，文库可以在4°C下储存过夜。
3. 接头结扎和清理
   1. 根据制造商的说明制备快速DNA连接试剂盒并将其放在冰上。
   2. 通过移液混合天然接头 （NA） 和快速连接酶，然后置于冰上。
   3. 在室温、涡旋、离心机下解冻洗脱缓冲液 （EB），并将其置于冰上。
   4. 在室温、涡旋、离心机下解冻短片段缓冲液 （SFB），并置于冰上。
   5. 在 1.5 mL 低结合微量离心管中，混合以下物质：30 μL 混合条形码样品、5 μL 天然接头 （NA）、10 μL 快速连接反应缓冲液和 5 μL 速效 T4 DNA 连接酶。
   6. 轻轻移液混合，短暂离心，并在室温下孵育20分钟。
   7. 通过涡旋重悬 DNA 纯化珠，并在反应中加入 20 μL （0.4x） 珠子。
   8. 通过移液轻轻混合，并在室温下在 HulaMixer 上孵育 10 分钟。
   9. 将珠子沉淀在磁架上并吸出上清液，而不会干扰沉淀。
   10. 通过加入 125 μL 短片段缓冲液 （SFB） 洗涤珠子，轻弹重悬，短暂离心，然后返回磁架。
   11. 将珠子沉淀并吸出上清液;重复洗涤步骤一次。
   12. 短暂离心，将试管放回磁架，并吸出任何残留的上清液。
   13. 从磁架上取出试管，将珠子重悬于 15 μL 洗脱缓冲液 （EB） 中。
   14. 短暂离心并在37°C下孵育10分钟以洗脱DNA。
   15. 将试管放在磁架上，沉淀珠子直至洗脱液清澈无色，然后将 15 μL 洗脱液吸入干净的 1.5 mL 微量离心管中。
   16. 定量 1 μL 洗脱液。
   17. 将文库稀释至 20 fmol（使用 NEB 计算器计算），并使用 12 μL 20 fmol 制备的文库在 R10.4.1 流通池上进行测序。
       注意：文库现在可以在-20°C下储存，允许重复使用。
4. 启动和加载纳米孔测序流通池
   1. 在室温下解冻测序缓冲液 （SB）、文库微球 （LIB）、流通池系绳 （FCT） 和流通池冲洗 （FCF），通过涡旋混合它们，然后将它们旋转下来。
   2. 通过混合 5 μL 牛血清白蛋白 （BSA， 50 mg/mL）、30 μL 流通池系绳 （FCT） 和 1170 μL 流通池冲洗 （FCF） 来制备流通池启动混合物，通过倒置和移液混合溶液。
   3. 打开流通池的引注端口，吸出~20μL缓冲液以去除气泡，将800μL引注混合物加载到引注口中，而不引入气泡，等待5分钟。
   4. 通过将 37.5 μL 测序缓冲液 （SB）、25.5 μL 文库珠 （LIB） 或文库溶液 （LIS） 和 12 μL 20 fmol DNA 文库混合在 1.5 mL 微量离心管中，通过移液彻底混合来制备文库。
   5. 通过轻轻提起流通池样品端口盖，将 200 μL 启动混合物加载到启动端口中而不引入气泡，并准备库进行加载，再次启动流通池。
   6. 通过移液轻轻混合制备的文库，并将 75 μL 文库滴入测序流通池样品端口，确保每一滴在添加下一滴之前流入端口。
   7. 关闭流通池样品口盖，确保塞子进入流通池样品口，然后关闭灌注口。
   8. 将便携式测序设备连接到计算机（带有不间断电源），并使用测序设备控制和分析软件启动测序。
5. 软件参数
   注意：该软件应用程序由 ONT 开发，用于对测序运行进行全面管理和生成详细报告。
   1. 要启动测序过程，请选择“ 开始” 选项，然后选择“ 开始测序”选项。
      注意：然后系统将提示用户指定一个用于文件存储的文件夹，并为您的测序运行提供名称，例如“sequencing_run_1”。然后，单击 “继续设置” 以选择适当的试剂盒名称，例如 library-sequencing-amplicons-native-barcoding-v14-sqk-nbd114-96，并自定义所需的运行时间，例如 20 小时（最长运行时间为 72 小时）。
   2. 接下来，选择输出文件类型，从用于原始输出读取的 POD5 和用于 basecalled 输出的 FASTQ 等选项中进行选择。随后，选择 FAST-Basecalling 模型。
   3. 请注意，一些默认设置包括每 1.5 小时频繁扫描一次孔隙、最小读取长度为 200 bp 和最低质量得分为 8。最后，查看设置并开始阅读过程。

3. 测序后分析

1. 系统要求
   注意：使用 ONT-TB-NF 管道设置环境和分析 结核分枝杆菌 扩增子测序数据的指南。这些说明适用于 Windows（通过 WSL）和 macOS 用户。
   1. 使用以下 -作系统：Windows 10/11（带 WSL2）或 macOS;内存：至少 8 GB RAM（推荐 16 GB）;存储：至少 50 GB 的可用磁盘空间;Internet：下载包和数据所需;权限：能够安装软件和管理环境。
2. 确保以下环境设置：Windows 用户（使用 WSL2）。启用 WSL2。
   1. 以管理员身份打开 PowerShell 并运行： wsl - install。
   2. 出现提示时重新启动计算机。
3. 安装 Ubuntu
   1. 重新启动后，启动 Microsoft Store，搜索 Ubuntu，然后安装首选版本（例如 Ubuntu 22.04 LTS）。
   2. 从 “开始” 菜单启动 Ubuntu。
   3. 出现提示时创建新的 UNIX 用户名和密码。
   4. 更新包列表：sudo apt update &; sudo apt upgrade -y。
4. macOS 用户
   1. 安装 Homebrew （如果尚未安装）：/bin/bash -c “$（curl -fsSL https://raw.githubusercontent.com/Homebrew/install/HEAD/install.sh）”。
   2. 安装所需的包：brew install git wget
5. 安装 Conda 或 Mamba
   1. 访问 Miniconda 下载页面以下载适用于作系统的正确安装程序。
   2. 要安装 Miniconda，请运行安装程序并按照屏幕上的说明进行作。安装完成后，请重新启动终端。
   3. 配置 Conda 通道：
      conda config --add channels 默认值
      conda config --add channels bioconda
      conda 配置 --add channels conda-forge
   4. 安装 Mambaforge （Mamba）
      对于 Linux：
      WGET
      https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-Linux-x86_64.sh
      对于 macOS：
      wget https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-MacOSX-arm64.sh
   5. 安装 Mambaforge：bash Mambaforge-*.sh
   6. 按照提示完成安装，然后重新启动终端以激活 Mamba。
6. 设置 ONT-TB-NF 管道
   1. 创建新的 Conda 环境： conda create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda
   2. 或者，使用 Mamba：mamba create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda
   3. 激活环境：conda activate ont_tb_env
   4. 安装 Nextflow：curl -s https://get.nextflow.io |bash， sudo mv nextflow /usr/local/bin/
   5. 克隆 ONT-TB-NF 仓库：git clone https://github.com/HKU-BAL/ONT-TB-NF.git
      cd ONT-TB-NF
   6. 拉取所需的 Docker 镜像（如果使用 Docker）
      docker pull hkubal/clair3：v0.1-r12
      docker pull quay.io/biocontainers/tb-profiler:4.3.0--pypyh5e36f6f_0
7. 运行管道
   1. 使用以下命令独立连接每个样本的 Basecalled FASTQ 文件。
      猫*.fastq.gz > concatenated.fastq.gz
      nextflow 运行 run_tb_amplicon.nf \
      read_fq /路径/到/concatenated.fastq.gz \
      sample_name SAMPLE_ID \
      amplicon_bed /path/to/amplicon_regions.bed \
      螺纹 16 \
      output_dir /绝对/路径/到/output_directory
8. 输出文件和解释
   1. 成功执行后，确保管道在指定的输出目录中生成以下输出：
      1. 对齐读取：*.bam 文件。
      2. 变体调用：*.vcf 包含 SNP 和插入缺失的文件。
      3. 摘要报告：*.csv 或 *.tsv 文件，总结耐药性突变和其他相关指标。
      4. 质量控制报告：由 MultiQC 等工具生成的 *.htmL 文件。
      5. 日志：管道执行的详细日志。
      6. 中间文件：存储在 work/ 目录下（运行成功后可删除）。
         注意：如果遇到权限错误，必须验证一个人是否拥有读取和写入文件以及执行脚本所需的权限。关于环境问题，请确保在执行管道之前激活了适当的 Conda 环境。对于那些使用 Docker 配置文件的用户，必须确认 Docker 已安装并可运行。此外，必须仔细监控系统资源，以避免执行过程中出现任何内存或存储限制。 图 1 概述了这些方法。

结果

选择所选的 DNA 提取方法是因为与其他快速技术相比，其效率和产量更高。它始终如一地生产高质量的基因组 DNA （gDNA），并且集成了基于磁珠的纯化步骤有助于最大限度地缩短处理时间，同时降低每个样品的成本。这是通过消除对分光光度测量等额外质量控制评估的需求来实现的，荧光法是唯一的 DNA 定量工具。发现PCR后浓度在短读长和长读长平台上都是测序的最佳（表2）。通过琼脂糖凝胶电泳的片段分析进一步确认扩增子的完整性（图2）。然而，由于扩增子浓度不足，分离株 89 和 136 被排除在长读长测序之外，如表 2 和图 2 所示。

在长读长平台上从DNA提取到结果生成的完整工作流程在36小时内完成，不包括中断，并被证明与短读长测序所需的周转时间兼容（表3...

讨论

长读长测序平台在这项研究中显示出显着的优势，特别是其能够实现快速测序和始终如一的高覆盖广度。在所有成功测序的分离株中，覆盖广度达到 99.9%，表明耐药性相关基因组区域几乎完全表示。所有靶基因的平均覆盖深度为4462X，其中eis基因的覆盖深度最高，为22,242.08X，rrs基因最低，为99.46X。这些值反映了平台为可靠的耐药性预测生成足够数据的能力⁴。

从DNA提取到结果生成的工作流程在36小时内完成，不包括中断，并且与短读长测序的周转时间兼容^4,23。这种简化的过程，加上通过量子比特使用单个定量步骤和最少的质量控制检查，有助于减少手动作时间和每个样品的潜在成本²³。然而，该工作流程的效率取决于关键步骤，例如高质量的DNA提取和精确的文库制备<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15毫升及1.5 mL或2 mL Lo结合管	埃彭多夫	EP0030108051-250EA
1kb 梯形图	赛莫飞世尔科学	SM0311
2毫升螺旋帽管	科学专业公司	P2TUB056C-0001.5ST
2毫米无菌玻璃珠	西格玛-奥尔德里奇	Z273627-1EA
AMPure XP珠	贝克曼·科尔特	A63881
Deeplex Myc-TB	基因屏	20090205
电泳室	赛莫飞世尔科学	A25977
乙醇，纯净	西格玛-奥尔德里奇	E7023-500ML
FastPrep 均质器	MP生物医学	116005500
滤器移液器头（10号和微型;L）	生物智能科学	FT-10-R
滤液移液器头（1000 & micro;L）	生物智能科学	FT-1000-R
滤器移液器头（20 & micro;L）	生物智能科学	FT-20-R
滤水器移液器头（200 & micro;L）	生物智能科学	FT-200-R
Flow-cell	牛津纳米孔技术	弗洛-明尼苏达114
加热块	埃彭多夫	5382000031
InstaGene矩阵	生物辐射	BBRD7326030
磁性机架与nbsp;	赛莫飞世尔科学公司;	12321D
微离心机	埃彭多夫	5406000046
走狗	牛津纳米孔技术	MK1B
本地条码套件 V14	牛津纳米孔技术	SQK-NBD114.24
NEB Blunt/TA Ligase 母带混音	NEB	M0367
NEBNext快速连接模块	NEB	E6056
NEBNext Ultra II 终极修复/dA尾部模块	NEB	E7546
无核酸酶水（NFW）	赛莫飞世尔科学	AM9937
移液器（P10、P20、P200和P1000）	埃彭多夫	EP3123000918-1EA
量子比特测验管	赛莫飞世尔科学	Q32856
Qubit dsDNA HS 检测套件	赛莫飞世尔科学	Q33231
量子比特荧光仪	赛莫飞世尔科学	Q33226
SYBR 安全DNA凝胶菌株	赛莫飞世尔科学	S33102
超纯琼脂糖	赛莫飞世尔科学	17852
通用Hood III透光器（分子成像凝胶Doc XR系统）	生物辐射	170-8170
涡旋混合器	拉塞克	WMBB0L0E0216